Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ

Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ

Введение

В последние годы в качестве стандартного метода определения различных соединений в клинической химии все большее распространение получает иммуноаиализ, отличающийся хорошей чувствительностью, специфичностью и широкой сферой применения. В частности, иммуноаиализ применяют для определения гормонов, лекарственных препаратов, наркотиков, белков и низкомолекулярных органических загрязняющих веществ. Наиболее чувствительны методики радиоиммуноанализа, однако они обладают рядом недостатков. Радиация опасна для здоровья, и поэтому при проведении РИА в лаборатории необходимы особые меры предосторожности. Кроме того, в РИА усложнена стандартизация, так как срок пригодности наборов РИА зависит от периода полураспада радиоактивной метки. Наконец, для РИА необходимы специальные реагенты и дорогие счетчики сцинтилляции.

По указанным причинам разрабатываются альтернативные методы иммуноанализа, не требующие радиоактивных изотопов. К числу таких альтернативных методов относятся:

иммуноферментный анализ, твердофазный ИФА типа ELISA или гомогенный ИФА типа EMIT;

флуоресцентный иммуноаиализ, базирующийся на измерении усиления, гашения или поляризации флуоресценции или на изучении флуоресценции с разрешением во времени;

био- или хемилюминесцентный иммуноаиализ.

ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ ИММУНОАНАЛИЗ

Чувствительность измерения флуоресценции в принципе очень высока. Способные флуоресцировать молекулы поглощают I свет, который переводит их из основного электронного состояния S₀ в электронно-возбужденные состояния Sj, S₂ и т.д. Молекулы могут терять полученную избыточную энергию несколькими путями:

без излучения, за счет соударений или выделения тепла;

путем непосредственного перехода в состояние S₀ и связанного с этим излучения;

3) путем перехода в состояние S₀ через промежуточное трип-летное состояние Tjj соответствующее излучение называют фосфоресценцией.

Так как между поглощением и выделением энергии некоторое количество энергии теряется, то максимумы длин волн поглощения и испускания света различаются, а соответствующую разность называют стоксовым сдвигом. Для спектров флуоресценции этот сдвиг обычно равен 10-50 нм, тогда как в спектрах фосфоресценции наблюдается значительно больший сдвиг, который в случае хелатов редкоземельных элементов может превышать 200 нм.

Отношение количества испускаемой энергии к количеству поглощенной энергии называют квантовым выходом, который для таких высокофлуоресцирующих молекул, как флурресцеин, равен 0,85. Этим объясняется тот факт, что в чистой водб предел обнаружения флуоресцеина составляет около 0,5*10~¹⁴ моль/л. Однако на практике чувствительность определения флуоресцеина составляет 10"⁹ - 10*¹² моль/л, что обусловлено высоким уровнем фона биологического материала, присутствием эндогенных гасителей сигнала, а также зависимостью квантового выхода флуоресценции от температуры и характеристик растворителя, например от рН и полярности.

2.Основные задачи флуоресцентного иммуноанализа

Одной из главных задач иммуноанализа является разработка простых гомогенных методик, выгодно отличающихся от традиционных гетерогенных'. Последние включают операцию разделения свободных антигенов от связанных с антителами; эта операция увеличивает продолжительность анализа и может быть источником ошибок. Другой целью новых методик иммуноанализа является ускорение достижения равновесия в системе, что сокращает время, необходимое для проведения анализа. Одно из основных преимуществ флуоресцентного иммуноанализа связано с возможностью определения самых разнообразных веществ.

Хотя в последние годы опубликовано немало статей, описывающих преимущества ФИА, соответствующие наборы и приборы стали выпускать в промышленном масштабе только недавно. Флуоресцентные метки значительно дешевле изотопных, срок годности наборов ФИА намного больше, чем наборов РИА, а флуоресценцию можно измерять на простых флуориметрах. Многие достоинства ФИА свойственны и методам ИФА. Главный недостаток ИФА связан со способом измерения результата анализа, а именно с необходимостью дополнительной операции определения активности фермента с помощью соответствующего субстрата. Эта операция усложняет и замедляет анализ и в принципе может снижать точность результата. Кроме того, биологические образцы часто содержат ферменты, активность которых близка к активности ферментной метки. На результат анализа могут влиять и другие факторы, например присутствие в пробах ингибиторов фермента.

3. ПОЛЯРИЗАЦИОННЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ ИММУНОАНАЛИЗ

Вскоре после появления основополагающей работы Вебера поляризация флуоресценции стала все шире применяться в изучении биологических систем. Это физическое явление используется для разнообразных целей, включая: 1) изучение вращения и размеров молекул в растворах; 2)изучение ассоциации и межмолекулярного взаимодействия белков; 3)применение мембранных зондов; 4)иммунохимические исследования.

Прежде -чем перейти к поляризационному флуоресцентному иммуноанализу, полезно обсудить некоторые теоретические основы метода. Так как эти вопросы хорошо освещены в литературе, то здесь мы рассмотрим только основные принципы.

Принципы. Поляризация флуоресценции обусловлена определенной взаимосвязью между ориентацией молекул и поглощением и испусканием ими света. В процессе возбуждения флуоресценции специфические центры молекул, связанные с поглощением и испусканием квантов света, становятся осциллирующими электрическими диполями; их называют осцилляторами поглощения и эмиссии соответственно. В растворе неупорядоченно ориентированных флуоресцирующих молекул поляризованный свет будут предпочтительно поглощать те молекулы, осцилляторы поглощения которых параллельны плоскости поляризации. В возбужденной молекуле осцилляторы эмиссии будут определять поляризацию флуоресценции, и если молекула в момент эмиссии относительно устойчива и не меняет свою ориентацию в пространстве, то эмиссия флуоресценции также будет частично поляризована. Степень поляризации зависит от многих факторов и описывается уравнением Перрена

где Р - наблюдаемая поляризация, Р₀ - максимальная поляризация, R - газовая постоянная, Т - абсолютная температура, п - вязкость растворителя, t - среднее время жизни молекулы в возбужденном состоянии, V - молярный объем флуоресцирующего вещества.

Если возбуждение флуоресценции происходит в диапазоне главной полосы поглощения и энергия не теряется в результате межмолекулярных взаимодействий, то степень поляризации флуоресценции зависит от броуновского движения. Маленькие молекулы в водной среде вращаются очень быстро и между поглощением и эмиссией равновероятно принимают любую ориентацию, что приводит к полной деполяризации сигнала эмиссии. Так, в водном растворе флуоресценция флуоресцеина практически неполяризова-на, однако при повышении вязкости раствора степень ее поляризации возрастает.,

Большие молекулы и при эмиссии частично сохраняют ту же молекулярную ориентацию, которую они имели при поглощении света, поэтому их флуоресценция поляризована. Если такие молекулы ассоциированы в молекулярный комплекс, то степень поляризации флуоресценции возрастает. Так как в поляризации флуоресценции важную роль играют размер и форма молекул, то это явление особенно полезно при контроле реакций антиген-антитело. Как показано на рис. 1, когда маленькая молекула антигена, меченного флуоресцентной меткой, образует комплекс с большой молекулой антитела, то вращение флуоресцентной метки замедляется и поляризация флуоресценции возрастает.

Флуоресцентные метки. Степень изменения поляризации флуоресценции зависит от метки, среднего времени жизни молекулы в возбужденном состоянии, молекулярной массы антигена и природы комплекса. Считается, что молекулярная масса комплекса не должна превышать 20 ООО. Среднее время жизни молекулы в возбужденном состоянии примерно, равно среднему времени релаксации антигена, которое составляет несколько наносекунд. Однако при измерении подвижности мембранных белков метка должна существовать в возбужденном состоянии намного дольше, так как время вращательной релаксации таких белков лежит в диапазоне миллисекунд. Время жизни триплетного состояния сравнимо с временем вращательной релаксации мембранных белков, поэтому последние рекомендовалось изучать с помощью деполяризации фосфоресценции. При разработке методик ФИА выбор флуоресцентной метки имеет ключевое значение. В принципе метка должна обладать следующими качествами: 1) иметь высокую интенсивность флуоресценции, т.е. высокий квантовый выход и большой коэффициент экстинкции; 2)быть химически и фотоустойчивой в условиях анализа; 3)легко связываться с антигеном и не мешать протеканию реакции антиген-антитело.

Чтобы присутствующие в пробе эндогенные флуоресцентные гасители не мешали определению, их длины волн возбуждения и эмиссии должны отличаться от длин волн флуоресцентной метки. Кроме того, для снижения влияния рассеяния света метка должна иметь большой стоксов сдвиг.

Хотя стоксов сдвиг флуоресцеина невелик и поэтому флуоресцеиновая метка весьма чувствительна к рассеянию света, ее чаще всего применяют для определения соединений, циркулирующих в организме в концентрациях порядка мкмоль/л. Как показано на рис. 2, флуоресцеин характеризуется также большим изменением поляризации излучаемого света и в силу этого особенно пригоден для поляризационного флуоресцентного иммуноанализа. Известны несколько методов сшивки флуоресцеина с

другими молекулами; чаще всего для этой цели применяют флуо-ресцеинизотиоцианат.

Измерение поляризации флуоресценции. Как показано на рис. 3, флуоресцирующий раствор возбуждают светом, поляризованным в вертикальной плоскости, а эмиссию флуоресценции измеряют в перпендикулярном по отношению к лучу возбуждения направлении с помощью второго поляризатора, у которого плоскость поляризации может быть расположена или вертикально, или горизонтально. Степень поляризации Р можно описать следующим уравнением:

где 1у - вертикальная составляющая, a I_h - горизонтальная составляющая флуоресценции.

Чувствительность флуориметров по отношению к вертикально и горизонтально поляризованной флуоресценции может быть различной; это различие компенсируется экспериментально определяемым поправочным коэффициентом G:

При измерении интенсивности флуоресценции в ПФИА поляризация Р изменяется от 0 до 0,5. В расчетах удобнее применять не Р, а в 1000 раз большую величину шР:

mP - 1000Р

Применение. Впервые ПФИА применили при изучении антител против пенициллина. Эти работы вскоре были развиты Спенсером и др., которые описали принцип и конструкцию автоматической проточной ячейки поляриметра, предназначенной для определения аититрипсина в сыворотке с помощью ингибироваиия фермента, а также инсулина и антител к инсулину с помощью реакции антиген-антитело. В применявшемся этими исследователями поляриметре секторное зеркало попеременно направляет на пробу горизонтально или вертикально поляризованный свет возбуждения. Вертикально поляризованное излучение анализируется третьим поляризатором. Описан цифровой флуоресцентный поляриметр с чувствительностью 2 * 10-13 М флуоресцеи-иа. В клинической диагностике ПФИА впервые был применен для количественного определения гентамицина, а затем и фе-иитоина. Гентамиции метили с помощью ФИТЦ и определяли в виде флуоресцеинтиокарбамилгентамицина, конечная концентрация которого после разбавления пробы и добавления антисыворотки была равна приблизительно 10-8 моль /л. Влияние других компонентов пробы на сигнал поляризации флуоресценции было невелико, и поэтому ие было необходимости проводить корректировку сигнала по бланковому раствору. Иммунологическая реакция достигает равновесия через 2 мин при 25»С.

В 1981 г. Джолли и др. описали общую методику определения амииогликозидов в сыворотке и плазме. В этой методике;

гентамицин, тобрамицин и амикацин метят 5-флуоресцеииом, инкубируют в течение 15 мин с пробой и антисывороткой и измеряют степень поляризации флуоресценции с помощью автоматического флуориметра. Позже появился целый ряд наборов для определения лекарственных препаратов с помощью ПФИА. Обычно образец смешивают с меченым антигеном, затем добавляют антитела против определяемого вещества. Немеченый определяемый лекарственный препарат из пробы конкурирует с меченым антигеном за связывание с антителами. Затем измеряют поляризацию флуоресценции смеси без ее разделения. Чем большее количество определяемого вещества содержится в пробе, тем меньшее количество меченого антигена свяжется с антителами и тем меньше будет общая поляризаций флуоресценции смеси. Показано, что предварительное смешение меченого антигена и антитела в один реагент позволяет еще более упростить и ускорить анализ. Кроме того, такой смешанный реагент очень устойчив и не изменяет своих свойств через 6 мес хранения при 4°С. По достижении равновесия величина поляризации флуоресценции сохраняется иа одном уровне почти неограниченно долго.

В иммуиохимической системе типа

где AgL - свободный меченый антиген, АЬ - антитело и AgL:Ab -их комплекс, существует равновесие между антигеном, который постоянно связывается с антителами. В соответствии с законом действующих масс константу связывания или аффинности К_а определяют следующим образом:

где ki и к₂ -' константы скорости прямой и обратной реакции соответственно.

Если в такую систему добавить немеченый антиген, ои будет конкурировать за связывание с любым центром связывания антител, который освобождается молекулой меченого антигена. Степень связывания последнего будет уменьшаться во времени в силу его диссоциации, осуществляющейся по первому порядку. Уменьшение количества связанного меченого ан-гигеиа и, следовательно, снижение поляризации флуоресценции зависят от количества добавленного немеченого антигена. Если константа аффинности- антител равна примерно 10⁹ л /моль, то печеный антиген диссоциирует быстро, т.е. константа к₂ высока. В случае антисыворотки против фенобарбитала поляризация флуоресценции уменьшалась вдвое за 63 с. Той же группой исследователей описаны методики ПФИА с одним смешанным реагентом для определения амфетамина в моче и бензоилэкгонина.

В указанных методиках 10 мкл мочи добавляют к 1,5 мл соответствующего смешанного реагента и после установления равновесия измеряют поляризацию флуоресценции. Поляризационный флуориметр LS-20 фирмы Perkin-Elmer в сочетании с приспособлением для автоматического забора образцов позволяет автоматизировать такие анализы.

Как показано на рис. 5, источником света в этом приборе является импульсная ксеноновая лампа, причем небольшая доля света направлена на фотодиод, генерирующий сигнал сравнения. Необходимый диапазон длин волн обеспечивает фильтр возбуждения, а поляризатор выделяет свет, поляризованный в вертикальной плоскости. Затем луч фокусируется эллипсоидным зеркалом на пробе, находящейся в проточной кювете объемом 7 мкл. Излучаемый пробой свет фокусируется вторым эллипсоидным зеркалом с помощью отсекающего фильтра на щели. Свет, прошедший через щель, проходит через поляризатор и дважды детектируется фотоумножителем: один раз под углом 0° и второй - под углом 90°. В рассчитываемой^!

i

величине mP учитывается коэффициент G прибора, который в этом случае очень близок к 1,00.

В анализах такого типа при отсутствии или очень низкой концентрации лекарственного препарата в пробе большая часть меченного ФИТЦ лекарственного препарата связывается антителами, что приводит к высоким значениям mP. При увеличении концентрации определяемого вещества в пробе наблюдаемая поляризация флуоресценции уменьшается. Компьютер прибора сравнивает найденную величину шР пробы с соответствующими величинами стандартных образцов; результаты сравнения регистрируются принтером. Обычно граничная концентрация между положительным и отрицательным результатами анализа равна 1 мг/л, что соответствует величинам, рекомендуемым другими исследователями.

С помощью описанной системы исследовано большое число образцов мочи; полученные результаты очень хорошо согласуются с данными,- найденными другими методами, в том числе тонкослойной хроматографией, газожидкостной хроматографией и гомогенным иммуноферментным анализом типа EMIT. В табл. 3 представлены основные характеристики методик ПФИА для определения некоторых веществ, выполняемых на приборах PFI-20 фирмы Perkin-Elmer и TDx фирмы Abbott.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Безразделительный поляризационный флуоресцентный иммуноаиализ имеет следующие основные преимущества:

- методики очень просты, а для получения результата достаточно 2-5 мин;

- срок хранения меченых реагентов и антител обычно не ограничен;

- весь анализ легко поддается автоматизации;

- ложные положительные и ложные отрицательные результаты в методиках ПФИА менее вероятны, чем в методиках других типов.

Хотя методики ПФИА менее чувствительны по сравнению с некоторыми другими типами неизотопного иммуноанализа, довольно большое число веществ, представляющих интерес в клинической практике или исследовательской работе, целесообразно определять с помощью простых и быстрых методик ПФИА.