- 5 -

На правах рукописи

ИСЕЕВА

Елена Анатольевна

МорфофункциональнАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ПИЩЕВОДА

ПРИ ВВЕДЕНИИ ЦИТОСТАТИКОВ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

2007

Работа выполнена на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И.П.Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Быков Владимир Лазаревич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Чумасов Евгений Иванович

доктор медицинских наук, профессор

Верин Владимир Константинович

Ведущее учреждение - Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ярославская государственная меди-цинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится «______»__________2007 г. в______ часов на заседании диссертационного совета Д 208. 087. 01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

(194100, Санкт - Петербург, Литовская ул., д. 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «СПб ГПМА Росздрава» (194100, Санкт - Петербург, Кантемировская ул., д. 16.)

Автореферат разослан «_______»___________2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Н.Р. Карелина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Цитостатическая терапия, широко применяемая для лечения злокачественных новообразований, аутоиммунных заболеваний и в трансплантологии [Леонтьева Т.И., 1979; Colvin O.M., 2003; Eisen H.J., 2005], сопряжена с развитием осложнений, связанных с повреждающим действием цитостатиков на различные ткани и органы, в частности, на слизистые оболочки [Власова Н.А., 1980; Волкова М.А. и др., 1988; Bensadoun R.J. et al., 2006; Bultzigslowen I., Jontell M., 1999; Chen Y. et al., 2000; Kokkonen J. et al., 2002; Sonis S.T., Fey E.G., 2002]. Из органов пищеварительного тракта наибольшее внимание в литературе уделено изменениям, вызванным цитостатиками в сли-зистой оболочке тонкой кишки [Ijiri K. et al., 1987; Ramadan A.A. et al., 1992; Ypsilantis P. et al., 2004;], а также ротовой полости [Blijlevens N.M. et al., 2004; Herlofson B.B. et al., 1997; Schubert M.M. et al., 1992; Squier C.A. 1990]. Между тем, клинические наблюдения свидетельствуют о закономерном возникновении у больных, получавших цитостатическую терапию, ряда заболеваний пищевода: описано частое развитие эзофагитов, как микробных, так и неинфекционных, в отдельных случаях отмечена метаплазия эпителия пищевода [Albertsson M. et al., 1990; Bardosi A., 1980; Dahms В.В. et al., 1987; O'Morchoe P.J. et al., 1983; Peters F.T. et al., 1993; Sartori S. et al. 1991; Spechler S.J., 1991]. Тканевые и клеточные механизмы этих осложнений остаются мало изученными, а проведенные морфо-логические исследования влияния цитостатической терапии на состояние слизис-той оболочки пищевода единичны и фрагментарны и имеют, главным образом, диагностическую направленность [Albertsson M. et al., 1987,1990, 1992; Azuma T., 2006; Sons H.U. et al., 1987; Svobodovda D. et al., 2007; Werner-Wasik M., 2005; Yakoub-Agha I. et al., 2000]. Как правило, в этих исследованиях не учитываются взаимодействия различных тканей в ответной реакции на введение цитостатических препаратов. Данные о степени обратимости наблюдаемых изменений после отмены цитостатиков отсутствуют.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Комплексное экспериментальное изучение влияния цитостатика на морфофункциональные характеристики слизистой оболочки пищевода, а также оценка обратимости вызываемых цитостатиком изменений.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Морфофункциональная оценка состояния эпителия и собственной пластинки слизистой оболочки пищевода при кратковременном введении высоких доз цитостатика алкилирующего ряда циклофосфана (ЦФ) с использованием гистологических, морфометрических, гистохимических и иммуногистохимических методов;

2. Морфофункциональная оценка состояния эпителия и собственной пластинки слизистой оболочки пищевода в различные сроки после отмены цитостатика, кратковременно вводимого в высоких дозах.

3. Морфофункциональная оценка состояния эпителия и собственной пластинки слизистой оболочки пищевода при длительном введении умеренных доз цитостатика.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ. Впервые проведено комплексное гистологическое, морфометрическое, гистохимическое и иммуногистохимическое экспериментальное исследование состояния слизистой оболочки пищевода при введении цитостатика алкилирующего ряда ЦФ. Получены новые данные о тканевых и клеточных механизмах воздействия цитостатика, вводимого в различных дозах и с разной длительностью. Впервые установлено, что при длительном введении умеренных доз ЦФ изменения морфофункциональных показателей слизистой оболочки пищевода выражены значительно слабее, чем при кратковременном введении высоких доз, что обусловлено проявлением реакций компенсаторно-приспособительного характера. Получены новые сведения о том, что наиболее значительные нарушения морфофункциональной организации слизистой оболочки пищевода при длительном введении умеренных доз ЦФ проявляются, в основном, в ранние сроки эксперимента.

Впервые прослежена динамика нарушения цитоархитектоники эпителиального пласта, изменений пролиферативной и метаболической активности эпителиоцитов, выявлено ранее не описанное резкое снижение количества клеток Лангерганса при введении цитостатика. Получены новые данные о динамике относительного объёма сосудов и содержания клеток различных гистогенетических линий в собственной пластинке и подслизистой основе пищевода, а также об изменении популяции тучных клеток в собственной пластинке и подслизистой основе пищевода с учётом особенностей их топографии и функциональной активности.

Впервые прослежена динамика нормализации различных показателей морфофункционального состояния слизистой оболочки пищевода в различные сроки после отмены ЦФ. Получены новые данные о том, что введение цитостатика в высоких дозах вызывает глубокие долгосрочные изменения, вследствие которых часть исследованных показателей не возвращаются к норме в течение продолжительного восстановительного периода.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

РАБОТЫ.

Научное значение проведённого исследования состоит в расширении и до-полнении имеющихся теоретических представлений о влиянии цитостатиков на морфофункциональное состояние слизистой оболочки пищевода. Полученные данные раскрывают ряд ведущих клеточных и тканевых механизмов развития осложнений цитостатической терапии, связанных с нарушением целостности эпителиального тканевого барьера, его регенерации, метаболизма и архитектоники, подавлением специфических и неспецифических защитных реакций, нарушением васкуляризации, расстройствами координированных взаимодействий различных тканей слизистой оболочки.

Практическое значение исследования состоит в обосновании необходимости постоянного контроля состояния слизистой оболочки пищевода при проведении цитостатической терапии с целью предотвращения развития её повреждения и своевременного назначения соответствующей корригирующей терапии. Данные о структурно-функциональных изменениях слизистой оболочки пищевода при введении цитостатиков необходимы для правильной оценки клинических данных, повышения эффективности морфологической диагностики, оптимизации способов лечения заболеваний пищевода.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Введение цитостатика алкилирующего ряда циклофосфана вызывает выраженные изменения в эпителии, соединительнотканном и сосудистом компонентах слизистой оболочки пищевода, обусловленные преимущественно цито-токсическим действием препарата. Глубина и динамика этих изменений зависят от дозы и режима введения препарата.

2. При кратковременном введении высоких доз циклофосфана в эпителии слизистой оболочки пищевода наблюдаются нарушения процессов пролиферации, дифференцировки и кератинизации, синтеза белков и хода окислительно-восстановительных процессов. В собственной пластинке отмечается отёк межклеточного вещества, который сопровождается нарушением васкуляризации, снижением содержания клеток различных типов, изменениями их топографии и функциональной активности.

3. После отмены циклофосфана в течение 20 сут изученные морфофункциональные показатели состояния слизистой оболочки пищевода лишь частично возвращаются к контрольным значениям, причём в эпителии процессы нормализации выражены в большей степени, чем в соединительной ткани.

4. При длительном введении умеренных доз циклофосфана в эпителии слизистой оболочки пищевода и в её собственной пластинке наиболее выраженные изменения некоторых морфофункциональных показателей отмечаются в начальные сроки эксперимента. В дальнейшем проявляются реакции компенсаторно приспособительного характера, которые сильнее выражены в эпителии.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: V конгрессе международной ассоциации морфологов (г. Уфа, 2000); XXVII межвузовской научно-практической конференции по проблемам биологии и медицинской паразитологии, посвященной памяти акад. Е.Н. Павловского (Санкт-Петербург, 2000); научной конференции «Актуальные вопросы клинической патоморфологии» (Санкт-Петербург, 2000); международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения акад. П.Я. Герке (г. Минск, 2004); VII конгрессе Международной ассоциации морфологов (г. Казань, 2004); 7-м и 8-м международных научных симпозиумах «Применение современных ме-тодов анализа в изучении структуры и функции клетки» (г. Архангельск, 2005, 2006); 4-й и 5-й Всероссийских конференциях «Бабухинские чтения в Орле» (г. Орёл, 2005, 2006); научной конференции ученых-морфологов Санкт-Петер-бурга (Санкт-Петербург, 2006); VIII конгрессе Международной ассоциации мор-фологов (г. Орёл, 2006); конференции, посвящённой 70-летию Тверской государ-ственной медицинской академии и 100-летию со дня рождения проф. И.С. Куд-рина (г. Тверь, 2006); II Международном эмбриологическом симпозиуме «Югра - эмбрио - 2006» (г. Ханты-Мансийск, 2006); Всероссийской научной конференции, посвящённой 10-летию медицинского факультета и кафедры анатомии и гистологии человека БелГУ (г. Белгород, 2006); Международной научно-практической конференции, посвящённой 85-летию Белорусского государственного медицинского университета (г. Минск, 2006); научно-практической конференции «Современные аспекты гистогенеза и вопросы преподавания гистологии в вузе», посвящённой 100-летию проф. Л.И. Фалина (Москва, 2007).

ПУБЛИКАЦИИ И ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАК- ТИКУ. По теме диссертации опубликовано 20 научных работ, включая 8 - в центральном журнале. Основные положения диссертации внедрены в учебную программу кафедр гистологии, цитологии и эмбриологии, патологической анатомии ГОУ ВПО «СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова Росздрава», кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ГОУ ВПО «СПб ГПМА Росздрава».

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 120 страницах (текст) и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Список литературы содержит 330 источников, из них - 240 зарубежных. В работе 82 рисунка (44 микрофотографии, 38 графиков) и 32 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментах использовали 310 самок белых беспородных мышей с массой тела 23-25 г (питомник «Рапполово»), которым внутрибрюшинно вводили ЦФ (фирма “Ферейн”, Россия): животным группы А (n = 140) каждые 24 ч кратковременно в высоких дозах (400 мг/кг массы тела в течение 1-8 сут), мышам группы Б (n = 130) - с той же кратностью длительно в умеренных дозах (40 мг/кг в течение 1-70 сут). Для изучения обратимости изменений взятие материала осуществляли через 5-20 суток после трёх инъекций ЦФ (10 - 25-е сут опыта). Животным контрольных групп (К₁ для группы А и К₂ для группы Б) с той же периодичностью вводили изотонический раствор хлорида натрия. Мышей декапитировали под лёгким эфирным наркозом через 24 ч после очередной инъекции. Содержание животных, проведение опытов и выведение животных из эксперимента осуществляли в соответствии с правилами, утверждёнными этическим комитетом ГОУ ВПО СПбГМУ имени акад. И.П. Павлова (2003).

Фрагменты переднего отдела пищевода фиксировали в жидкости Буэна, в смеси СУФ по Лилли, в 3,7% параформальдегиде, разведённом полифосфатным буфером при рН 7,0 или помещали в жидкий азот.

Общегистологические и морфометрические исследования проводили на поперечных парафиновых срезах передней части пищевода толщиной 5-6 мкм, окрашенных гематоксилином-эозином, а также азур II - эозином по Романовскому. При визуальной оценке изучали не менее 5 срезов у каждого животного, учитывая признаки, характеризующие морфофункциональное состояние эпителия и собственной пластинки.

Морфометрические исследования эпителия включали определение толщины всего эпителиального пласта и его рогового слоя, в базальном слое оценивали митотическую активность (МА), просматривая не менее 2000 клеток у каждой мыши при увеличении ?900. МА выражали в промилле.

Измеряли толщину собственной пластинки совместно с подслизистой основой, которые в переднем отделе пищевода мыши не разграничены из-за отсутствия мышечной пластинки, формируя единый соединительнотканный компонент. Измерения проводили с помощью линейного окулярного микрометра при увеличении ?280, выполняя по 100 измерений на 5 срезах у каждого животного.

В соединительнотканном компоненте определяли плотность расположения фибробластов, агранулоцитов, гранулоцитов и тучных клеток. Подсчёт производили при увеличении ?630 в пределах тест-сетки площадью 25600 мкм² с после-дующим перерасчётом на условный 1 мм² площади соединительной ткани. Оценивали топографию и степень дегрануляции тучных клеток по полуколичествен-ной 4-балльной шкале [Виноградов В.В., Воробьёва Н.Ф., 1973]. Относительный объём сосудов микроциркуляторного русла определяли стереологическим методом точечного счёта с использованием тест-сетки окулярного микрометра, учитывая данные регистрации 1000 точек [Автандилов Г.Г., 1990].

Гистохимические и цитофотометрические исследования проводили на парафиновых и криостатных срезах. На парафиновых срезах ставили ШИК-реак-цию [Пирс Э., 1962] и тетразолиевую реакцию на суммарные белки (гистидин, тирозин и триптофан) [Берстон М., 1965]. На криостатных срезах пищевода тол-щиной 10 мкм тетразолиевым методом выявляли активность фермента НАДН-диафоразы, который является индикатором состояния митохондрий [Лойда З. и др., 1982; Луппа Х., 1980], отражая энергообеспечение клеток и характеризуя интенсивность обменных процессов в них. Активность НАДН-диафоразы и содержание суммарных белков в эпителии оценивали на спектроцитофотометре плаг-методом при увеличении 280, площади зонда 0,785 мкм² и длинах волн 545 нм и 467 нм соответственно [Агроскин Л.С., Папаян Г.В., 1977; Журавлёва Т.Б., 1978]. Измерения проводили в цитоплазме клеток базального и шиповатого слоёв (НАДН-диафораза и белки), а также в глубоких и поверхностных отделах рогового слоя (белки).^*

Иммуногистохимическое исследование включало выявление ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) и белка S-100 как маркера клеток Лангерганса [Bednar B.,1995; Li J. et al., 1996; Matsuda H. et al., 1990]. PCNA выявляли на парафиновых срезах толщиной 5 мкм с использованием моноклональной антисыворотки, конъюгированной с пероксидазой хрена (DAKO A/S, Дания), в разведении 1:100, с последующей инкубацией с диаминобензидином и докраши-

ванием метиленовым зеленым.^** Долю клеток с маркированными ядрами (PCNA⁺-клетки) подсчитывали при увеличении 900 отдельно в базальном и в шиповатом слоях, выражая её в процентах.

_________________________________________________________

*Гистохимические и цитофотометрические исследования выполнены на базе От- дела патологии НИЦ ГОУ ВПО СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова. Приносим свою искреннюю благодарность руководителю Отдела проф. В.В.Томсону.

**Иммуногистохимическое выявление PCNA выполнено на базе лаборатории атеросклероза НИИ экспериментальной медицины РАМН. Приносим свою искреннюю благодарность зав. лабораторией акад. РАМН проф. В.А. Нагорневу и м.н.с. А.Н. Вос-каньянц.

Для выявления белка S-100 на парафиновых срезах толщиной 5 мкм использовали поликлональную первичную кроличью антисыворотку против белка S-100 (DAKO A/S, Дания) в разведении 1:700 и вторичную мышиную антисыворотку к иммуноглобулину кролика, конъюгированную с пероксидазой хрена. Для выявления вторичных антител проводили реакцию с диаминобензидином, ядра клеток докрашивали гематоксилином.*

Статистическую обработку количественных данных проводили с использованием программного пакета Statistica for Windows V6.0 на персональном компьютере Pentium III. Для каждого показателя определяли среднее значение M и ошибку средней арифметической m; значимость различий средних величин показателей оценивали с помощью критерия Стъюдента.^**

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Экспериментальная группа А. При кратковременном введении высоких доз ЦФ уже на 2-е сут опыта эпителий слизистой оболочки пищевода резко утолщается; роговой слой неравномерно утолщён и разрыхлён. Эти явления максимально выражены после 3 инъекций ЦФ, на 6-е сут опыта, когда толщина эпителиального пласта увеличена от 33,3 2,5 мкм в группе К₁ до 56 3,5 мкм (на 68%), а толщина рогового слоя - от 9 0,8 мкм в группе К₁ до 20,9 1,4 мкм (на 132%). Рельеф эпителия приобретает зубчатые очертания, развивается интерстициальный отёк. Базальные клетки располагаются неупорядоченно, образуя подобие многорядного пласта, их цитоплазма либо сильно базофильна, либо просветлена, вакуолизирована по типу койлоцитоза. Возрастает количество рядов клеток шиповатого слоя, объём их цитоплазмы увеличивается. В эпителиоцитах зернистого слоя увеличивается размер кератогиалиновых гранул. Внутриэпителиальные лейкоциты встречаются редко. Эти изменения свидетельствуют о нарушении процессов дифференцировки и кератинизации эпителиоцитов и сходны с описанными ранее в эпителии других слизистых оболочек при введении цитостатиков [Mariani G., 2004; O'Morchoe P.J. et al., 1983; Schubert M.M. et al., 1992;], а также в эпидермисе [Mayer-da-Silva A. et al., 1989]. Близкие нарушения характерны для различных форм эзофагитов [Федотовских Г.В., 1989; Hopwood D. et al., 1979] и очагов дисплазии эпителия [Колычева Н.И. и др., 1982].

Активность НАДН-диафоразы в эпителии в начальные сроки эксперимента относительно устойчива, но на 8-е сут опыта отмечается её снижение, более выраженное в шиповатом слое. Это связано с повреждающим действием ЦФ на митохондрии вследствие постепенного накопления в них цитостатика.

____________________________

*Иммуногистохимическое выявление белка S-100 выполнено на базе лаборатории иммуногистохимии ФГУ ЦНИРРИ Росздрава. Автор приносит свою искреннюю благодарность зав. лабораторией, проф. К.М. Пожарисскому.

**Статистическая обработка данных цитофотометрии выполнена при консультативной помощи ведущего инженера лаборатории патоморфологии НИЦ СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова А.Г. Красникова, которому автор приносит свою искреннюю благодарность. Ю.П., 1985; Юкина Г.Ю. и др., 2004].

ЦФ оказывает существенное воздействие на белковый обмен в эпителии пищевода. Концентрация белков в базальном, шиповатом слоях и поверхностных отделах рогового слоя повышалась на 56%, 45% и 16% соответственно в сравнении с величиной показателей в группе К₁ уже после 1 инъекции ЦФ (2-е сут опыта). Это, вероятно, можно объяснить активацией синтеза ряда структурных и функциональных белков, участвующих в обеспечении барьерной функ-ции эпителия [Gossrau R. et al., 1990; Egashira T., Waddell W.J., 1984]. На 8-е сут распределение белков по слоям эпителия нормализовалось. Нарушения десквамации и дифференцировки, наблюдаемые в эти сроки, по-видимому, не оказывают существенного влияния на общие процессы синтеза и накопления белка в эпителиоцитах и роговых чешуйках.

После 1-й инъекции ЦФ МА возрастала в 3 раза по сравнению с величиной показателя в группе К₁: от 17,1 0,8‰ до 52,7 5‰, что согласуется с данными об усиленной пролиферации эпителия пищевода, вызванной однократным введением цитостатика [Васильева В.И. и др., 1970; Рыбаков В.П. и др., 1981]. Это явление, вероятно, может объясняться синхронным завершением митозов клетка-ми, уже вступившими в G₂-период до введения цитостатика, которые мало чувствительны к его действию, в отличие от клеток, находящихся в G₁-и в S-периоде [Демский В.И., 1977]. Далее на фоне введения ЦФ на 8-е сут опыта величина МА падает ниже уровня контрольных значений на 33%, достигая 11,5 1,1‰.

На 2-е сут количество PCNA⁺-клеток в группе А снижалось в базальном слое эпителия на 27% по сравнению с величиной показателя в группе К₁, что, по-видимому, связано с блокированием перехода клеток в S-период. На 6-е сут значение этого показателя превышало таковое у контрольных животных на 23% в базальном слое, на 99% - в шиповатом слое, что, скорее всего, явилось следствием длительной задержки эпителиоцитов в S-фазе, связанной с алкилирующим действием ЦФ, а также процессами репарации поврежденной цитостатиком ДНК. Эти данные согласуются со сведениями об активации процессов синтеза ДНК в эпителиоцитах слизистых оболочек и об увеличении количества структурных хромосомных аберраций в этих клетках при введении различных цитостатиков [Cavallo D. et al., 2005; Shibata M.A. et al. 1990]. Сходное увеличение экспрессии PCNA наблюдается в повреждённом эпителии при эзофагитах [Wang T. et al., 2002] и при неопластической трансформации эпителия пищевода у человека [Dabrowski A. et al., 2001; Kimos M.C. et al., 2004].

Количество дендритных антиген-представляющих клеток Лангерганса в эпителии пищевода на всех сроках наблюдения в группе А резко снижено. Поскольку эти клетки индуцируют иммунные реакции, выявленные изменения свидетельствуют о выраженном иммунодепрессивном действии ЦФ. Наши данные согласуются со сведениями о существенном снижении количества клеток Лангерганса и их функциональной активности в эпителии слизистой оболочки ротовой полости человека под действием цитостатиков [Bultzingslowen I., Jontell M., 1999; Mariani G. et al., 2004; Nurmenniemi P.K. et al., 1999].

Толщина соединительнотканного компонента на 8-е сут опыта возрастала в 2 раза: от 19,6 2,2 мкм в группе К₁ до 38,7 1,9 мкм. Одновременно в 1,8 раза уменьшался относительный объём сосудов: от 8,6 0,9% в группе К₁ до 4,80,5%. Эти явления сопровождались развитием отёка межклеточного вещества, вероятно, вследствие увеличения проницаемости стенки сосудов микроциркуляторного русла. Аналогичная реакция описана в слизистой оболочке пищевода [Slavin R.E. et al., 1975], ротовой полости [Squier C.A., 1990] и в коже экспериментальных животных и человека [Anderson C., Groth O., 1985].

Плотность расположения различных клеток в соединительнотканном компоненте постепенно снижалась по сравнению с таковой в группе К₁, уменьшаясь на 8-е сут опыта для фибробластов на 36%, агранулоцитов - на 63%, гранулоцитов - на 71%, тучных клеток - на 51%. Это согласуется с данными о снижении относительного количества лейкоцитов в соединительной ткани слизистых оболочек при кратковременном введении высоких доз ЦФ и может служить причиной развития инфекционных мукозитов при химиотерапии [Быков В.Л., Пахомова Е.Н., 1990; Пахомова Е.Н. и др., 1991; Peterson D.E., Cariello A., 2004].

При снижении общего количества тучных клеток происходит их топографическое перераспределение с нарастанием их содержания в собственной пластинке, особенно вблизи базальной мембраны, что, вероятно, связано с усилением коррелятивных взаимодействий между эпителием и соединительной тканью. Одновременно более чем в 3 раза возрастает относительное содержание этих клеток с сильной степенью дегрануляции, что вызывает развитие отёка.

Период после отмены ЦФ характеризуется частичной нормализацией некоторых морфофункциональных показателей состояния слизистой оболочки пищевода. В эпителии описанные морфологические нарушения сохраняются до 10-15-х сут, однако, начиная с 20-х сут опыта, отмечено восстановление вертикальной анизоморфии пласта, компактизация рогового слоя. На 25-е сут опыта толщина эпителиального пласта достигает величины значений в группе К₁, при этом толщина рогового слоя остаётся увеличенной на всём протяжении опыта, составляя, в среднем, 14,3 1,3 мкм, что свидетельствует о длительном нарушении процесса десквамации. Отмечается усиленная инфильтрация эпителия лейкоцитами, вероятно, вследствие выделения им хемотаксических факторов [Lundqvist C. et al., 1994, van Loon L.A et al., 1989], а также нарушения его барьерных свойств и проникновения микроорганизмов [Быков В.Л., Пахомова Е.Н., 1990; Wagner D. K., Sohnle. P.G., 1995].

МА в эпителии, резко сниженная в начале восстановительного периода до 3 0,5‰, далее проявляет тенденцию к нормализации. При этом количество PCNA⁺-клеток после отмены ЦФ возрастает по сравнению с таковым в группе К₁: в базальном слое - на 58 %, а в шиповатом слое - на 71%. Это явление может быть связано с высоким уровнем повреждения ДНК под действием цитостатика и активными процессами репарации, а также с длительной задержкой эпителиоцитов в S-периоде [Brown J.R. et al., 2005].

Активность НАДН-диафоразы устойчиво снижается в базальном слое на 12% и на 22%, а в шиповатом слое - на 15% и 21% соответственно на 15-е и 20-е сут опыта по сравнению с таковой в группе К₁. Это свидетельствует о долгосрочном повреждении энергетического аппарата эпителиоцитов под действием ЦФ.

Концентрация белков в базальном слое эпителия повышена на 10% на 10-е сут, а в глубоких отделах рогового слоя снижена на 27% на 20-е сут опыта по сравнению с таковой в группе К_1.. Повышение величины показателя на 10-е сут, совпадающее по срокам с резким снижением МА, вероятно, связано с выходом эпителиоцитов из цикла и активацией белкового синтеза, что необходимо для компенсации повреждающего действия ЦФ [Gossrau R. et al., 1990].

На 20-е сут опыта в эпителии отмечено появление одиночных мелких клеток Лангерганса со слабо выраженными отростками. Аналогичное явление отмечено в эпителии ротовой полости после введения различных цитостатиков [Nurmenniemi P.K. et al. 1999], что указывает на низкую функциональную актив-ность этих клеток и обусловливает длительное снижение защитных свойств слизистой оболочки пищевода.

Толщина соединительнотканного компонента после отмены ЦФ увеличена по сравнению с таковой в группе К₁ в течение всего длительного периода наблюдения, составляя, в среднем, 35,5 2 мкм. Относительный объём сосудов, нормализовавшийся на 10-е сут опыта, далее превышает величину показателя в группе К_1. в 1,7 раза, достигая, в среднем, величины 14,6 0,7%, увеличивается размер сосудов и степень их кровенаполнения. Усиление процессов ангиогенеза связывают с повышенным риском возникновения злокачественной трансформации пищевода [Islam A., et al., 2006; Sartori S. et al., 1991; Spechler S.J., 1991] как следствия цитостатической терапии.

Плотность расположения гранулоцитов после отмены ЦФ превышает таковую в группе К_1. почти в 4 раза на 20-е сут опыта, что может быть связано с активацией защитных функций слизистой оболочки и/или компенсацией нарушенных барьерных свойств эпителиального пласта. Сходные явления наблюдались в дерме человека после однократного введения высоких доз цитостатиков [Anderson C.D., Groth O. 1985]. Усиленная лейкоцитарная инфильтрация рассматривается как клинически важный показатель эзофагитов [Geboes K. et al., 1983].

Плотность расположения агранулоцитов уже в начальные сроки после отмены ЦФ возвращается к величине этого показателя в группе К₁. Видимо, этот процесс обеспечивается миграцией лимфоцитов в слизистую оболочку пищевода, несмотря на выраженные инволютивные изменения органов иммуногенеза в эти сроки наблюдения [Mackie E.J.,1981]. Плотность расположения фибробластов уже на 5-е сут после отмены ЦФ нормализуется, что свидетельствует о сравнительной устойчивости этих клеток к цитотоксическому действию ЦФ.

Плотность расположения тучных клеток нормализуется на 10-е сут, превышает значения контрольных показателей на 15-е сут, далее устойчиво снижается в среднем на 74% в сравнении с таковой в контроле. При этом в межклеточном веществе сохраняется отёк, что свидетельствует о длительном действии медиаторов этих клеток. В начальные сроки после отмены ЦФ отмечается возрастание доли тучных клеток в подслизистой основе, вероятно, связанное с миграцией их предшественников из сосудов [Быков В.Л., 1999]. К 25-м сут опыта топографическое распределение тучных клеток приближено к контрольным показателям. В течение 10-20-х сут относительное содержание тучных клеток с разной степенью дегрануляции характеризуется стабильностью, на 25-е сут повышается их доля со слабой степенью дегрануляции. Это свидетельствует о некотором снижении функциональной активности тучных клеток в ходе восстановительного периода и не согласуется со сведениями о преобладании дегранулированных клеток в других органах после отмены цитостатиков [Красноженов Е.П., 1994].

Экспериментальная группа Б. При длительном введении умеренных доз ЦФ в начальные сроки опыта (16-е сут) отмечалось утолщение эпителиального пласта от 42,6 2,3 мкм в группе К₂ до 54,9 2,6 мкм (на 29%), а рогового слоя, который локально разрыхлялся - от 9,4 0,6 мкм в группе К_2,, до 16,7 1 мкм (на 78%). Усиливалась инфильтрация эпителия агранулоцитами. Начиная с 32-х сут наблюдались нарушения вертикальной анизоморфии пласта, сходные с тако-выми в группе А, но выраженные в меньшей степени. В эпителии практически не встречались лейкоциты, что согласуется с описаниями других авторов [Nagayoshi H., et al. 2005]. Отмечены отдельные случаи истончения эпителия с компактизацией рогового слоя. На 70-е сут опыта толщина эпителиального пласта значимо не отличалась от таковой в группе К₂, а толщина рогового слоя превышала её на 49%, достигая 140,9 мкм. Описанные явления свидетельствуют об умеренно выраженном нарушении процессов дифференцировки и кератинизации, сопровождаемом снижением барьерных свойств эпителиального пласта.

В группе Б показатель МА превысил таковой в группе К₂ (20,1 2,8‰) на 16-е и 48-е сут опыта на 104% и 41% соответственно, составив 41 1,5‰ и 32 2,7‰.. Наблюдаемая пролиферативная реакция эпителия свидетельствует об отсутствии выраженного цитостатического действия ЦФ при данных дозировке и режиме его введения, что согласуется с данными других авторов [Мамонтов С.Г., Суворова Н.М., 1982; Gunin A.G., Nikolaev D.V., 1999; Shibata M.A., 1990].

Активность НАДН-диафоразы снизилась на 19% на 48-е сут опыта в шиповатом слое эпителия по сравнению с аналогичным показателем в группе К₂. Одновременно наблюдалось повышение концентрации белков в поверхностных отделах рогового слоя, что, возможно, связано с уменьшением объёма отдельных роговых чешуек, либо с накоплением их при нарушении десквамации. Слабая выраженность изменений величин гистохимических показателей, как и цитостатического действия препарата, видимо, связаны с отсутствием кумулятивного эффекта ЦФ и достаточно высоким темпом его выведения, исключающим накопление токсических концентраций в случае длительного введения умеренных доз.

Толщина соединительнотканного компонента на 16-е сут опыта уменьшалась с 24,71,9 мкм в группе К₂ до 17,7 1,6 мкм (на 28%). Это сопровождалось увеличением относительного объёма сосудов с 5 0,4% в группе К₂ до 9,7 0,7% (почти в 2 раза) и усилением ШИК-реакции, что согласуется с описаниями других авторов [Squier C.A., 1990]. В дальнейшие сроки толщина соединительнотканного компонента приближена к контрольным значениям, а содержание сосудов снижено в 1,4 раза и в 1,7 раза соответственно на 48-е и 70-е сут опыта, достигая 3,8 0,2% и 2,9 0,3%

В группе Б плотность расположения агранулоцитов максимально снижена по сравнению таковой в группе К₂ на 48-е сут опыта на 67%, что свидетельствует об угнетении иммунных свойств слизистой оболочки пищевода и согласуется с данными, полученными при изучении влияния цитостатиков на другие органы пищеварительного тракта [Nagayoshi H., 2005]. Плотность расположения гранулоцитов на 16-е сут опыта увеличивалась, что свидетельствует об активации не-специфических защитных механизмов и сопоставимо с аналогичными явлениями в коже человека в начальные сроки химиотерапии [Sellier S. et al., 2006]. В дальнейшем, на 32-е сут опыта, нами выявлено значительное снижение плотности расположения гранулоцитов на 44%, аналогичное наблюдаемому в других сли-зистых оболочках при длительном введении цитостатиков [Skoog M.L., Groth O., 1981; Squier C.A., 1990]. Плотность расположения фибробластов значимо не изменяется, что подтверждает данные о их устойчивости к повреждающему действию цитостатиков [Chen T. et al., 2006; Krischel V., 1998].

Плотность расположения тучных клеток максимально снижена на 56% на 16-е сут опыта по сравнению с величиной показателя в группе К₂, но затем проявляет тенденцию к нормализации. На 70-е сут опыта почти вдвое по сравнению с контрольными показателями возросла доля тучных клеток в непосредственной близости от базальной мембраны и в 4 раза - их доля с сильной степенью дегрануляции. Это свидетельствует о повышении функциональной активности тучных клеток и может объяснять формирование предрасположенности к аллергическим реакциям при длительной цитостатической терапии [Красноженов Е.П., 1994].

Таким образом, при кратковременном введении высоких доз ЦФ в слизистой оболочке пищевода проявляется преимущественно цитотоксический эффект, тогда как при длительном введении умеренных доз препарата наблюдается тенденция к развитию компенсаторно-приспособительных реакций. Последнее подтверждается данными о слабой выраженности изменений в слизистых оболочках различных органов при длительной цитостатической терапии в малых дозах [Chang S.Y. et al., 1990; Emmenegger U. et al., 2004; Post J.G. et al., 1993]. Изменения морфофункционального состояния слизистой оболочки пищевода, вызванные ЦФ, лишь частично обратимы; нормализация отдельных показателей протекает с различной скоростью.

ВЫВОДЫ

1. По данным гистологического, морфометрического, гистохимического и иммуногистохимического анализа, в слизистой оболочке пищевода при введении циклофосфана происходят выраженные морфофункциональные изменения эпителия и соединительнотканного компонента (собственной пластинки и подслизистой основы), приводящие к нарушению целостности барьерных систем и угнетению специфических и неспецифических защитных механизмов. Степень выраженности этих изменений зависит от дозы и режима введения цитостатика.

2. При кратковременном (1-8 сут) введении высоких доз препарата (400 мг/кг массы тела) в эпителии слизистой оболочки пищевода наблюдаются нарушения процессов дифференцировки и кератинизации: утолщение эпителиального пласта, гиперкератоз, нарушение вертикальной анизоморфии, уменьшение содержания клеток Лангерганса. Снижение митотической активности сопровождается повреждением ДНК эпителиоцитов и активизацией процессов её репарации.

3. Кратковременное введение высоких доз циклофосфана приводит к метаболическим нарушениям в эпителии слизистой оболочки пищевода, которые проявляются в угнетении активности фермента НАДН-диафоразы, характеризующего течение окислительно-восстановительных процессов, и к изменению нормального распределения белков по слоям эпителия.

4. При кратковременном введении высоких доз циклофосфана в собственной пластинке и подслизистой основе пищевода отмечается выраженный отёк межклеточного вещества с увеличением общей толщины соединительнотканного компонента, уменьшением относительного объёма сосудов и плотности расположения фибробластов, агранулоцитов, гранулоцитов, тучных клеток. Возрастает относительное содержание тучных клеток в собственной пластинке и доля этих клеток с сильной степенью дегрануляции.

5. После отмены циклофосфана в течение 10-25 сут часть морфофункциональных показателей состояния эпителия слизистой оболочки пищевода (толщина пласта, митотическая активность эпителиоцитов, концентрация белков в различных слоях) возвращаются к контрольным значениям. Остаются увеличенными толщина рогового слоя и количество эпителиоцитов с повреждённой ДНК в состоянии репарации, резко уменьшено содержание клеток Лангерганса. Снижены показатели активности НАДН-диафоразы и концентрация белков в глубоких отделах рогового слоя эпителия.

6. После отмены циклофосфана большинство морфофункциональных показателей состояния соединительнотканного компонента не возвращаются к контрольным значениям: остаются увеличенными его толщина, относительный объём сосудов, плотность расположения гранулоцитов. Плотность расположения тучных клеток уменьшена, преобладают клетки с отсутствующей и слабо выраженной степенью дегрануляции, которые располагаются преимущественно в подслизистой основе. Нормализуются показатели плотности расположения фибробластов и агранулоцитов.

7. При длительном (1-70 сут) введении умеренных доз циклофосфана (40 мг/кг массы тела) в эпителии слизистой оболочки пищевода наиболее выраженные сдвиги морфофункциональных показателей отмечаются в начальные сроки эксперимента: возрастает толщина эпителиального пласта и его рогового слоя, увеличивается показатель митотической активности. В дальнейшем в динамике опыта величина этих показателей частично нормализуется. Активность НАДН-диафоразы в шиповатом слое эпителия снижена только на 48-е сут опыта, в этом же сроке возрастает концентрация белков в поверхностных отделах рогового слоя.

8. При длительном введении умеренных доз циклофосфана в соединительнотканном компоненте (собственной пластинке и подслизистой основе) пищевода наиболее значительные изменения величин морфофункциональных показателей наблюдаются в начальные сроки опыта: уменьшается его толщина, а также плотность расположения тучных клеток и агранулоцитов, увеличивается относительный объём сосудов и плотность расположения гранулоцитов. В дальнейшем толщина соединительнотканного компонента нормализуется, однако остаются сниженными относительный объём сосудов и плотность расположения агранулоцитов, гранулоцитов и тучных клеток. Преобладают тучные клетки с высокой степенью дегрануляции, которые располагаются преимущественно в собственной пластинке.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В проведённом исследовании раскрыты важнейшие тканевые и клеточные механизмы повреждающего действия цитостатиков на слизистую оболочку пищевода, знание которых необходимо для понимания природы развития осложнений цитостатической терапии у больных.

2. Выявленные нарушения являются обоснованием необходимости постоянного контроля состояния слизистой оболочки пищевода при проведении цито-статической терапии с целью предотвращения развития её повреждения и своевременного назначения соответствующей корригирующей терапии.

3. Полученные сведения о влиянии различных режимов введения цитостатиков на морфофункциональное состояние слизистой оболочки пищевода, в частности, о выраженности цитотоксического действия при кратковременном введении высоких доз и о компенсаторно-приспособительном характере наблюдаемых изменений при длительном введении умеренных доз, являются обоснованием для выбора правильного режима введения цитостатиков в зависимости от конкретных условий и целей химиотерапии.

4. Данные о морфофункциональных изменениях слизистой оболочки пищевода при введении цитостатиков необходимы для правильной оценки клинических данных, повышения эффективности морфологической диагностики, оптимизации способов лечения заболеваний пищевода.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Быков В.Л., Юкина Г.Ю., Исеева Е.А. Морфофункциональная характеристика выстилающего и железистого эпителиев при иммунодепрессии // Морфология. - 2000. - Т. 117, вып. 3. - С. 28.

2. Исеева Е.А. Гистохимические и морфометрические характеристики эпителия пищевода при иммунодепрессии // Материалы 27 межвузовской научно-практической конф. по проблемам биологии и медицинской паразитологии, посв. памяти акад. Е.Н. Павловского. - СПб.: Изд-во ВМА, 2000. - С. 75 - 76.

3. Исеева Е.А., Быков В.Л. Изменение состояния слизистой оболочки пищевода при введении циклофосфана // Актуальные вопросы клинической патоморфологии: Сб. трудов научной конф., посв. 80-летию со дня рождения и 50-ле-тию работы в Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования з.д.н. РФ, члена-корр. РАМН, проф. Хмельницкого О.К. - СПб.: Изд-во МАПО, 2000. - С. 76.

4. Исеева Е.А., Быков В.Л. Изменение состояния эпителия пищевода при многократном введении умеренных доз цитостатика // Фундаментальные проблемы морфологии: Материалы междунар. научной конф., посв. 100-летию со дня рождения акад. П.Я. Герке. - Минск: Изд-во БГМУ, 2004. - С. 52-53.

5. Исеева, Е.А., Быков В.Л. Морфофункциональная перестройка эпителия слизистой оболочки пищевода при длительной экспериментальной цитостатической терапии // Морфология. - 2004. - Т. 126, вып. 4. - С. 54.

6. Быков В.Л., Исеева Е.А. Морфофункциональные изменения в слизистой оболочке пищевода при введении циклофосфана и после его отмены // Применение современных методов анализа в изучении структуры и функции клетки: Материалы 7-го Междунар. научного симпозиума - Архангельск: Изд. Северного гос. мед. ун-та, 2005. - С. 15 - 16.

7. Быков В.Л., Исеева Е.А. Динамика морфофункциональных изменений эпителия пищевода при разных режимах введения цитостатика // Бабухинские чтения в Орле: Материалы 4-й Всеросс. конф.: Ретиноиды. Альманах. - М.: Изд-во ЗАО «Ретиноиды», 2005. - Вып. 21. - С. 114 - 115.

8. Исеева Е.А., Быков В.Л. Гистологическое, морфометрическое и гисто-химическое исследование реакции эпителия и собственной пластинки пищевода мышей на введение циклофосфана // Современные проблемы морфологии: Материалы научной конф. ученых-морфологов Санкт-Петербурга. - СПб.: Изд. ВМА, 2006. - Вып.1. - С. 54- 55.

9. Быков В.Л., Исеева Е.А. Структурно-функциональные изменения в слизистой оболочке пищевода под влиянием циклофосфана и после его отмены // Бабухинские чтения в Орле: Материалы 5-й Всеросс. конф. Ретиноиды. Альманах. - М.: Изд-во ЗАО «Ретиноиды», 2006. - Вып. 24. - С. 66 -67.

10. Исеева Е.А., Быков В.Л. Изменение процессов дифференцировки эпителия слизистой оболочки пищевода под действием циклофосфана // Морфология. - 2006. - Т. 130, вып. 4. - С. 56 - 57.

11. Быков В.Л., Исеева Е.А. Функциональная морфология покровного эпителия слизистой оболочки пищевода //Морфология. - 2006. - Т. 129, вып. 3. - С.7-21.

12. Исеева Е.А., Быков В.Л. Изменения пролиферативной активности эпителия слизистой оболочки пищевода при введении циклофосфана // Морфология. - 2006. - Т. 130, вып. 5. - С. 47 - 48.

13. Быков В.Л., Исеева Е.А. Слизистая оболочка пищевода в условиях длительного введения цитостатика (экспериментальное морфометрическое и гисто-химическое исследование) // Применение современных методов анализа в изучении структуры и функции клетки: Материалы 8-го Междунар. научного симпозиума - Архангельск: Изд. Северного гос. мед. ун-та, 2006. - С. 12 - 14.

14. Исеева Е.А., Быков В.Л. Изменения эпителия пищевода при экспериментальной цитостатической терапии//Актуальные вопросы эволюционной, возрастной и экологической морфологии: Материалы Всеросс. научной конф. с международным участием, посв. 10-летию медицинского факультета и кафедры анатомии и гистологии человека БелГУ.-Белгород: Изд. БелГУ, 2006.-С. 67.

15. Быков В.Л., Исеева Е.А. Репаративный гистогенез слизистой оболочки пищевода при экспериментальной цитостатической терапии // Научный вестник Ханты-Мансийского гос. мед. ин-та. - 2006. - №2. - С. 26 - 27.

16. Быков В.Л., Исеева Е.А. Защитные механизмы покровного эпителия слизистой оболочки пищевода человека // Морфология. - 2006. - Т.130, вып. 6. - С. 12 - 24.

17. Исеева Е.А., Быков В.Л. Морфофункциональные изменения эпителия пищевода при воздействии цитостатика // Морфология. - 2006. - Т. 130, вып. 6. - С. 62 - 67.

18. Исеева Е.А., Быков В.Л. Тучные клетки слизистой оболочки пищевода при введении цитостатика и после его отмены // Актуальные проблемы морфологии: Сб. трудов Международной научно-практической конф., посв. 85-летию Белорусского гос. мед. ун-та. - Минск: Изд-во БГМУ, 2006. - С. 64 - 65.

19. Исеева Е.А., Быков В.Л. Структурные изменения эпителия и собственной пластинки слизистой оболочки пищевода при иммунодепрессии, вызванной введением цитостатика // Актуальные вопросы современной морфологии и физиологии. - СПб.: Изд-во ДЕАН, 2007. - С. 224 - 226.

20. Быков В.Л., Исеева Е.А. Изменения защитных свойств слизистой оболочки пищевода при цитостатической терапии // Морфология. - 2007. - Т. 131, вып. 3. - С. 60-61.