Культивирование, очистка и титрование аденовирусов

Контрольная работа

на тему:

Культивирование, очистка и титрование аденовирусов

Введение

Аденовирусы -- это вирусы среднего размера, лишенные оболочки и содержащие линейную двуцепочечную ДНК с мол. массой -10⁶. Их частицы диаметром 70--90 нм, состоящие из 252 капсомеров, имеют икосаэдрический тип симметрии. На 12 капсомерах, расположенных в вершинах икосаэдра, располагаются нитевидные выросты. Семейство Adenovi-ridae состоит из двух родов -- Mastadenovirus и Aviadenovirus. Вирусы в пределах каждого рода имеют общий группоспецифический антиген. Изолированные от человека и различных видов животных, аденовирусы были разделены на более мелкие группы и типы на основе количественной реакции нейтрализации с соответствующими антисыворотками животных. В табл. 1 приведены последние данные о количестве аденовирусов различных видов животных. Аденовирусы человека связаны главным образом с респираторными и глазными заболеваниями. Тем не менее большинство аденовирусов не вызывает заболеваний. Некоторые аденовирусы были выделены из фекалий при диаррее.

Аденовирусы представляют собой удачную модель для изучения биохимии и генетики эукариот. Особенно часто в литературе встречаются работы, выполненные на аденовирусах человека типов 2 и 5. Эти вирусы хорошо размножаются в культуре ткани и дают высокие выходы вирионов, а также избыточных структурных антигенов. Интенсивно изучаются и аденовирусы человека типов 7 и 12, вызывающие с различной эффективностью опухоли у новорожденных хомяков.

На сегодняшний день существует довольно много обзоров, в которых обсуждаются различные аспекты биологии аденовирусов {2, 3].

1. Клеточные системы для культивирования аденовирусов

Как правило, аденовирусы лучше всего размножаются в эпителиальных клетках тех видов животных, которые являются их природными хозяевами. Выход вируса существенно зависит от природы клеток. Так, аденовирусы человека типов 2 и 5 очень эффективно размножаются в эпителиальных клетках линий HeLa или KB и относительно слабо в фибробластах человека линий WI-38 или MRC-5.

Аденовирусы человека, вызывающие образование опухолей, более «прихотливы». Для получения высоких выходов этих вирусов требуются первичные или вторичные культуры почки человеческого эмбриона. Неодинаковую чувствительность клеток к аденовирусной инфекции нельзя объяснить только различной степенью доступности клеточных рецепторов, поскольку большинство клеток способно захватывать вирус. Однако далее возможна как литическая, так и абортивная инфекция. В последнем случае в зараженных клетках образуются вирусная ДНК и структурные компоненты, однако эффективность сборки вирусных частиц сильно уменьшена. В некоторых случаях в инфицированных клетках происходит экспрессия только нескольких «ранних» генов, что приводит к опухолевой трансформации клеток. Литическая и большинство абортивных инфекций ведут к гибели клеток. Роль компонентов клетки, необходимых для определенных стадий репликации и сборки аденовирусов, исследована пока недостаточно. Поэтому сейчас невозможно, за исключением клеток линии 293, искусственно повышать выход вируса.

1.1 Аденовирусы человека, легко адаптируемые к культуре клеток

Как указывалось выше, наиболее изученными являются аденовирусы человека типов 2 и 5. Они одинаково хорошо растут как в монослойных, так и в суспензионных культурах клеток HeLa и KB в пластиковой и стеклянной посуде. Суспензионные культуры более удобны, особенно для получения больших количеств вируса. Метод получения таких культур детально описан ниже.

Аппаратура для суспензионных культур

На рис. 2 изображен аппарат с несколькими магнитными мешалками для суспензионного культивирования клеток. Такой или подобный ему аппарат, приспособленный для сосудов разного размера и любой формы, легко изготовить в лабораторных мастерских. Двигатель, снабженный по возможности реостатом для регулирования частоты вращения, должен обеспечивать постоянное вращение магнитной мешалки с частотой 150 об/мин в течение довольно долгого времени при 37°С. Другая модель аппарата, не требующая теплой комнаты или термостата, представляет собой вибрирующую платформу, помещенную в водяную баню. Такие приборы выпускаются рядом фирм. Культивирование клеток можно проводить в различных сосудах. На первом этапе мы рекомендуем использовать сосуды емкостью 500 мл, предназначенные для сбора крови. Далее культивирование можно продолжать в 5-л флаконах с плоским дном, используя магнитную мешалку.

К таким флаконам следует подобрать соответствующие пробки, обернуть их алюминиевой фольгой, закрыть флаконы и поместить в автоклав.

Среды и сыворотки.

Среды для роста клеток в суспензии выпускаются в виде сухих порошков и жидких концентратов или же готовыми к употреблению. В табл. 2 перечислены основные поставщики сред, сывороток и оборудования, необходимых для культивирования клеток. Следует отметить, что между средами для культивирования клеток в суспензии и монослое существуют значительные различия. При переводе культур из монослоя в суспензию необходимо по возможности заботиться о сходстве используемых сред.

При работе с суспензионными культурами особенно важно следить за чистотой воды для приготовления сред. Воду необходимой чистоты получают после дополнительной очистки дистиллята деионизацией или обратным осмосом. Для суспензионных культур, как правило, пригодна телячья сыворотка либо лошадиная сыворотка.

Таблица 2. Список фирм, поставляющих реактивы и оборудование для клеточных культур

Новую партию сыворотки перед употреблением рекомендуется проверять на способность инициировать рост клеток, например, с помощью определения коэффициента клонирования.

Клетки.

В работе необходимо использовать клеточные линии, приспособленные к росту в суспензии, например HeLa S3 или KB. Как правило, клетки вначале культивируют в монослое по стандартной методике в подходящей среде с 7,5% СНТ. Через определенное время готовят 200 мл суспензии с концентрацией клеток 3-10⁵/мл. Надо отметить, что используемые клетки, как правило, плохо образуют плотный монослой. Приготовленную суспензию переносят в 500-мл флакон, который помещают в описанный выше аппарат и культивируют два дня при 37 °С. Затем подсчитывают число клеток. При достижении плотности 6 10⁵ кл/мл суспензию клеток вдвое разводят свежей средой, содержащей ТС.

«Здоровые» культуры должны иметь время удвоения около 42--48 ч. Получив 1--2 л клеточной суспензии, культивирование можно продолжить в сосудах большего объема. Оптимальные условия роста клеток достигаются при заполнении половины сосуда и поддержании оптимального рН в С0₂-инкубаторе. Естественно, необходимо сохранять стерильность сосуда.

Суспензионные культуры чувствительны к флуктуациям температуры; поэтому она не должна превышать 38,5 °С. Кроме того, нельзя исключить возможной гибели основной культуры из-за поломки аппарата. Поэтому следует вести дублирующую культуру и обязательно заморозить часть клеток. Эти предосторожности особенно важны при работе с суспензионными культурами, поскольку их приготовление занимает слишком много времени.

Тестирование микоплазмы.

Используемые клетки необходимо постоянно тестировать на отсутствие микоплазмы, поскольку выход вируса существенно зависит от контаминации культуры этим агентом. Наиболее быстро и эффективно микоплазмы тестируют с помощью флуоресцирующих красителей.

1. Клетки выращивают на покровных стеклах до состояния монослоя и промывают небольшим объемом PBS.

2. Клетки инкубируют 30 мин при 37 °С в небольшом объеме PBS, содержащем 0,1 мкг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола. Инкубацию проводят во влажной атмосфере.

3. Стекла промывают и помещают на предметное стекло. Препараты исследуют под флуоресцентным микроскопом с фильтром возбуждения примерно 365 нм и фильтром эмиссии примерно 450 нм.

Используемые красители, связываясь с ДНК, начинают флуоресцировать и, таким образом, хорошо окрашивают ядра. Микоплазма обнаруживается в виде характерных флуоресцирующих гранул в цитоплазме и на плазматических мембранах зараженных клеток. Кроме того, для тестирования микоплазмы могут быть использованы стандартные культуры с PPLO-агаром: PPLO-агар 35 г/л

2% лошадиной сыворотки

10% дрожжевого экстракта

Поверхность агара прокалывают пастеровской пипеткой и в лунку помещают каплю клеточной суспензии. Чашку инкубируют 3--5 дней в анаэробных условиях при 37 °С. При наличии микоплазмы в области укола образуются характерные колонии, напоминающие яичницу «глазунью». В некоторых случаях для образования характерных колоний необходимо дополнительное пятидневное культивирование.

В последнее время для тестирования микоплазмы используют коммерческие моноклональные антитела.

Инфицирование клеток:

1. Из суспензии клетки осаждают центрифугированием, удаляют культуральную среду и ресуспендируют осадок в среде без сыворотки.

2. К полученной суспензии клеток добавляют вирус из расчета 1--10 БОЕ/кл. Зараженные культуры инкубируют, слабо перемешивая, 1 ч при 37 °С.

3. Суспензию разводят теплой средой с 2% СНТ до концентрации * 10⁵ кл/мл. Клетки инкубируют 48--60ч при 37°С.

4. Клетки, растущие в монослое, инфицируют в малом объеме бессывороточной среды после удаления культуральной.

5. Зараженные культуры инкубируют 1 ч при 37°С, а затем добавляют среду, содержащую 0,5% СНТ. Инкубацию культур продолжают до обнаружения явных признаков ЦПД.

В течение 2--3 дней большинство клеток, инфицированных аденовирусами типов 2 и 5, округляются и отрываются от стекла. В случае других вирусов максимальный выход может быть достигнут при более длительном культивировании.

Заготовки вируса.

При культивировании аденовирусов необходимо избегать накопления дефектных вирусов, количество которых возрастает по мере пассирования вируса в культуре клеток. Для поддержания гомогенности вирусной популяции лучше всего получать посевной материал из одной исходной заготовки высеянного вируса, которая в свою очередь может быть получена из заготовки клонированного вируса. Последний следует получить непосредственно из изолированной вирусной бляшки. Заготовки удобно хранить небольшими порциями при --70°С; они хорошо сохраняются и в виде фторутлеродных экстрактов с титрами в пределах 2--5-10⁹ БОЕ/мл.

1.2 Аденовирусы человека, трудно адаптируемые к культуре клеток

Не все аденовирусы человека хорошо размножаются в клетках HeLa или KB и в отдельных случаях дают более высокие титры в первичных или вторичных культурах клеток почки эмбриона человека. Некоторые аденовирусы кишечника человека не удается размножить ни в одной из перечисленных выше культур. В этом случае используют клетки человека 293, трансформированные аденовирусом типа 5. Методы приготовления культуры почки эмбриона человека и клеток 293 описаны ниже.

Культура клеток почки эмбриона человека.

Почки человеческих эмбрионов получают в стерильных условиях из абортного материала.

1. В стерильной чашке Петри удаляют почечную капсулу, а затем ткань измельчают скальпелем. Полученный гомогенат переносят в небольшие конические флаконы с 10 мл среды, содержащей 1,25 ед./мл диспазы.

2. Во флаконы помещают маленький тефлоновый магнит и осторожно перемешивают материал 20 мин при 37 °С.

3. Крупные кусочки ткани удаляют фильтрованием через Стерильный муслин. Фильтрат, содержащий главным образом одиночные клетки, центрифугируют 5 мин при 500 g.

4. Осадок клеток для удаления излишков протеазы аккуратно промывают Ш мл культуральной среды с 5% ЭТС. Клетки, суспендированные в культуральной среде, рассевают в стеклянные или пластиковые флаконы либо в роллерные сосуды. Примерная концентрация клеток при посеве должна составлять 1-10⁵кл/мл.

5. Клетки, образовавшие плотный монослой, можно пересеять для получения вторичной культуры. Кроме этого, монослой можно инфицировать вирусом в небольшом объеме.

Явные признаки ЦПД, как правило, обнаруживаются через 2--3 дня культивирования при 37 °С. Инфицированные клетки собирают и экстрагируют по методике, описанной ниже.

Культивирование клеток 293.

Данная линия была получена из клеток почки человеческого эмбриона после трансфекции их ДНК аденовируса типа 5, обработанной ультразвуком. Как выяснилось, в клетках 293 довольно хорошо размножаются кишечные аденовирусы, которые не удается культивировать в других известных клеточных линиях человека. Клетки 293 растят в монослойной культуре, в обычной культуральной среде, содержащей 10% СНТ. Культуры рассевают по стандартной методике, используя смесь трипсина с версеном. Клетки 293, как правило, не образуют плотного монослоя, довольно гетерогенны по своей морфологии и имеют ряд характерных свойств, присущих трансформированным клеткам. Добавляя в культуральную среду ЭТС, удается получить относительно плотный монослой клеток, который необходим при тестировании вируса методом бляшек. Клетки 293, как правило, лучше растут на посуде из пластика.

1.3 Вирусы других видов

Первичные или вторичные культуры эмбриональных клеток или клеток почки соответствующих видов животных наиболее удобны при культивировании аденовирусов.

Аденовирусы обезьян

Наиболее чувствительны к аденовирусам обезьян первичные или вторичные культуры клеток почки зеленой мартышки Сег-copithecus aethiops. Кроме того, имеются сообщения об успешном размножении этих вирусов в клетках некоторых линий человека, например Нер-2.

Аденовирусы мышей

Для размножения этих вирусов широко используют культуры ткани мышиных эмбрионов. Имеются сведения об эффективном размножении мышиных аденовирусов в клетках линии ЗТЗ.

Аденовирусы крупного рогатого скота

Для выращивания этих вирусов используют клеточные линии почки и яичника коров.

Аденовирусы птиц

Данные вирусы хорошо размножаются в тканевых культурах куриной печени, почки и селезенки.

2. Очистка

Созревание аденовирусов происходит в ядрах зараженных клеток. Вирусы этой группы выходят в цитоплазму и культуральную среду, разрушая клетки. Таким образом, как правило, большая часть вируса ассоциирована с клеткой, и эффективность высвобождения вируса из ядерного и клеточного материала зависит от степени разрушения ядерных мембран. В клетках, зараженных вирусом, ядерные мембраны довольно хрупкие, поэтому на поздних стадиях инфекции вирус легко переходит в цитоплазму. Существует множество методов разрушения клеток. Выбор того или иного метода для каждого конкретного случая зависит от количества и природы клеток, подлежащих экстракции. Предлагаемый нами метод удобен для очистки аденовируса 5 типа.

2.1 Экстракция инфицированных клеток

1. Инфицированные клетки осаждают центрифугированием и ресуспендируют в небольшом объеме фосфатного буфера. На 2-10⁷ клеток используют 1 мл буфера. Суспензию инфицированных клеток, полученную на этой стадии, удобно хранить при --70 °С.

2. Суспензию клеток гомогенизируют в высокооборотном смесителе на ледяной бане примерно 1 мин в равном объеме фтористого углерода. При этом происходят разрушение клеток и денатурация многих клеточных белков, хотя вирусные частицы остаются неповрежденными. Могут быть использованы и другие методы разрушения клеток. Выбор того или иного метода гомогенизации определяется многими факторами, например такими, как объем клеточной суспензии.

3. Экстракт центрифугируют 5 мин при 500 g. В дальнейшей работе используют водную фракцию, которая в случае хорошего выхода вируса должна опалесцировать. Фракцию фтористого углерода и интерфазу, содержащую разрушенный клеточный материал, можно повторно экстрагировать равным объемом свежего буфера. Обе водные фракции затем объединяют. Проводить экстракцию более чем два раза, как правило, не имеет смысла.

2.2 Очистка вируса из экстрактов инфицированных клеток

Водную фракцию, полученную после экстракции клеток фтористым углеродом, аккуратно наслаивают на ступенчатый градиент хлорида цезия, приготовленный в 5-мл центрифужных пробирках. Градиент центрифугируют 90 мин при 90 000 g. При больших объемах вируссодержащего экстракта градиент готовят в 15-мл пробирках. Центрифугирование в этом случае продолжают 2 ч при 90 000 g. Плотность растворов CsCl можно определить, измеряя их коэффициенты преломления рефрактометром Аббе и пользуясь следующим соотношением: Р25= 10,8661 n_D--13,4974, где Р25 -- плотность при 25 °С, а по -- коэффициент преломления.

При скоростном центрифугировании в указанном выше режиме вирус собирается в интерфазе между двумя растворами разной плотности и может быть обнаружен визуально по опалесценции. Другие полосы, расположенные выше, соответствуют «растворимым» антигенам -- избытку структурных компонентов вируса. При центрифугировании некоторых образцов непосредственно над вирусной полосой обнаруживается полоса дефектного, или «пустого», вируса. Зону, содержащую вирус, можно отобрать несколькими методами, например прокалывая пробирку сбоку или снизу. Наиболее удобно и экономично фракционирование градиента с помощью перистальтического насоса. Фракцию, содержащую вирус, идентифицируют по опалесценции.

Вирус, полученный этим методом, загрязнен клеточными компонентами. Для освобождения от них необходима дополнительная очистка равновесным центрифугированием.

Фракцию, содержащую вирус, разводят в соотношении 2: 1 трис-ЭДТА буфером. Разведенную фракцию наслаивают на пре-формированный ступенчатый градиент CsCl, состоящий из 1,5 мл раствора плотностью 1,33 г/мл и 1 мл раствора плотностью 1,45 г/мл. Градиент готовят в 5-мл пробирке. Центрифугируют 18 ч при 100 000 g. Опалесцирующая полоса, содержащая вирус, формируется в зоне плотностью 1,34--1,35 г/мл. «Растворимые» антигены уравновешиваются при более низкой плотности-- примерно при 1,3 г/мл.

2.3 Свойства очищенного вируса

Очищенный вирус, находящийся в суспензии, опалесцирует. Он может храниться в гипертоническом растворе CsCl при 4°С около 4--5 дней. Не рекомендуется проводить диализ против гипотонических буферов, поскольку при этом возможны агрегация и распад вирусных частиц. Замену буфера следует проводить при помощи гель-фильтрации только что очищенного вируса, используя сефадекс марки G-25 или G-50 и соответствующий буфер. В изотоническом или гипотоническом буфере вирус практически нестабилен. Некоторого увеличения стабильности можно добиться добавлением сахарозы или глицерина.

3. Титрование вируса

Из множества методов, применяемых для титрования аденовирусов, мы опишем три следующих: титрование вируса методом бляшек, титрование вируса по ЦПД определением конечной точки и метод флуоресцирующих фокусов.

3.1 Титрование вируса методом бляшек

1. Для получения монослоя за день до постановки эксперимента высевают примерно по 2-10⁶ клеток HeLa на чашки Петри диаметром 50 мм.

2. Готовят последовательные логарифмические разведения вируса на бессывороточной среде. Аликвоты каждого разведения вносят в три чашки, предварительно удалив из них куль-туральную среду.

3. Клетки инкубируют с вирусом около 90 мин при 37°С. После окончания инкубации супернатант удаляют и монослой заливают средой с агаром, приготовленной по следующей прописи:

На 100 мл среды: 20 мл 2,5%-ного водного раствора агара Нобль 20 мл пятикратной среды; 10 мл триптозофосфатного бульона 9 мл бикарбоната натрия 2 мл СНТ 2 мл 1 М MgCI₂

По 100 ед. пенициллина и стрептомицина 2 мл глутамина Воды до 100 мл Расплавляют агар, а затем охлаждают его до 50°С. Остальные компоненты среды перемешивают друг с другом, подогревают до 42 °С и добавляют к агару, устанавливая температуру 45 °С. В каждую чашку наливают по 5 мл приготовленной среды и охлаждают до затвердения агара. Чашки инкубируют при 37°С в течение 4 дней в атмосфере 5%-ного С0₂.

4. Через 4 дня добавляют еще 5 мл среды с агаром и продолжают инкубацию еще в течение 4--5 дней. Как правило, бляшки формируются к концу этого срока. Они становятся видимыми после фиксации и окрашивания.

Для титрования аденовирусов методом бляшек клеточный монослой должен оставаться интактным на протяжении 8--10 дней культивирования; поэтому в данном случае особое значение имеет состояние используемых клеток. Например, клетки, зараженные микоплазмой, не образуют стабильного монослоя и поэтому не пригодны для данного метода. Точность подсчета зависит от количества бляшек; идеальные результаты получают, если на каждой чашке Петри сформировалось 20--50 бляшек.

5. Клетки фиксируют 10 мин раствором формалина, а затем окрашивают 5 мин кристаллическим фиолетовым. При необходимости монослой может быть окрашен витальным красителем нейтральным красным. В этом случае на четвертый день необходимо нанести только 3 мл агарового покрытия.

3.2 Титрование вируса по ЦПД определением конечной точки

1. В лунки 96-луночного планшета для микротитрования разливают по 100 мкл среды с 0,5% ТС. Аликвоты каждого разведения вируса вносят в три лунки.

2. В каждую лунку добавляют по 100 мкл суспензии клеток HeLa, снятых с монослоя, в той же среде с ТС. Планшеты инкубируют 3--4 дня при 37°С в атмосфере 5%-но-го С0₂.

3. Для выявления ЦПД планшет просматривают под микроскопом. Зная кратность разведений, определяют титр вируса по тому разведению, которое вызывает 50% ЦПД. Увеличивая время инкубации, можно повысить и чувствительность метода. Для достижения максимальной чувствительности следует увеличить время титрования до нескольких недель, добавляя свежие порции среды и при необходимости полностью заменяя среду. Во всех случаях необходимо просматривать неинфицированные культуры под микроскопом. Клетки фиксируют, окрашивают, как описано выше, и определяют титр визуально. В литературе описан автоматический метод определения ЦПД.

3.3 Метод флуоресцирующих фокусов

1. В 96-луночном планшете для культивирования клеток готовят разведения вируса на среде с 0,5% СНТ. Конечный объем каждого разведения должен составлять 100 мкл. Аликвоты каждого разведения вируса вносят в три лунки.

2. В каждую лунку добавляют равный объем суспензии снятых с монослоя клеток HeLa в той же среде с ТС. Планшет инкубируют в атмосфере 5%-ного С0₂ при 37 °С около 30 ч.

3. Закончив инкубацию, среду из лунок аккуратно отсасывают, клетки фиксируют 5 мин в ледяном 1%-ном формалине с 2% сахарозы.

4. Клетки осторожно промывают PBS, а затем в каждую лунку добавляют по 10 мкл антивирусных антител, разведенных в PBS до нужной концентрации. В работе можно использовать мышиные моноклональные антитела или поликлональные антитела к очищенным вирусным компонентам, например гексонам. В последнем случае необходима предварительная адсорбция сыворотки клетками HeLa.

5. Планшет инкубируют 30 мин при 37°С во влажной атмосфере, а затем из каждой лунки осторожно отсасывают антитела. Каждую лунку трижды промывают PBS и добавляют в них по 10 мкл разбавленных, конъюгированных с флуоресцеином антител против мышиных иммуноглобулинов. Флуоресцирующая сыворотка должна быть предварительно адсорбирована клетками HeLa. Для этого отмытую суспензию клеток HeLa инкубируют 18 ч на холоду с флуоресцирующими антителами в присутствии ингибиторов протеаз. Готовые для работы антитела, не дающие фоновой флуоресценции, получают центрифугированием инкубационной смеси и фильтрацией супернатанта через нитроцеллюлозный фильтр с диаметром пор 300 мкм.

6. Планшет повторно инкубируют 30 мин во влажной атмосфере при 37 °С. Затем флуоресцирующие антитела удаляют и трижды промывают каждую лунку PBS.

7. Лунки исследуют под инвертированным флуоресцирующим микроскопом. Титр вируса можно определить, если правильно выбрано время фиксации культур. В оптимальном случае в культуре должны наблюдаться одиночные фокусы флуоресценции при отсутствии выраженной вторичной инфекции. Основы этого метода предложены Филипсоном.

Наиболее точным методом титрования, несомненно, является метод бляшек. Однако он предполагает сохранение стабильного монослоя клеток при длительном культивировании. Метод титрования вируса по ЦПД определением конечной точки, вероятно, наиболее прост в исполнении и достаточно чувствителен. В большинстве случаев можно ограничиться использованием этого метода. Метод флуоресцирующих фокусов, хотя и занимает меньше всего времени, однако требует большого количества реактивов и предварительного определения оптимального срока для подсчета фокусов первичной инфекции.