Транскрипция ДНК. Вскрытие клеток

Реферат на тему:

Транскрипция ДНК

Вскрытие клеток

2009

Транскрипция ДНК

Так называют процесс переноса наследственной информации с ДНК на РНК посредством ее комплементарного синтеза по матрице одной из нитей ДНК. Сразу же следует указать на то, что матрицей для синтеза РНК служит та нить ДНК, которую мы раньше назвали «защитной». Название не очень удачное. Но это -- предмет договоренности. Мы сохраним название «кодирующей» для той нити ДНК, которая не служит матрицей для синтеза РНК. Ведь именно ее последовательность нуклеотидов будет в точности воспроизводить РНК, синтезированная по матрице другой, комплементарной, нити ДНК.

Фермент, ведущий матричный синтез РНК называется «РНК-полимераза». Он копирует информацию, «записанную» в гене. Так мы будем называть участок ДНК, направляющий комплементарный синтез молекул РНК. Одни из этих молекул кодируют далее синтез белков, а также элементов, участвующих в регулировании этого синтеза. Такие РНК условимся называть « информаци-онными» (иРНК). Другие гены направляют (непосредственно) синтез стабильных молекул клеточных РНК. Впрочем, иногда гены нескольких функционально связанных белков располагаются на ДНК рядом, в виде «кластера» генов и «прочитываются» РНК-полимеразой за один проход. Такую группу генов именуют «опероном». Соответствующая ему иРНК направляет рибосомальный синтез всех этих белков. Место посадки РНК-полимеразы строго фиксировано «промотором» -- участком ДНК, как правило, обогащенным стоящими подряд основаниями А и Т. Промоторы различных генов сходны по своему строению, но не тождественны.

РНК-полимераза снимается с ДНК по достижении ею «терминатора» -- определенной последовательности нуклеотидов ДНК, нередко образующих небольшие петли -- комплементарно спаренные участки одной нити. Терминатор всегда располагается дальше «стоп-кодона» -- тройки нуклеотидов, определяющих окончания синтеза белка по матрице иРНК.

При «посадке» РНК-полимеразы на матрицу двойная спираль ДНК локально раскручивается, водородные связи рвутся и нити ДНК расходятся. Фермент начинает свое движение вдоль матрицы по направлению 3'--5 «Раскрытие» впереди лежащего участка ДНК производит сама РНК-полимераза. Позади нее спираль ДНК восстанавливается самопроизвольно. Работа разрыва водородных связей ДНК и продвижения фермента производится (так же, как в случае ДНК-полимеразы) за счет энергии, освобождающейся при рызрыве макроэрической фосфатной связи в молекулах рибо-нуклеозидтрифосфатов -- предшественников присоединяемых нуклеотидов. Скорость матричного синтеза комплементарной РНК у эукариотов -- примерно 100 нуклеотидов в секунду.

В клетке E.coli одна и та же РНК-полимераза ведет синтез всех типов РНК (информационных -- иРНК, рибосомальных -- рРНК и транспортных -- тРНК).

У высших организмов известны три различных фермента:

РНК-полимераза I (М ~ 473 тыс., 6 субъединиц) ведет синтез крупных молекул рРНК и малых молекул, так называемой, 5,88 рРНК по ДНК ядрышка. Она -- самая «работящая». На долю рРНК приходится около 80% всей РНК клетки по массе. В ядрышке же происходит и «самосборка» (но не объединение) двух субъединиц рибосомы (большой и малой) с участием рибосомальных белков, поступающих из цитоплазмы. В клетках большинства эукариотов имеются сотни идентичных копий генов рРНК расположенных рядом друг с другом.

РНК-полимераза II. Она -- крупнее (М-882 тыс., 10-12 субъединиц) и выполняет самую ответственную работу -- синтезирует множество различных иРНК, направляющих, в свою очередь, синтез белков в рибосомах. Хотя продукция этого фермента постоянно занимает не более 2% от суммарной РНК клетки, его не следует считать мало продуктивным. Ведь иРНК нестабильна, легко разрушается. За время жизни клетки синтезируется множество ее сменяющих друг друга молекул, в соответствии с изменениями потребностей белкового синтеза. Считается, что время разрушения наличных молекул иРНК у бактерий составляет несколько минут. У животных -- несколько часов. Но надо иметь в виду, что по крайней мере часть иРНК эукариотов выходит в цитоплазму клетки в комплексе с белком («информосомы»). В ряде случаев показано, что они сохраняются дольше. Молекулярные веса иРНК колеблются, -- в зависимости от размеров синтезируемых белков, -- в пределах от 50 тысяч до 4 миллионов дальтон. В начале транскрибированного участка иРНК находится специально закодированное посадочное место для рибосом. (При наработке нескольких копий белка рибосомы «садятся» на это место одна за другой.)

«Рамка считывания» кодонов, задающих последовательность аминокислот в белке, определяется триплетом АУГ, кодирующим метионин, с которого начинается аминокислотная цепь любого белка. Напомню, что в «зрелой», готовой к направлению белкового синтеза иРНК все кодирующие триплеты следуют вплотную друг к другу. Изменение начала считывания иРНК, хотя бы на один нуклеотид, изменит смысл всех последующих кодонов.

Однако у эукариотов первоначальный «транскрипт» с ДНК значительно больше, чем зрелая иРНК. Наряду со «значащими» участниками рибонуклеотидной последовательности транскрипта, так называемыми «экзонами», которые войдут в готовую молекулу иРНК, в нем имеются и лишние, «молчащие» участки -- «интроны», подлежащие удалению. Заметим, что у эукариотов соотношение интроны/экзоны (по длине) равно 9:1. Для прокариотов --соотношение обратное, 1:9.

Удаление интронов («сплайсинг») происходит еще в ядре, перед выходом иРНК в цитоплазму. При этом должна быть сохранена (или установлена) правильная рамка считывания. Явление сплайсинга у эукариотов не позволяет по аминокислотной последовательности белка восстановить последовательность нуклеотидов в кодирующем его участке ДНК. У прокариотов, к счастью, явление сплайсинга наблюдается редко, и соответствие двух названных последовательностей, как правило, сохраняется.

Здесь уместно заметить, что интроны, все-таки, относятся к местам расположения генов (считается, что у человека имеется всего около 80 тысяч генов, а у E.coli -- около 4 тысяч). При том, что средняя длина одного гена, -- судя по размерам белков, -- не превышает 1,5 тысяч пар оснований. Это означает, что вся генетическая информация человека, о которой до сих пор шла речь, записана не более, чем в 120 миллионах пар оснований. Пусть с учетом интронов внутри предшественников иРНК эту цифру надо увеличить в 10 раза, т. е. до 1,2 миллиарда. Полная длина ДНК человека составляет 3 миллиарда пар оснований. Приходится сделать вывод, что не более чем 40% этой ДНК участвует в направлении биосинтеза белков. Для чего же существуют остальные 60%? Известно, что около 40% составляют многократно повторяющиеся, то длинные, то короткие последовательности нуклеотидов. Зачем они? А 20% составляет уникальная и «молчащая» последовательность!

Действительно ли клетки человека из поколения в поколение упорно воспроизводят этот балласт или с его помощью тоже передается некая наследственная информация, быть может зашифрованная каким-то более тонким способом, чем синтез набора из 80 тысяч различных белков. На этот вопрос должны ответить следующие поколения исследователей. Кстати, у E.coli лишь 11% ДНК не участвует в синтезе белков...

К зрелой иРНК эукариотов уже в цитоплазме, по-видимому, в целях защиты от разрушения, с 3'-конца присоединяется цепочка из примерно 250 аденозинмонофосфатов («поли А»), а с 5'-кон-ца -- молекула метилированного по седьмому положению в кольце гуанина. У прокариотов и эта модификация отсутствует.

РНК-полимераза III у эукариотов (М - 653 тыс., 9 субъединиц) ведет синтез стабильных малых молекул тРНК и, так называемой, 5S рРНК. Последняя так же, как и 5,8S pPHK, входит в состав большой субъединицы рибосомы эукариотов. В рибосомах бактерий 5,85S pPHK нет.

Каждая из субъединиц всех РНК-полимераз выполняет свою функцию. Одни «узнают» нуклеотидную последовательность ДНК в зоне промотора транскипции, другие -- обеспечивают сам механизм последовательного присоединения рибонуклеотидов (матричного синтеза РНК), третьи -- взаимодействуют с многочисленными регуляторными белками и факторами.

Вскрытие клеток

Первой из ряда операций, ведущих к выделению клеточных органелл, белков или нуклеиновых кислот является вскрытие клеток. Это -- операция ответственная. Она чревата разрушением или утратой нативной структуры того самого материала, который подлежит выделению и дальнейшему исследованию. И не только в результате чисто механических повреждений, но и благодаря утрате биологического контроля над активностью клеточных ферментов, способных приводить к тем же результатам. Имеются в виду разного рода пропгеазы, разрушающие белки и нуклеазы (РНК-азы и ДНК-азы), разрезающие на куски или «обкусывающие» по концам длинные нити нуклеиновых кислот.

Ввиду этих опасностей вскрытие клеток должно производиться по возможности быстро и обязательно на холоду. Кроме того в буферную среду, где после вскрытия окажется содержимое клеток, следует заранее добавить стабилизирующие и защитные вещества. Например, глицерин, сахарозу или ЭДТА, поскольку активность многих разрушительных ферментов клетки зависит от присутствия ионов магния.

В иных случаях, когда заботятся не столько о нативности подлежащих исследованию биополимеров, сколько о полноте их отделения от клеточных мембран, добавляют детергенты (DDC-Na или Тритон Х-100). Если клетки вскрывают с целью очистки только нуклеиновых кислот, то иногда в исходный буфер добавляют извне дополнительную протеазу. Интенсивное разрушение белков облегчает выделение нуклеиновых кислот. Если исследователя интересует только ДНК или только РНК, то имеет смысл с самого начала добавить к лизату клеток фермент, разрушающий ненужную нуклеиновую кислоту. (Соответственно, РНК-азу или ДНК-азу. Они, как и все прочие ферменты в очищенном виде имеются в продаже.) В случаях, когда целью вскрытия является очистка белка, использовать эти дорогостоящие ферменты не имеет смысла, так как белки легко отделяются от нуклеиновых кислот описанным ниже физико-химическим способом.

Теперь обратимся к самим способам разрушения клеточных оболочек. У клеток животных тканей эти оболочки достаточно прочны и требуют энергичного механического воздействия. Наиболее эффективным на сегодняшний день считается разрушение тканей, суспендированных в жидком азоте с помощью «блендора». Последний представляет собой некое подобие обычной кофемолки. Но с мощным мотором и стаканом из нержавеющей стали, у дна которого со скоростью 12 000 оборотов в минуту вращается нож.

Препарат ткани животного, сразу после извлечения соответствующего органа, режут на мелкие кусочки и быстро замораживают в жидком азоте. В стакан блендора препарат вносят с достаточным количеством азота, чтобы тот не успел испариться за время разрушения клеток. Через несколько секунд вращения ножа на максимальной скорости препарат превращается в тончайшую пыль, состоящую из полуразрушенных клеток. Клеточные органеллы (ядра, митохондрии, рибосомы), а также макромолекулы белков и нуклеиновых кислот, ввиду их относительной малости, разрушаются незначительно. После испарения азота клеточную «пыль» суспендируют в холодном жидком буфере с упомянутыми добавками и незамедлительно приступают к фракционированию содержимого клеток, как это будет описано ниже. (За отсутствием блендора замороженные кусочки ткани можно энергично растолочь до состояния пыли в медной ступке с пестиком, подливая в нее по мере необходимости жидкий азот.)

Оболочки бактерий вскрывают иначе. Часто это делают в два этапа. На первом из них с помощью фермента лизоцима в растворе сахарозы с добавлением ЭДТА растворяют наружные мембраны бактерий. При этом последние сохраняют свою целостность, превращаясь в так называемые сферопласты, -- одетые очень тонкой внутренней мембраной оболочки. Ее легко разрушить механически в гомогенизаторе, представляющем собой калиброванный стеклянный цилиндр, напоминающий большую пробирку, с хорошо пригнанным к нему тоже цилиндрическим пестиком из тефлона. Пестик быстро вращается и одновременно совершает возвратно-поступательные движения. Буфер со взвешенными в нем сферопластами перетекает из пространства под пестиком в емкость, находящуюся над ним, и обратно. Протискиваясь через тонкий и длинный зазор между стеклом и вращающимся пестиком сферопласты разрушаются возникающими в этом зазоре «срезывающими силами».

Можно и попросту разрушить мембраны сферопластов действием DDC-Na, если это не опасно для содержимого бактериальной клетки (например, в случае необходимости сохранения нативности ее белков).

Иногда (например, для выделения плазмид) бактериальные клетки можно вскрывать (минуя стадию сферопластов) воздействием щелочи в присутствии DDC-Na. Возможно и вскрытие бактерий с помощью ультразвука. Но в этом случае возникает реальная опасность дробления крупных молекул ДНК и даже белков.

Дифференциальное центрифугирование

Неразрушенные клетки, обрывки их оболочек, ядра и митохондрии, -- все разом, -- можно удалить из клеточного «лизата» посредством центрифугирования при относительно небольших скоростях вращения. Для этой цели (если исходный материал имеется в достаточном количестве) используют «препаративные» центрифуги со скоростью вращения до 10 тысяч оборотов в минуту, радиусом вращения порядка 10--15 см и четырьмя -- шестью откидывающимися стальными гильзами. По мере увеличения скорости эти гильзы, благодаря свободной подвеске, из первоначально вертикального положения поднимаются до горизонтального. В таком положении центробежные силы действуют на взвешенные в буфере частицы вдоль оси установленных в гильзы больших пробирок или стаканчиков. Разумеется, до начала центрифугирования противолежащие гильзы вместе с заполненными пробирками приходится уравновешивать добавлением буфера.

Скорость оседания частиц в жидкой среде, когда действующая на них центробежная сила уравновешивается силой трения, устанавливается постоянной. Варьируя скорость и длительность препаративного центрифугирования можно сначала осадить только целые клетки и их оболочки. Затем слить надосад очную жидкость («супернатант») и повторным, более продолжительным центрифугированием на большей скорости осадить ядра. Точно так же можно в отдельный осадок собрать митохондрии.

Осадить рибосомы или даже гигантские молекулы ДНК препаративным центрифугированием не удается. Для этой цели служит «ультрацентрифугирование», с которым мы познакомимся позже.

Выделение суммарных фракций белков после дифференциального центрифугирования

Оно достигается добавлением к супернатанту сульфата аммония (NH4)2S04 до концентрации в 20, 30,...,60 и даже 80% от насыщения. Обычно добавляют расчетный объем из насыщенного (100%-ного), примерно, 4-х молярного раствора сульфата аммония (СА). СА блокирует электрические заряды на поверхности белковых глобул и, кроме того, жадно связывает воду, которой начинает нехватать для полной гидратации молекул белка. Все это приводит к агрегации белков за счет гидрофобных участков на их поверхности. Это явление именуется «высаливанием». Белки могут быть собраны в осадок препаративным центрифугированием. Используя дифференциальное центрифугирование можно получать различные фракции белков, добавляя к последовательным супернатантам дополнительные количества СА.

Эти белковые фракции будут различаться между собой по исходной степени гидрофильности и гидрофобности. Если при этом желают сохранить нативность таких «высаливаемых» белков, то все операции производят на холоду (в «холодной комнате») с целью ослабления действия протеаз, иногда добавляя глицерин в исходный буфер для вскрытия клеток. Если же важна не нативность, а полнота извлечения белков (в том числе связанных с клеточными мембранами), то помимо СА добавляют детергенты и мочевину.

После осаждения очередной белковой фракции ее снова растворяют в буфере. От остатков СА и других добавок можно избавиться с помощью диализа. Белковый раствор помещают в узкий и длинный мешочек из целлофана, специально обработанного так, что через его поры из мешочка могут уходить молекулы соли, мочевина и детергенты, но не могут пройти молекулы белков. Мешочек погружают в большой сосуд, заполненный буфером, который медленно перемешивается электрической мешалкой. И оставляют на холоду в течение нескольких часов, сменяя за это время 2-3 раза буфер в сосуде. После этого белки оказываются растворенными в практически чистом буфере.

Более современный и быстрый способ очистки раствора белка от ненужных низкомолекулярных добавок -- гель-фильтрация, с которой нам еще предстоит познакомиться.

Разумеется, использовав даже весьма дробное фракционирование суммарных белков клетки путем осаждения сульфатом аммония, мы не сможем выделить индивидуальные белки. Эта задача решается специальными, более тонкими физическими методами, о которых речь впереди.

Выделение суммарных препаратов ДНК и РНК

В качестве исходного материала в случае животных клеток можно использовать «лизат» клеток после их разрушения в блендоре, суспендирования в буфере и очистки центрифугированием от неразрушенных клеток и обрывков их оболочек. Защитные мембраны ядер при этом оказываются столь основательно поврежденными, что не препятствуют выходу из них нуклеиновых кислот. Впрочем, если исследователя интересует только ДНК, то имеет смысл предварительно осадить и промыть ядра (суспендировав их осадок в буфере и повторно отцентрифугировав).

При работе с бактериальным материалом приходится иметь дело с лизатом клеток (после удаления оболочек), где ДНК и РНК в цитоплазме не разделены морфологически, если не считать рибосом, которые не препятствуют доступу к содержащейся в них РНК.

Основным способом отделения суммарной фракции нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) от клеточных белков является энергичное встряхивание на холоду суспензии содержимого клеток в буфере с равным объемом смеси фенола с хлороформом (1:1) после добавления в нее ацетата калия для нейтрализации исходно кислого фенола. За встряхиванием следует препаративное центрифугирование. Мутная фенольно-хлороформенная фаза оказывается внизу, а над нею, отделенный толстой разделительной пленкой, находится почти прозрачный, вязкий раствор в буфере обеих нуклеиновых кислот.

Существо метода в том, что как фенол, так и хлороформ денатурируют молекулы белков, заставляя их выпадать из раствора в виде хлопьев. Эти хлопья и делают мутной нижнюю фазу после центрифугирования и создают мощную пленку на интерфазе. ДНК и РНК от контакта с фенолом и хлороформом не страдают, но, освободившись от связующих белков (гистонов, белков рибосом) выходят в водную фазу в виде расправленных молекул, сообщая ей высокую вязкость.

Если желательно сохранить (по возможности) размер молекул ДНК, то этот вязкий раствор осторожно отсасывают пипеткой с расширенным диаметром отверстия. Осадок отбрасывают, к отсосанному супернатанту добавляют новую порцию фенола с хлороформом, снова центрифугируют и отсасывают верхнюю фазу. И так 2-3 раза до тех пор, пока пленка на интерфазе не исчезнет, а нижняя фаза не окажется почти прозрачной. Последнее встряхивание проводят уже с чистым хлороформом, для освобождения от фенола. Изначально заменить фенол хлороформом нельзя, так как фенол значительно эффективнее денатурирует белки. Присутствие же хлороформа желательно потому, что он улучшает разделение фаз и, кроме того, если это существенно, ингибирует рибонуклеазу (РНК-азу)--фермент, разрушающий РНК. Если же целью очистки является только ДНК, то после освобождения от фенола и хлороформа водную фазу обрабатывают дополнительно вносимой РНК-азой. И обратно, если целью выделения служит РНК, то раствор обеих нуклеиновых кислот обрабатывают дезоксирибонуклеазой (ДНК-азой) -- ферментом, разрушающим ДНК.

В обоих случаях ДНК или РНК можно осадить из раствора в буфере добавлением 2-х--3-х объемов этанола. Осадок промыть (суспендируя и снова центрифугируя) 70% -ным этанолом и высушить с тем, чтобы для дальнейшей работы иметь возможность растворить его в нужном водном буфере.

При осаждении РНК добавляют еще до 0,8 М раствора хлористый литий (LiCI). Практика показала, что это способствует более полному осаждению РНК.

Иногда в интересах сохранения максимального размера молекул ДНК избегают центрифугирования их осадка. Вместо этого вязкую водную фазу после обработки фенолом и РНК-азой диализуют для удаления следов фенола, затем добавляют два объема этанола и осторожно перемешивают раствор стеклянной палочкой. Выпадающая из раствора в виде белых нитей высокомолекулярная ДНК наматывается на палочку.

Противоположная ситуация возникает тогда, когда конечной целью является очистка низкополимерной ДНК плазмид (см. ниже), к тому же составляющей лишь малую часть суммарной ДНК бактерии. В этом случае имеет смысл еще до обработки фенолом добавить к суспензии клеточного лизата в буфере некую протеазу К и инкубировать смесь в течение 3-х часов при температуре в 50 °С. Такая обработка ведет к основательному разрушению всех клеточных белков, без чего «малогабаритные и Малочисленные» молекулы плазмидных ДНК могут запутаться и потеряться в плотной белковой интерфазе, образующейся при обработке фенолом.

Литература

Курашвили Л.В., Николаев П.Н. Диагностическая значимость исследования холестерина в ЛПВП у ожоговых больных. III Всесоюзная конференция по проблеме: Современные средства первой помощи и методы лечения ожоговой болезни /Тезисы/ - Москва, 1986. - С.186-187.

Курашвили Л.В., Савченко Р.П. Изменение показателей липидного обмена у больных с хронической почечной недостаточностью, находящихся на программированном гемодиализе /Лабораторное дело. - N 12. -1986. - С.717-719.

Курашвили Л.В., Николаев П.Н. Новое в лабораторной диагностике ожоговых больных. Научно-практическая конференция, посвященная 140-летию областной больницы им. Н.Н. Бурденко и 110-летию со дня рождения академика Н.Н. Бурденко. Тез.докладов. - Пенза, 1986. - С.103-105