Клеточные культуры в гематологии

23

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ УКРАИНЫ

ЛУБЕНСКОЕ МЕДИЦИНСКОЕ УЧИЛИЩЕ

Реферат

по Гематологии

на тему: Клеточные культуры в гематологии

Лубны 2009

Кроветворные клетки животных и человека начали культиви-ровать в конце XIX--начале XX в. (Скворцов И. П., 1885; Arnold, 1887; Maximov A A., 1927).

Под культурой клеток понимают совокупность жизнеспособ-ных клеточных элементов, полученных в результате их выращива-ния и сохранения при определенных условиях вне организма хозя-ина. Для культивирования клеток и тканей, а также поддержания их жизнедеятельности применяют различные культуральные сис-темы. Культуральные системы с использованием сред на гелевой основе (агар, метилцеллюлоза, коллаген), в отличие от жидких культур, ограничивают способность имплантированных в среду клеток к движению, фиксируют их в одном месте, не позволяя «расползаться» в процессе деления материнской клетки. Таким образом, клетки, способные пролиферировать, образуют в полу-твердых и вязких средах дискретные колонии - клеточные агрега-ты, представляющие из себя клон, т. е. потомство одной делящейся клетки, состоящее из однотипных клеточных элементов, которые можно анализировать. Поэтому методы культивирования клеток в полутвердых и вязких средах, а также колониеобразование в усло-виях in vivo, называют методами клонирования.

Изучение кроветворных клеток и клеток стромы костного мозга с использованием методов клонирования относится к 70-м годам прошлого столетия. С этого времени, благодаря работам J. E. Till, Е. A. McCulloch (1961), а также исследованиям A. J. Friedenstein и соавторов (1968), Т. R. Bradley, D. Metcalf( 1966) и других исследо-вателей, методы клонирования кроветворных и стромальных кле-ток заняли прочное место среди других функциональных методов изучения системы крови. Клонирование кроветворных клеток от-крыло новые огромные возможности для понимания процессов кроветворения. Благодаря этому удалось доказать клоногенный характер стволовых кроветворных клеток (СКК), т. е. происхожде-ние клона однотипных клеток из одной исходной клетки.

Выявление клонов, содержащих клетки двух и более клеточных типов (смешанные колонии), доказало полипотентность СКК, то есть способность их к развитию в направлении всех кроветворных ростков. Разработка воспроизводимых методов клеточных куль-тур для различных типов гемопоэтических клеток-предшествен-ников послужила мощным импульсом для изучения нормального и патологического кроветворения. Культуральные методы, позво-лившие изучать гемоноэз ex vivo, оказались очень полезными для исследования СКК, коммитированных (направленных к диффе-ренцировке) клеток-предшественников (ККП) и их потомства, а также для различных манипуляций с гемопоэтическими клетками в культуре, изучения экспрессируемых ими медиаторов кроветво-рения - цитокинов, влияния на эти клетки различных экзо- и эндогенных факторов, таких как радиация, медикаментозные сред-ства и различные гуморальные и физические факторы.

Методы клонирования клеток позволили оценить величину пула СКК в костном мозге, охарактеризовать потомство этих клеток, объединенных в клоны, выявить промежуточные этапы их диффе-ренцировки от мультипотентной СКК через стадии коммитиро-ванных поли- и моноолигоиотентных клеток-предшественников различных клеточных линий до уровня морфологически распо-знаваемых в световом микроскопе бластных клеток костного моз-га, а также доказать клоногенные свойства стволовых клеток и клеток-предшественников стромы костного мозга. Поли- и моно-олигопотентные клетки-предшественники способны дифференци-роваться в направлении 2-5 кроветворных линий. Клетки, дающие рост колоний в условиях вне организма, называют колониеобразу-ющими единицами (КОЕ). Например КОЕ, образующие в агаре, метилцеллюлозе или селезенке облученного животного смешан-ные колонии из гранулоцитов, эритрокариоцитов, макрофагов и мегакариоцитов, называют КОЕ-ГЭММ и т. д.

Результаты этих исследований, ставшие возможными благода-ря внедрению методов клонирования, изучение кинетики гемопоэ-тических клеток, открытие явления апоптоза - запрограммиро-ванной клеточной смерти - оказались чрезвычайно важными для понимания механизма гомеостаза - равновесия внутренней среды организма и сбалансированности всего процесса кроветворения.

Сегодня значение культуральных исследований гемопоэтических клеток для науки и практической медицины трудно переоценить.

В то же время необходимо решать многие проблемы, связанные с особенностями культуральных методик, в частности, с вариабель-ностью роста и качеством колоний в зависимости от типа культу-ральной системы, количества и концентрации различных компонен-тов культуральных сред, применяемых в различных лабораториях. Стандартизация и оптимизация культуральных сред и условий культивирования призваны уменьшить возможные ошибки и по-высить адекватность и информативность этих методов. Среди не-обходимых условий культивирования нужно отметить прежде все-го использование качественных культуральных сред, содержащих необходимые колониестимулирующие факторы (КСФ), а также температурные условия, влажность, газовую среду и т. д. Наруше-ние условий культивирования приводит к снижению эффективно-сти клонирования и изменению качества и морфологического со-става клеточных агрегатов в культуре.

Методы культивирования клеток

По способу культивирования клеток различают культуры ех vivo - вне организма и in vivo - в организме. Для выращивания клеток ex vivo применяют различные культуральные системы и среды. Культуралыгая среда призвана обеспечить оптимальный ре-жим жизнедеятельности клеток и тканей. Среды для культивиро-вания делят на естестественные (сыворотка, плазменный сгусток и др.) и синтетические (среды Игла, МакКоя, Пскова и их модифи-кации - D-MEM, IMDM, RPMI и многие другие). Хорошо зареко-мендовали себя среды IMDM (среда Дульбекко, модифицирован-ная Исковым), среды с метилцеллюлозой (Methylcellulose Culture Medium), «полные» среды с эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС), эритропоэтином (ЭРП) и всеми необходимыми для роста СКК и коммитированных клеток-предшественников ростовыми факторами, а также «неполные» - без ЭРП, или ЭТС, или каких-либо цитокинов. Культуральные среды предназначаются для под-держания жизнедеятельности непролиферирующих соматических клеток (поддерживающие среды) или для обеспечения процессов пролиферации и дифференциации клеток (ростовые среды с рос-товыми факторами).

Культуральные среды могут быть жидкими, вязкими, полутвер-дыми и твердыми. Синтетические среды состоят из воды, солевых растворов, буферных систем, витаминов, аминокислот, ростовых факторов и т. д. Составной частью многих сред являются сыворот-ки: крови человека, эмбриональная телячья, бычья, лошадиная, свиная, новорожденных телят и ягнят, сыворотка плаценты здоро-вых рожениц (Афанасьев Б. В., Алмазов В. А, 1985; Гольдберг Е. Д. и др., 1992). Культуры могут быть краткосрочными (4-24 часа). 8-14-дневными и длительными (5-8 недель и более), в зависимости от поставленных задач.

По характеру базового субстрата культуральные системы де-лятся на: 1) суспензионные, где клетки находятся в жидкой пита-тельной среде в разобщенном состоянии; 2) на основе плазменного сгустка; 3) на основе полутвердых агаровых или коллагеновых сред; 4) на основе вязких сред - метилцеллюлозы. Кроме того, клональ-ный рост стволовых кроветворных клеток и коммитированных кле-ток-предшественников изучают in vivo, например, в селезенке смер-тельно облученных мышей или в диффузионных камерах с агаром или плазменным сгустком, имплантированные облученным жи-вотным интраперитонеально или под капсулу почки, а также в длительных культурах на стромальной подложке. Основным усло-вием для получения колоний, образованных различными гемопоэ-тическими предшественниками, является присутствие в культуре необходимых колониестимулирующих факторов (факторов роста клеток).

Метод селезеночных колоний (Till J. E, McCulloch E. A, 19G1) заключается в том, что внутривенно вводят костномозговую кле-точную взвесь смертельно облученной мыши, собственный гемо-позз которой тотально подавлен, после чего в ее селезенке образу-ются макроскопически видимые скопления кроветворных клеток, каждое из которых является клоном, т. е. представляет собою по-томство одной клетки - колониеобразующей единицы селезенки (КОЕс). Среди них наблюдаются колонии, состоящие из однотип-ных клеток (гранулоцитов, макрофагов, эозинофил'ов, эритроидных клеток и др.), и смешанные колонии, включающие представителей двух и более клеточных линий. Так был доказан клоногенный характер КОЕс и их полипотентность - способность развиваться в направлении нескольких клеточных линий. При переносе отдель-ных клеток из этих колоний в новую культуральную систему сно-ва получали дискретные колонии из однотипных клеток или сме-шанные колонии, что говорит о способности этих клеток к само-поддержанию. Полагают, что в селезенке облученных животных клональные свойства проявляют СКК с ограниченной способно-стью к самоподдержанию, а также их потомки - коммитирован-ные клетки-предшественники клеточных линий (коммитирова-ние - необратимая направленность стволовой клетки к диффе-ренцировке).

Различные культурадьные системы обладают различной «раз-решающей» способностью для клонирования клеток. Простые ага-ровые системы, в которых источником КСФ для клоногенных кле-ток служат лейкоциты донорской крови, обеспечивают клональ-ный рост только моно- и бнпотентных КОЕ, или КОЕк - коло-ниеобразующих единиц в культуре, где они формируют локализо-ванные клеточные агрегаты - колонии, которые могут быть иден-тифицированы и анализированы под обычным световым микро-скопом. Среди них различают КОЕ-Г (гранулоцитарные), КОЕ-М (моноцитарно-макрофагальные), КОЕ-Эоз (эозинофильные), КОЕ-ГМ (гранулоцито-макрофагальные) и др. Более сложные культуральные системы, оптимизированные кондиционированны-ми средами (КС) или различными КСФ, обеспечивают клональ-ный рост не только уни- и бипотентных клеток-предшественни-ков, но и КОЕ-ГЭММ.

Для культивирования клеток используют стерильные пласти-ковые или стеклянные чашки Петри, флаконы Карреля, Эрла и др.

Культивирование производят либо в инкубационных камерах при +37 °С, с постоянной газовой атмосферой (кислорода - 5%, углекислого газа - 10% и азота - 85%) и 100% влажностью, либо в термостате при +37 °С, в герметически закрытых стеклянных эк-сикаторах или пластиковых контейнерах, где также поддерживает-ся необходимая влажность и газовая атмосфера.

Для достижения эффекта клонирования в культуральную среду должны быть внесены стимуляторы роста клеток (специфические ростовые факторы). Характер и количество ростовых факторов зависят от типа культуралыгой системы и поставленных задач.

Клетки-предшественники грануломоноцитопоэза (КОЕ-ГМ)

Полутвердые агаровые среды используют в одно- и двухслойных агаровых культурах для выращивания и поддержания жизнедея-тельности моноцитарно-макрофагальных, гранулоцитарных, гра-нулоцито-макрофагальных и других миелоидных клеток-предше-ственников. Агар, получаемый из морских водорослей, образует гелевый субстрат, позволяющий клонировать клетки. Используют такие образцы агара, как бактоагар Difco (США), агар-агар, бакто-агар Serva (Германия) и др.

В 1966 г. Т. R. Bradley и D. Metcalf в двуслойной агаровой систе-ме культивировали костный мозг мыши и получили рост грануло-цито-макрофагальных колоний. В 1970 г. В. L. Pike и W. A Robinson использовали двуслойную агаровую среду для культивирования человеческих кроветворных клеток. При данном методе в чашку Петри помещают 0,5%-ный расплавленный агар с донорскими лей-коцитами (источник КСФ) и после застывания на него наслаива-ют верхний слой 0,3%-ного агара с тестируемыми клетками в коли-честве 1,0-1,5 х 10'миелокариоцитов. Таким образом, нижний слой служит питательной средой для клеток верхнего слоя.

Колониестимулирующим фактором для гранулоцитов и макро-фагов в этой системе является КСФ, продуцируемый моноцитами и макрофагами донорской крови. Чашки Петри помещают в термо-стат при описанных выше условиях на 7-8 дней. По истечении этого срока оценивают количество выросших клеточных агрега-тов-колоний и кластеров в световом микроскопе. За кластер при-нимают клеточные агрегаты, содержащие от 3 до 40-50 клеток. Агрегаты в составе 40-50 и более клеток оцениваются как коло-нии. Количество гранулоцитарных, моноцитарно-макрофагальных и гранулоцито-моноцитарных колоний в норме колеблется от 8 до 150 на 1 х 10⁵ миелокариоцитов - в среднем около 30, количество кластеров - от 10 до 340 на 1 х 10⁵ миелокариоцитов - в среднем около 70 (Афанасьев Б. В. и др., 1980; Балашова В. А, 1985; Entriii-ger M. A et al, 1977). Соотношение кластер/колония в норме ко-леблется в среднем от 2 до 5 и не превышает 12 (Metcalf D. et al, 1979). Эта культуральная система пригодна для клонирования КОЕ-Г, КОЕ-М и КОЕ-ГМ. В культуре доказана их высокая чув-ствительность к радиации, воздействию химиопрепаратов и таких физических факторов, как излучение лазера, УФО, магнитные из-лучения, соединения перфторуглеродов и т. д. (Балашова В. А. и др., 1988; Абдулкадыров К. М. и др., 1992, 1995).

Культивирование гемопоэтических клеток в системе «агаровая капля-жидкая среда»

Эта система предложена Б. В. Афанасьевым в 1983 г. и пред-назначена главным образом для клонирования КОЕ-Г, КОЕ-М и КОЕ-ГМ. В отличие от системы Пайка и Робинсона она не содер-жит нижнего агарового слоя. Вместо верхнего слоя агара использу-ется агаровая капля - гель. Тестируемые клетки имплантируют в 0,3%-ный агар (Difco, США) в количестве 1,0-1,5 х 10⁵ миелока-риоцитов на 0,5 мл агаровой среды, включающей также ЭТС и питательную среду типа D-MEM, IMDM и др. С помощью шприца и тупоконечной иглы жидкий агар с клетками размещается на дне чашки Петри, где и застывает в форме капли-геля. После застыва-ния капли в чашку наливают 2,5 мл питательной среды с донорски-ми лейкоцитами в концентрации 1 х 10⁶ клеток на 1 мл жидкой среды (фидер). В состав среды входят также ЭТС и антибиотики. Фидер служит источником гранулоцитарно-моноцитарного КСФ, основным продуцентом которого являются моноциты донорской крови. Эффективность клонирования возрастает при внесении в жидкую фазу системы специальной среды, кондиционированной стимулированными ФГА (фитогемагглютинин) монойуклеарны-ми лейкоцитами периферической крови, или добавлении коктейля из рекомбинантных цитокинов (McNiece I. К. et al., 1991; Bern-stein I. D. et al., 1991; Atlas of Human Hematopoietic Colonies, 1995). В таких системах растут не только КОЕ-ГМ, но и КОЕ-ГЭММ, и КОЕ-Бл (бластные колонии). Преимуществом системы «агаровая капля-жидкая среда» является способность поддерживать кло-нальную пролиферацию не только нормальных, но и лейкозных клеток (Афанасьев Б. В., Алмазов В. А, 1985). Система также бо-лее оптимальна для межклеточных взаимодействий тестируемых клеток с клетками фидера (лейкоцитами донора) и позволяет из-учать влияние на КОЕ-ГМ различных веществ, препаратов и фи-зических факторов.

Клонирование клеток-предшественников эритропоэза и мегакариоцитопоэза (БОЕЭ, КОЕЭ, БОЕ- Мгщ КОЕ- Мгкц)

Для клонирования клеток-предшественников эритропоэза (КПЭр) используют различные культуральные системы, но глав-ным образом системы с применением плазменного сгустка, агара или метилцеллюлозы. Получение максимально обогащенной клет-ками-предшественниками эритропоэза клеточной взвеси достаточ-но трудоемко и состоит из нескольких этапов, одним из которых является осаждение клеток в градиентах плотности (Stephenson I. R. et al, 1971; Tepperman A. D. et al, 1974). Культивирование КПЭр в агаровых культурах практически не отличается от культивирова-ния КОЕ-ГМ, однако при клонировании эритроидных предше-ственников необходимо внесение в культуру главного регулятора эритропоэза - эритропоэтина (ЭРП) и некоторых кондиционных сред (бурстстимулирующей активности - БСА), полученных в результате стимулирования ФГА клеток селезенки или лейкоци-тов (ФГА-ЛКС). Более ранние примитивные предшественники эритропоэза называют бурстобразующие («бурст» - взрыв) еди-ницы эритропоэза (БОЕ-Э). Они формируют в метилцеллюлозе, оптимизированной кондиционированными средами и/или росто-выми факторами, большие агрегаты из 16 и более кластеров и со-держат до 10⁴ клеток. Более зрелые БОЕ-Э образуют малые бур-сты из 3-8 кластеров и могут содержать 200-500 гемоглобинизированных эритроидных клеток. КОЕ-Э (колониеобразующие еди-ницы эритропоэза) образую! агрегаты, содержащие 100-200 эри-трокариоцитов (Eaves С. I, Eaves А. С, 1978; McNiece et al, 1991). Для идентификации клеток в эритроидных колониях и бурстах используют также пероксидазную окраску с бензидином (Гольд-берг Е. Д. и др., 1992), производят оценку колоний по способности клеток утилизировать железо (59Fe) или проводят иммунофено-типирование для выявления маркера эритроидных клеток - гли-кофорнна А

Для клонирования клеток-предшественников мегакариоцито-поэза (БОЕ-Мгкц и КОЕ-Мгкц) используют различные культу-ральные системы: культивирование в агаре, плазменном сгустке, на коллагене и агарозе. Разработана система с использованием сво-бодной от ЭТС среды, так как ЭТС, содержащая TGF-p и обычно используемая в системах для клонирования эритроидных и грану-лоцитарно-моноцитарных клеток-предшественников, ингибирует рост мегакариоцитов (Kaushansky К.,1995; Bertolini F. et al, 1997). Рекомбинантные цитокины, особенно тромбопоэтин, а также IL3 и IL6, позволяют оптимизировать условия для пролиферации и диф-ференциации КОЕ-Мгкц. Кроме того, использование гелевых по-лутвердых сред па коллагене (среда Mega-Cult) позволяет кло-нальному потомству одной клетки оставаться вместе для образо-вания колоний. Коллаген, как считают, удобен и предпочтителен для формирования стабильного гелевого матрикса, который под-держивает рост и развитие КОЕ-Мгкц и позволяет in situ произво-дить иммуногистохимическую окраску колоний с использованием антител против CD41 (маркера мегакариоцитов) после дегидрата-ции геля. При окраске на кислую фосфатазу мегакариоциты окра-шиваются в розовый цвет, а их ядра - в голубой.

Мегакариоцитарные колонии должны содержать от 4 до 50 кле-ток. Выделяют три типа колоний: I - колонии из 4-30 зрелых мегакариоцитов; II - колонии из более чем 30 клеток мегакарио-цитарного ростка; III - колонии из мононуклеаров, экспрессирую-щих маркеры мегакариоцитов и дифференцирующиеся позже в мегакариоциты (Гольдберг Е. Д. и др., 1992).

Клонирование полипотентных коммитированных предшественников в агаре и метилцеллюлозе

В полутвердой агаровой и вязкой метилцеллюлозной средах в присутствии кондиционированных сред (КС) и ЭРП происходит рост смешанных колоний - КОЕ-ГЭММ, КОЕ-ГЭМ, КОЕ-ГММ, КОЕ-ГМ, КОЕ-ГЭ, КОЕ-ЭМ (Колесникова А. И., Смирнов А. Н, 2002; Johnson G. R, Metcalf D., 1977; Fauser A. A, Messner H. A, 1979). Разработаны высокоэффективные «полные» среды IMDM на метилцеллюлозе с коктейлем из рекомбинантных цитокинов. Компоненты этих сред поддерживают рост в культуре СКК и обес-печивают рост мультилинейных колоний (КОЕ-ГЭММ), эритро-идных колоний (БОЕ-Э, КОЕ-Э), грануломоноцитарных (КОЕТМ) и др. (Bernstein I. D. et al, 1991). «Полная» среда может включать кроме метилцеллюлозы с IMDM эмбриональную телячью сыво-ротку, бычий сывороточный альбумин, 2-меркаптоэтанол, L-глю-тамин, ростовый фактор стволовых клеток (ФСК), ГМ-КСФ, ИЛ-3, ИЛ-6, Г-КСФ и ЭРП. В таких системах СКК способны в течение 2-3 недель образовывать очень большие (>10³ клеток) колонии, состоящие только из бластов. Перенесенные в свежую среду блас-ты генерируют дочерние бластные колонии, демонстрируя способ-ность к самоподдержанию. Оптимизировать рост бластных коло-ний, в состав которых входят СКК, можно, используя взвесь кост-номозговых клеток, обогащенных субпопуляциями СВ34*-клеток, являющихся ранними предшественниками гемопоэтических клеток.

Длительные клеточные культуры

Эти культуры растут на подложке - выращенном слое стро-мальных клеток - фибробластов, адипоцитов, макрофагов, эндо-телиальных клеток (Чертков И. Л., Гуревич О. А, 1984; Dexter Т. М. et al, 1977). Клетки в этих культурах можно многократно пере-севать, они выдерживают несколько пассажей и не теряют поли-потентности (Moore M. A S. etal, 1978; Petzer A L. etal., 1996). Это происходит благодаря контакту кроветворных тестируемых кле-ток со стромальными клетками подложки, питающими их. В дли-тельных культурах кроме уни- и бипотентных КОЕ достигается рост ранних гранулоцитарных, эритроидных и мегакариоцитарных клеток-предшественников уровня КОЕ-ГЭММ, КОЕс, КОЕ-Бл, КООБ, а также Т-лимфоцитов (Дерюгина Е. И. и др., 1990; Fanning S. F et al, 1993). КООБ - клетки, образующие области «булыжника», были названы так потому, что клеточные элементы в них тесно прилегают друг к другу. Каждая КООБ является кло-ном, состоящим из бластов, среди которых находятся и СКК. Кро-ме того, в длительных культурах на стромальной подложке выяв-лено большое количество мезенхимальных полипотентных кле-ток, которые, как известно, являются предшественниками не только клеток стромы, но и при определенных условиях могут трансфор-мироваться в гемопоэтические клетки (Friedenstein A J. et al.,1968; Репин В. С, 2001; Сухих Г. Т. и др., 2002; Seshi В. et al. 2000).

Длительные клеточные культуры, оптимизированные жидкой средой типа MyeloCult (Myeloid Long-term Culture Medium) (Ка-нада), в присутствии рекомбинантных цитокинов позволяют: 1) создать слой стромальных клеток для поддержания примитив-ных гемопоэтических клеток; 2) охарактеризовать ростовые фак-торы, ингибиторы и молекулы адгезии, продуцируемые стромаль-ными клетками; 3) проанализировать факторы, влияющие на нор-мальные и лейкемические клетки на модели костномозгового микроокружения ex vivo; 4) исследовать клетки, индуцирующие длительную культуру; 5) нарастить популяцию гемопоэтических клеток.

При исходной плотности костномозговых клеток более 10^ь на 1 мл в длительной культуре сначала образуется «прилипающий» слой мезенхимальных стромальных клеток. Примитивные гемопо-этические клетки при наличии соответствующей среды и добавок, условий инкубирования и графика питания, в течение многих не-дель взаимодействуя со стромальной подложкой, образуют миело-идные клоногенные предшественники и зрелые гранулоциты. Жид-кую среду MyeloCult при добавлении кондиционированных сред или рекомбинированных цитокинов также можно использовать для наращивания массы гемопоэтических предшественников в сво-бодной от стромы суспензионной культуре.

Методы клонирования гемопоэтических клеток при гематологических заболеваниях

Разработка и внедрение методов клонирования кроветворных клеток открыли новые возможности для понимания природы лейкозной стволовой клетки, уровня ее поражения лейкозоген-ными факторами, патогенеза лейкозов (Чертков И. Л., Фриден-штейн А Я., 1966; Афанасьев Б. В., Алмазов В. А, 1985). Культу-ральные системы обеспечивают клональный рост костномозговых клеток и делают возможным изучение процессов пролиферации и этапов дифференцировки клеток-предшественников и их потом-ков в условиях ex vivo. При культивировании клеток крови и кост-ного мозга клоногенные свойства могут проявлять как лейкозные, так и нормальные клетки. D. Metcalf (1984) справедливо отметил, что говорить с уверенностью о принадлежности колониеобразую-щих клеток в культуре к лейкозному клону можно только при проведении кариологических, иммунофенотипических и других ис-следований клеток каждой отдельной колонии. Сегодня такой ана-лиз стал возможным.

Колониеобразующая способность (КОС) клеток-предшественников гранулоионоцитопоэза при острых лейкозах

Результаты многочисленных исследований лейкозных клеток в культуре свидетельствуют о том, что при острых нелимфобласт-ных лейкозах (ОНЛЛ) в острой фазе заболевания клоногенные свойства нормальных КОЕк чаще всего угнетены и имеет место патологическое колониеобразование лейкозными клетками-пред-шественниками (Афанасьев Б. В., Алмазов В.. А, 1985; Bull I. M. et al, 1973; Moore M. A. S. et al, 1974). При острых лейкозах наблю-дается угнетение нормального гемопоэза и замещение нормальной гемопоэтической ткани лейкозными клетками. В то же время при клонировании клеток костного мозга больных малопроцентным лейкозом было показано, что развитие панцитопении у них связа-но не только с вытеснением нормальных клеток, по и с высвобож-дением из лейкозных клеток кислых изоферритинов, ингибирую-щих рост нормальных гемопоэтических клеток. Эксперименталь-но было доказано, что рекомбинантный изоферритин ингибирует рост в культуре СКК и ККП (Cassileth P. А. 1984; Broxmeyer H. Е. et al, 1981, 1982), а развитие колоний из нормальных КОЕк подав-ляется при добавлении в культуральную среду лейкозных клеток (Spitzer G. et al., 1978; Broxmeyer H. E. et al, 1987; Olofsson Т., Olsson I., 1980). Кроме того, известно, что лейкозные клетки при ОНЛЛ более чувствительны к низким дозам колониестимулирую-щего фактора (КСФ), чем нормальные. Возможно, это является одной из причин преимущественного роста лейкозных клеток in situ по сравнению с нормальными клетками, учитывая, что при острых лейкозах, по данным некоторых авторов, клетки крови не вырабатывают достаточного количества КСФ (Takaku E, 1982; Metcalf D., 1984) и при снижениии уровня КСФ может возникать «старение» нормальных клоногенных клеток (Senn I. S. et al., 1974). Пролиферативное преимущество лейкозных клеток подтвержда-ется высоким уровнем «тимидинового самоубийства» клеток при ОЛ, в отличие от нормальных клеток.

При ОНЛЛ в большинстве случаев КОС и КЛОС (кластерооб-разующая способность) клоногенных миелоидных предшествен-ников в агаровых культурах отсутствует или при резком снижении КОС наблюдается повышенное кластерообразование (лейкемиче-ский тип роста) (Афанасьев Б.В., 1980; Мур М. А. С, Меткалф Д., 1973). Колонии и кластеры могут состоять из незрелых миелоид-ных клеток - про- и миелоцитов или из одних миелобластов (Spit-zer G. et al., 1978).

G. Spitzer с соавторами (1978) выделили три типа колониеобра-зования при острых лейкозах:

Отсутствие роста колоний и кластеров либо наличие отдель-ных колоний с нормальной морфологией клеток.

Множество мелких кластеров (до 20 клеток).

Агрегаты лейкозного типа с числом клеток более 20. У боль-ных 3-й группы реже достигалась ремиссия, которая была менее продолжительной, чаще развивалась резидуальная болезнь. Авто-ры сделали вывод, что характер колониеобразования может слу-жить прогностическим признаком при лейкозе.

Б. В. Афанасьев (1980) предложил следующие типы роста КОЕк в агаровой культуре.

Нормальный тип роста - КОС от 8 до 67 колоний на 1 х 10¹ ядросодержащих клеток. Соотношение кластер: колония менее 12.

Гипопластический тип роста - КОС менее нижней границы нормы (от 0 до 7), а КлОС - менее 84.

Гиперпластический рост - КОС более верхней границы нор-мы (>67), соотношение кластер : колония не превышает 12.

Лейкемический рост - КОС от 0 до 7, КлОС превышает 84, соотношение кластер : колония более 12.

Главным критерием для установления лейкемического типа ро-ста является резкое увеличение соотношения кластер/колония. М. A S. Moore и соавторы (1974) отмечали наиболее высокую спо-собность к образованию кластеров при остром промиелоцитарном лейкозе. Это подтверждают данные М. А. Френкель и соавторов (1994) и наши наблюдения.

Плохим прогностическим признаком считается отсутствие рос-та клеток в культуре или повышенное образование крупных клас-теров (Moore M. A S. et al, 1976), хотя есть и прямо противопо-ложные сообщения.

Отмечены высокая частота ремиссий у больных с нормальным типом роста в культуре (Moore M. A S. et al., 1974) и плохой про-гноз у больных с лейкемическим типом роста в сочетании с высо-кой клонирующей эффективностью (Алмазов В. А. и др. 1981; Афа-насьев Б. В., Алмазов В. А, 1985). После проведения химиотера-пии рост колоний и кластеров, как правило, отсутствует.

В период ремиссии часто происходит восстановление нормаль-ного типа колонне- и кластерообразования (Bodey L. P., Rodri-guez V., 1978), а цитогенетические исследования подтверждают про-исхождение клеток из нормальных предшественников. Показате-ли КОС являются ранним прогностическим признаком реакции на химиотерапию, гак как часто ее восстановление происходит раньше, чем восстанавливается нормальная морфологическая картина костного мозга (Moore М. А. S., 1976; Spitzer G. et al, 1977). Норма-лизация КОС и КлОС - достоверный признак, указывающий на близкую ремиссию.

В то же время С. В. Miller и В. A. Zehnbaucer (1991) выявили у части больных ОМЛ, обследованных ими в период полной ремис-сии, характерный лейкемический рост КОЕ-ГМ. Мы ни разу не отмечали этого, но, по нашим наблюдениям, отсутствие какого бы то ни было роста в культуре в период ремиссии не редкость.

Острый лимфобластный лейкоз чаще всего характеризуется от-сутствием роста в агаровых системах, приспособленных для КОЕ-ГМ, или наличием небольшого числа мелких кластеров и колоний в костном мозге и повышенным колонне- и кластерообразованием в крови.

При использовании культуральных систем с метилцеллюлозой, средой IMDM и рекомбинантными цитокинами при остром лейко-зе наблюдается отсутствие роста нормальных КОЕ-Э, БОЕ-Э, КОЕ-ГМ и КОЕ-ГЭММ. В то же время, как и в агаровых культу-рах, нередко присутствие большого количества мелких кластеров из бластных клеток. При наступлении ремиссии происходит сни-жение (до исчезновения) числа бластных кластеров и появляются нормальные эритроидные и миелоидные колонии (Atlas of Human Hematopoietic Colonies, 1995). Рецидив ОНЛЛ часто характеризу-ется появлением большого количества мелких кластеров. Проис-ходит возвращение к колониеобразованию лейкозного типа, но в этот период наблюдается очень пестрая картина, так как в костном мозге одновременно персистирует колониеобразование за счет нор-мальных КОЕк (Spitzer G. et al., 1976). Резкое снижение КОС костного мозга обнаруживают уже за 2-8 недель до развертывания рецидива (Greenberg P. L. et al, 1971).

С. В. Miller и В. A Zehnbaucer (1991) на примере больных ОНЛЛ, у которых была выполнена аутологичная ТКМ, показали, что ве-роятность развития рецидива острого лейкоза существенно выше у тех из них, у кого был выявлен лейкемический тип роста колоний в культуре.

Колониеобразующая способность КОЕ-ГМ при хронических миелопролиферативных заболеваниях

При хроническом миелолейкозе (ХМЛ) поражение происходит на уровне полипотентной стволовой клетки, что, в частности, подтверждается фактом нахождения Ph'-хромосомы во всех миелоидных клетках и в некоторых популяциях В-лимфоцитов (Bernheim A, Berger R, 1981). Хронический миелолейкоз до разви-тия бластного криза (БК) характеризуется гиперпластическим ти-пом роста в агаре КОЕк, костного мозга и особенно крови (Забели-на Т. С. и др., 1980; Френкель М. А. и др., 1982).

Гиперплазия пула КОЕк и КЛОЕк у больных ХМЛ может быть объяснена либо увеличением способности лейкемичсских клеток-предшественников к самоподдержанию, либо увеличением прито-ка КОЕк из пула полипотентных СКК, тем более что пролифера-ция лейкозных клеток не увеличена и процент «тимидинового са-моубийства» снижен (Забелина Т. С. и др., 1980). Все клетки в колониях и кластерах содержат Ph'-хромосому. Морфология кле-ток и соотношение кластер/колония нормальное, хотя число агре-гатов может быть в 500 раз больше, чем в норме. При ХМЛ наблю-дается повышение уровня КСФ в сыворотке. Прогрессировать заболевания ведет к еще большему росту КОС и КлОС, иногда с преобладанием эозинофилытых агрегатов.

При успешном лечении количество КОЕк уменьшается одно-временно со снижением числа гранулоцитов. В период ремиссии КОС костного мозга нормализуется. В стадии БК ХМЛ количе-ство КОЕ-ГМ и КОЕ-ГЭММ в культуре резко снижается, наблю-дается лейкемический или гипопластический тип роста КОЕк, как при ОЛ (Афанасьев Б. В. и др., 1980). Появление лейкемического типа роста на ранних этапах, за несколько недель до начала терми-нальной фазы, позволяет заподозрить развитие БК ХМЛ (Афа-насьев Б. В. и др., 1980; Афанасьев Б. В., 1980). В период ремиссии БК показатели КОС и КлОС близки к таковым в хронической стадии болезни. Типичным для ХМЛ является наличие бластных колоний и значительное увеличение числа макрофагов.

При клонировании клеток больных ХМЛ в среде IMDM с ме-тилцеллюлозой, оптимизированной КС или рекомбинантными цитокинами, также наблюдается резкое увеличение всех типов мие-лоидных колоний, в том числе КОЕ-Э и БОЕ-Э (Atlas of Human Hematopoietic Colonies, 1995). Для хронического миеломоноци-тарного лейкоза наиболее характерен гиперпластический тип рос-та КОЕк, а для хронического эритромиелоза - лейкемический тип роста в культуре.

У больных миелофиброзом найдено увеличение КОЕ-ГМ в пе-риферической крови и у части больных - в костном мозге.

Истинная полицитемия (ИП). Это миелопролиферативное за-болевание, которое характеризуется повышенной репродуктивной способностью общей для миелопоэза клетки-предшественника.

Уровень циркулирующего КСФ при ИП повышен (Spitzer G. et al., 1978; Eaves С. I., Eaves A. C, 1978).

По данным Л. В. Филева и соавторов (1982), в агаровой куль-туре клеток костного мозга больных ИП число КОЕ-ГМ и КЛОЕ-ГМ на 1 х 10' клеток соответственно в 3-7 раз превышало нормальные показатели. В период ремиссии данные показатели снижались, хотя оставались высокими. Эта особенность ИП помо-гает в дифференциальной диагностике с симптоматическими эрит-роцитозами (СЭ), при которых КОС клоногенных миелоидных клеток ниже, чем в норме, так как СЭ характеризуется угнетением функциональной активности КОЕ-ГМ.

В метилцеллюлозе со средой IMDM, оптимизированной КС или коктейлем рекомбинантных цитокинов, колон иеобразующая способность БОЕ-Э и КОЕ-Э при ИП резко увеличена. Образуют-ся колонии из созревающих эритробластов, причем более чем 10% КОЕ-Э и БОЕ-Э продуцируют гемоглобинизированные колонии в отсутствие ЭРП, хотя их размер, степень созревания и гемоглоби-низация ниже, чем в культурах с ЭРП. Эта ненормальная эритро-поэтин-незавнеимость неопластических эритроидных предшествен-ников сохраняется даже после многих лет лечения больного, что используют для диагностики ИП. Не так постоянно, но такие ЭРП-независимые колонии могут развиваться и при ХМЛ и эссенци-альной тромбоцитемии.

Миелодиспластический синдром (МДС )

При МДС, учитывая выраженную гетерогенность этой группы заболеваний, наблюдается различная КОС костного мозга. G. Spit-zer с соавторами (1978), L. P. Bodey, V. Rodriguez (1978) показали 3 типа роста КОЕк в агаре при МДС:

1-й - формирование нормальных колоний и кластеров с их нормальным соотношением;

2-й - развитие колоний и кластеров как нормального, так и лейкозного типа;

3-й - формирование клеточных агрегатов только лейкозного типа (маленькие кластеры, состоящие из бластов, при отсутствии колоний. Их число может быть очень большим).

У больных со 2-м и 3-м типом роста клеток в культуре острый лейкоз развивался за 0,5-3 месяца. У остальных наблюдался по-степенный переход от 1-го к 3-му типу. Число КОЕк обычно сни-жено, и степень снижения коррелирует с вероятностью развития лейкоза. По мере прогрессировав ия заболевания наблюдается смена типа роста: нормальный -> лейкемический; гипопластический -» лейкемический -> более лейкемический. Происходит увеличе-ние клонирующей эффективности лейкозных бластов и наруше-ние созревания клеток (Афанасьев Б. В. и др., 1982). Анализ зави-симости между течением МДС и характером колониеобразования показал, что при наличии лейкемического типа роста в агаре резко возрастает риск возникновения лейкоза (Tennant G. В. et al., 1991). Гипопластический тип роста при МДС также является неблаго-приятным, и выживаемость больных с нормальным и гиперплас-тическим ростом в агаре больше. При ранних вариантах МДС (РА и РАКС) наблюдается чаще всего нормальный характер роста (Ruu-tu Т. et al, 1984). При клонировании клеток костного мозга боль-ных МДС в максимально обогащенных ростовыми факторами и интерлейкинами средах с метилцеллюлозой и средой IMDM наблюдается резкое снижение или отсутствие КОЕ-Э, БОЕ-Э, КОЕ-ГМ, КОЕ-ГЭММ. В некоторых случаях нормальные грану-лоцитарные или эритроидные колонии соседствуют с маленькими бластными колониями.

Апластическая анемия (АА)

Заболевание характеризуется гипопластическим типом роста КОЕк у подавляющего большинства больных в период разверну-той картины заболевания, и лишь у части больных величина КОС близка к нижней границе нормы (Балашова В. А. и др., 1994; Аб-дулкадыров К. М. и др., 1995). В период ремиссии КОС костного мозга увеличивается и может нормализоваться.

При нейтропениях различного генеза может иметь место как нормальное, так и пониженное и повышенное колониеобразова-ние в агаре (Афанасьев Б. В., 1980). По-видимому, происходит нарушение гуморальной регуляции, так как в присутствии КСФ гранулоцитарные предшественники костного мозга больных не-которыми нейтропениями начинают нормально дифференциро-ваться и формируют нормальное количество колоний (Barack Y. et al, 1971). S. Nakino с соавторами (1997) показали, что СВ34⁺кроветворные клетки, которые культивировали в количе-стве 5 х 10⁶ в течение 14 дней в метилцеллюлозе со средой IMDM в присутствии ИЛ-3, ИЛ-6, Г-КСФ и фактора стволовой клетки, генерировали 2 х 109 миелоидных клеток и 5 х 10' КОЕ-ГМ. Пред-принимаются попытки лечения нейтропений после высокодоз-ной химиотерапии инфузией таких клеточных популяций (Wil-liams S. F. et al, 1996).

Хронический лимфолейкоз и другие лимфопролиферативные заболевания характеризуются гипопластическим типом роста или его отсутствием в рассмотренных выше культуральных системах, приспособленных для миелоидной серии клеток.

Таким образом, культивирование гемопоэтических клеток по-зволяет:

производить количественную и качественную оценку пула СКК и ККП костного мозга, периферической и пуповинной крови;

изучать процессы пролиферации и дифференциации СКК и ККП;

изучать процессы пролиферации и дифференциации ство-ловых клеток стромы костного мозга и их потомков;

производить дифференциальную диагностику и прогнози-рование гематологических заболеваний;

осуществлять контроль за эффективностью и адекватностью проводимой терапии;

выявлять и оценивать ростовые факторы и другие регулято-ры гемопоэза, экспрессируемые кроветворными клетками в культуре;

оценивать влияние на СКК и ККП различных регуляторов кроветворения и других гуморальных и физических факто-ров;

оценить качество и жизнеспособность трансплантата при ал-логенной и аутологичной трансплантации костного мозга;

наращивать массу СКК и ККП для различных исследований как источника клеток для трансплантации;

10) контролировать поступление в периферическую кровь из костного мозга миелоидных клоногенных клеток, используе-мых затем для пересадки.

Стимуляция костного мозга для выхода в кровяное русло ство-ловых и коммитированных клеток-предшественников осуществ-ляется с помощью рекомбинантных цитокинов - нейпогена, гра-ноцита и других миелоидных КСФ.

Культуральные исследования с целью определения количества КОЕ-ГМ, КОЕ-ГЭММ являются одними из самых информативных методов оценки качества трансплантата при пересадке костного мозга, а также определения жизнеспособности криоконсервиро-ванного костного мозга и крови, предназначенных для трансплан-тации. Культуры клеток используют при изучении гемопоэтиче-ского потенциала пуповинной крови. Клонирование клеток пупо-винной крови показало, что она является альтернативным источником СКК и ККП для целей трансплантации (Абдулкадыров К. М. и др., 2003; Нао О. L. et al, 1995; Hunt С. J. et al, 2003).

Достижения последних лет, связанные с клонированием эмбрио-нальных стволовых клеткок (ЭСК), совершили настоящую рево-люцию в биологии и медицине (Thomson J. A. et al., 1998). Появи-лась возможность крупномасштабного выращивания специализи-рованных клеток человека, в том числе и гемопоэтических (Ре-пин В. С, 2001; Сухих Г. Т. и др., 2002). Сегодня перспективы ЭСК в медицине очень велики. Возможности тотипотентных ЭСК уже используют в медицине для заместительных клеточных трансплан-таций. Большое внимание привлекают сегодня исследования, свя-занные с мезенхимальными стволовыми клетками (МСК), кото-рые отличаются низкой антигенной активностью и наличием им-муносупрессорных белков. Поэтому применение МСК как био-сырья для тканевой регенерации имеет большие перспективы в медицине. Уже сегодня аллогенные и аутологичные пересадки МСК используют для лечения множественной миеломы, апластической анемии и цитопений - заболеваний, связанных с дефектами стро-мы (Репин В. С, 2001). Результаты культивирования эмбриональ-ных, мезенхимальных и дефинитивных стволовых клеток в средах с ростовыми факторами показали возможность репрограммирова-ния стволовых клеток и направленного изменения их свойств (Ды-бан А. П., Дыбан П. А, 2002).

Использованная литература

1. Гематология: Новейший справочник / Под общ. ред. К. М. Абдулкадырова. - М.: Иза-во Эксмо; СПб.: Изд-во Сова, 2004. - 928 с, илл.