Носители и реактивы

Реферат:

Носители и реактивы

ВВЕДЕНИЕ

Твердофазные иммунореагенты вначале использовали для выделения антигенов и антител. Впоследствии иммобилизованные антитела применили для радиоиммуноанализа белков [1, 2] и гапте-нов [3,4 ], где с их помощью удалось упростить разделение свободного и связанного с антителами определяемого вещества. Реагенты (антитела или антигены) связывали с носителем или ковалентно, или с помощью пассивной адсорбции. Ковалентное связывание требует проведения химических реакций и тщательной очистки готового продукта. Связывание путем пассивной адсорбции занимает много времени, а полученные таким способом реагенты сложно использовать в конкурентном анализе, когда иммобилизованный реагент должен присутствовать в строго определенной и постоянной концентрации. Из-за указанных трудностей более удобным оказался жидкофазный радиоиммуноанализ.

Ситуация резко изменилась после введения неизотопных меток для регистрации реакции антиген - антитело [5 ], и особенно после применения моноклональных антител в двухцентровом иммунометрическом анализе белков [6 ]. Необходимость создания высокочувствительных методов иммуноанализа для научных исследований, а также более простых методик для проведения анализов в поликлиниках, полевых условиях и для самодиагностики также содействовала бурному развитию твердофазных методов. Носители, применяемые в этих анализах, могут быть выполнены в виде трубок, шариков, мелких гранул, микропланшетов, полосок, пленок и электродов.

1. МАТЕРИАЛЫ

В качестве носителей используют как неорганические, так и органические материалы. К числу первых относятся различные оксиды металлов, кварц и пористые стекла. Примером носителей второго типа являются полипропилен, поликарбонат, полиметак-рилат, найлон, нитроцеллюлоза и кремнийорганические полимеры. В этой главе в основном будет рассмотрено использование микропланшетов и полосок, изготовляемых из поливинилхлорида (ПВХ) или полистирола (ПС). Оба вещества являются полимерами производных этилена. В ПС водород при одном углеродном атоме этилена замещен на фенильную группу, а в ПВХ - на хлор. Структуры этих полимеров представлены на рис.1.

Полистирол благодаря его оптической прозрачности, высокой связывающей способности, прочности и хорошей воспроизводимости свойств наиболее успешно используется в качестве носителя. Носители из него изготовляют с помощью литья под давлением, полимерные цепи при этом образуют неупорядоченную аморфную структуру. Свойства носителя определяются качеством исходного сырья, условиями процесса литья и способом обработки поверхности. Исходным материалам и технологическим операциям следует уделять особое внимание, чтобы получить конечный продукт, в наибольшей степени удовлетворяющий требованиям иммуноанализа.

2. ПУТЬ К ПОВЕРХНОСТИ ТВЕРДОЙ ФАЗЫ

Для того чтобы молекулы реагентов связались с носителем или ковалентно, или за счет физических сил (т.е. путем пассивной адсорбции), они должны достигнуть поверхности носителя. Перечислим наиболее важные взаимосвязанные факторы, определяющие эффективность пассивной адсорбции: 1) диффузионные характеристики (расстояние и скорость); 2) время инкубации; 3) температура реакционной смеси; 4) концентрация реагента; 5) вязкость раствора. Роль каждого фактора детально обсуждена в обзоре [7].

2.1 Диффузионные характеристики

Влияние этого фактора можно проиллюстрировать на примере адсорбции реагента на поверхности двух сосудов, выполненных из одинакового материала, но отличающихся по форме (рис..2). В меньшем сосуде время инкубации, необходимое для достижения максимальной адсорбции реагента на его стенках, будет меньше, чем в сосуде большего размера. Это объясняется скоростью диффузии, которая обратно пропорциональна размеру молекулы (точнее, ее гидродинамическому объему) и вязкости растворителя.

Кроме того, скорость адсорбции прямо пропорциональна отношению площади поверхности к объему раствора, поэтому при выборе формы носителей для иммуноа-нализа необходимо стремиться к тому, чтобы это отношение было как можно большим.

2.2 Время инкубации

Время является одной из важнейших переменных, определяющих эффективность процесса связывания. Как видно из данных, представленных на рис. 3, зависимость степени адсорбции антител на стенках лунок микропланшета от времени нелинейна. Для получения количественных характеристик процесса адсорбции через определенные промежутки времени в систему добавляли избыток антигена, меченного ферментом, далее микропланшет промывали, добавляли в лунки раствор субстрата и по завершении ферментативной реакции измеряли оптическую плотность раствора. Чем больше время инкубации, тем больше молекул реагента связывается с носителем; этот процесс продолжается до тех пор, пока не наступит насыщение твердой фазы или истощение раствора.

2.3 Температура реакционной смеси

Молекулярное движение не упорядочено, и число молекул реагента, достигающих поверхности, является функцией скорости их направленного движения и расстояния. При повышении температуры реакционной смеси скорость движения молекул возрастает. Большинство биомолекул стабильно при 37°С. Поэтому эта температура чаще всего используется для сокращения времени инкубации. Более высокие температуры могут вызвать денатурацию белков и связанные с этим погрешности результатов иммуноанализа. Другим недостатком инкубации при температуре выше 37°С является необходимость предварительного прогрева носителей до заданной температуры перед началом процесса сорбции. Если эту операцию исключить, то возникающий температурный градиент может оказывать сильное влияние на состояние границы раздела фаз, а тем самым и на скорость превращения субстрата. Подобные эффекты особенно заметны, если в качестве метки используется щелочная фосфатаза.

2.4 Концентрация реагентов

Адсорбция различных белков не зависит от их качественного состава, если только общая нагрузка не превышает сорбционной емкости твердой фазы [8 ], которая для большинства полистирольных микропланшетов и пробирок составляет около 4 мкг белка в 1 мл буферного раствора [7]. Количество связавшегося конкретного белка зависит от его сродства к поверхности материала. Кроме того, на обнаружение связанного определяемого вещества оказывают влияние пространственные факторы, причем возможны ситуации, когда присутствующие в анализируемом образце в небольших концентрациях примеси дают более сильный сигнал. Если используют растворы с очень низкими концентрациями реагентов, то для уменьшения фонового сигнала оставшиеся свободными центры на поверхности носителя необходимо блокировать каким-либо инертным веществом, не влияющим на реакцию антиген - антитело. Чаще всего для этих целей используют бычий сывороточный альбумин (БСА), желатин, сыворотки или детергенты.

2.5 Вязкость реакционной смеси

Если раствор имеет высокую вязкость, то молекулы реагентов будут двигаться медленнее. Буферный раствор, к которому добавлено 10% сыворотки, более вязок, чем такой же буферный раствор, не содержащий белков.

Из приведенных данных следует, что эффективное взаимодействие иммунореагентов с носителем обеспечивается, если выполнены следующие условия:

длина диффузионного пути минимальна;

концентрация сорбируемого реагента вплоть до насыщения поверхности носителя максимальна;

вязкость буферного раствора минимальна;

реакции осуществляются при максимально высоких температурах, не вызывающих денатурации белка; буферные растворы предварительно прогревают до той же температуры;

время инкубации определено заранее; перемешивание реакционной смеси сокращает продолжительность этой стадии.

3. СВЯЗЫВАНИЕ С НОСИТЕЛЕМ

Молекулы реагентов могут быть связаны с носителем двумя способами. Первый способ включает сшивку с помощью одной или нескольких ковалентных связей, второй - связывание за счет слабых многоточечных физических взаимодействий. Общие величины энергий связывания реагента с носителем в обоих способах могут оказаться сравнимыми, и на практике иногда трудно установить, какой способ реализуется в данном случае. Эффективность связывания в случае пассивной адсорбции определяется взаимодействием активных компонентов системы, т.е. природой твердого носителя, типом молекул и составом реакционной смеси. Адсорбция может происходить за счет вандерваальсовых и электростатических сил, водородных связей и гидрофобных взаимодействий.

3.1 Ковалентное и нековалентное связывание

В водных растворах полипептидная цепь белков уложена так, что на поверхности молекулы расположено максимально возможное число гидрофильных групп, а гидрофобные группы располагаются внутри белковой глобулы. В результате взаимодействия полярных и заряженных групп поверхности молекулы белка с противоположно заряженными частицами в растворе вокруг каждой молекулы образуется ионный слой, который называется гидродинамическим или двойным слоем Штерна (рис..4). Химический потенциал этого слоя называется зета-потенциалом и характеризует активность молекулы. Вблизи поверхности носителя, если она содержит полярные или заряженные группы, также образуется гидродинамический слой. Однако для сорбции белков используют гидрофобные матрицы, имеющие небольшое количество заряженных групп и соответственно низкий поверхностный потенциал.

Этот выбор обусловлен тем, что после связывания молекул на гидрофобной поверхности обычно не происходит их десорбции [9, 10 ], напротив, белки, сорбированные на гидрофильных поверхностях, могут быть десорбированы под воздействием экстремальных рН, высокой ионной силы или длительной промывки. Для связывания на гидрофобных носителях необходимо, чтобы на поверхности белка имелись гидрофобные области. Как правило, даже в высокогидрофильных белках на поверхности белковой глобулы всегда имеются гидрофобные домены.

Вторичная структура белка поддерживается за счет физических или химических взаимодействий между боковыми группами полипептидной цепи. При связывании с поверхностью носителя часть этих взаимодействий нарушается, в результате чего может произойти полная денатурация белка. С другой стороны, связывание отдельных сегментов молекулы с твердым носителем ограничивает ее подвижность, что должно приводить к стабилизации белковой глобулы. Действительно, белки, связанные с носителем, гораздо дольше сохраняют свою активность, чем в растворе. Связи, образовавшиеся при сорбции, делают молекулу белка более жесткой и менее подверженной морфологическим изменениям. Важную роль в стабилизации молекул играют вандерваальсовы взаимодействия, обусловленные появлением локализованных диполей в зоне контакта. Эти взаимодействия слабы, если молекулы реагента и поверхность носителя отдалены друг от друга, но их сила возрастает обратно пропорционально седьмой степени расстояния между ними.

3.2 Механизмы связывания

В настоящее время нельзя дать детальную картину процессов, происходящих в ходе адсорбции, хотя предложено несколько гипотез. В работах [11, 12] описаны некоторые этапы процесса адсорбции. Прежде всего при сближении с поверхностью носителя за счет переноса ионов или перекрывания электрических полей происходит перераспределение заряженных групп в молекуле реагента. Такая реорганизация позволяет преодолеть существующие силы отталкивания. На втором этапе за счет вандерваальсовых взаимодействий обеспечиваются дегидратация и связывание с поверхностью носителя. При сорбции каждой молекулы белка высвобождаются несколько молекул растворителя; это приводит к значительному увеличению энтропии, которая и может быть движущей силой пассивной адсорбции [13]. На последнем этапе происходит структурная перестройка адсорбированной молекулы реагента, степень которой зависит от числа водородных связей и ионных пар. Эта модель построена на базе изучения адсорбции только двух глобулярных белков (бычьей рибо-нуклеазы и сывороточного альбумина человека), однако можно полагать, что она справедлива и для процесса сорбции любых других белков.

Кантареро и др. [8] описали процесс связывания как две последовательные стадии. Вначале молекулы реагента связываются иа первичных центрах на поверхности полистирола. Все молекулы, имеющие сродство к носителю, связываются с ним до тех пор, пока их концентрация не достигнет точки насыщения связывающих центров. Далее будут адсорбироваться в основном молекулы с более высоким сродством к носителю! Вторая стадия представляет собой белок-белковые взаимодействия, которые наблюдаются только после того, как концентрация белковых молекул достигнет определенного уровня. Предположение о вторичном связывании основано на том экспериментальном факте, что дополнительное связывание меченных изотопами молекул может происходить и после того, как по данным иммуноанализа (см. разд. 3.2 и рис..3) уже достигнуто насыщение поверхности. Отметим, что эти вторичные взаимодействия не будут оказывать влияние на результаты иммуноанализа.

Для более детального выяснения механизма молекулярной адсорбции на твердых поверхностях необходимы дальнейшие исследования.

4. ТРЕБОВАНИЯ К НОСИТЕЛЯМ

Для того чтобы данный носитель можно было использовать в иммуноанализе, он должен удовлетворять следующим требованиям: 1) обладать высокой связывающей способностью по отношению к иммобилизуемому реагенту; 2) незначительно десорбировать реагент; 3) иметь низкий уровень неспецифического связывания; 4) обладать воспроизводимыми свойствами и характеристиками.

В зависимости от способа обработки поверхности применяемые в настоящее время для пассивной адсорбции полистирольные носители можно подразделить на три типа (табл. 1).

Тип X имеет гидрофобную неполярную поверхность, хорошо связывающую большинство белков и гликопротеинов. Полистирол типа Y представляет собой носитель с полярной гидрофобной поверхностью, получаемой окислением, например, под действием гамма-лучей. Оказалось, что такие поверхности лучше всего подходят для связывания гликопротеинов. Поверхность полистирола типа Z специально разработана для культивирования клеток ткани. Обычно поверхность полистирола этого типа заряжена отрицательно, хотя можно приготовить носитель и с положительными зарядами. Носители этого типа очень плохо связывают IgG, а связавшиеся молекулы легко десорбируются в растворах с более высокой ионной силой.

4.1 Полистирольные микропланшеты

В ряде экспериментов показаны различия в эффективности связывания белков разными типами полистирольных микропланшетов в идентичных (не всегда оптимальных) условиях.

Для этой цели использовали двухстадийный метод определения связывания IgG. На первом этапе IgG кролика (Dakopats) растворяли в солевом фосфатном буфере (СФБ) при рН 8,2 (или другом заданном рН). Аликвоты по 200 мкл добавляли в лунки и инкубировали в течение ночи при 20 °С. Лунки промывали три раза раствором СФБ с тритоном X-100 (рН 7,2) (СФБТ) и свободные центры связывания блокировали 0,5%-ным раствором БСА в СФБ. Далее в каждую лунку добавляли антитела свиньи против IgG кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена (Dakopats, 2,4 мкг/мл в СФБ, рН 7,2), и инкубировали 4 ч при 20 °С. Избыток конъюгата удаляли трехкратной промывкой раствором СФБТ. Для обнаружения связавшихся антител использовали цветную реакцию с пероксидом водорода и орто-фенилдиамином. Оптическую плотность в лунках измеряли с помощью фотометра NJ-2000 ImmunoReader (Jasco).

Результаты определения связывающей способности трех типов полистирола представлены на рис..5. Нетрудно видеть, что наибольшим сродством к IgG кролика обладает полистирол типа А.

На рис..6 представлены результаты изучения связывающей способности трех типов полистирола после их обработки гамма-лучами. Во всех трех случаях наблюдается существенное увеличение сродства белков к носителю.

Влияние рН на связывание белков с полистролами X, Y и Z продемонстрировано на рис. 7, 8 и 9 соответственно. Сорбирующая способность полистирола X, имеющего гидрофобную поверхность, сильно зависит от рН и ионной силы раствора (рис. 7). Оптимальные результаты были получены при использовании буферного раствора с низкой ионной силой и рН, соответствующим изоэлектрической точке белка. Связывающая способность полистирола Y гораздо менее чувствительна к изменению рН и ионной силы буферного раствора (рис. 8). Оптимальная сорбция наблюдалась в буферном растворе, рН которого немного выше изо-электрической точки связываемой молекулы белка. В случае полистирола типа Z молекулы иммуноглобулинов могут связываться с его отрицательно заряженной поверхностью в буферных растворах с рН ниже их изоэлектрической точки (рис. 9).

Однако они легко смываются, если использовать растворы с более высокой ионной силой. Поэтому этот тип полистирола редко используется в имму-ноанализе.

4.2 Ковалентное связывание

Поверхность носителя можно модифицировать и для ковалентного связывания. Описано несколько методов связывания реагентов с амино- или карбоксильными группами носителя с помощью глутарового альдегида, водорастворимых карбодиимидов, суберимидатов и других бифункциональных реагентов [1-19]. Однако эти методы дают несогласующиеся результаты. Кроме того, для широкого использования в имму-ноанализе необходимы дальнейшие поиски путей повышения их чувствительности и специфичности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для связывания иммунореагентов можно использовать большое число неорганических и органических носителей, имеющих самую различную форму. Наиболее детально исследован процесс пассивной адсорбции иммуноглобулинов на поверхности полисти-рольных микропланшетов и трубок. Хотя природа механизма связывания до конца ие выяснена, известно, что ряд факторов, таких, как рН, ионная сила, температура, продолжительность процесса, вязкость и свойства самого носителя, оказывают существенное влияние на точность и воспроизводимость иммунометрического анализа. Для получения оптимальных результатов необходимо очень тщательно подбирать все вышеперечисленные параметры.

В настоящее время иммуноглобулины можно эффективно связывать на имеющихся в продаже полистирольных носителях нескольких типов. Дальнейшие усилия должны быть направлены на получение высокоспецифичных носителей, селективно связывающих другие типы молекул.