Распространенность и биологические свойства клебсиелл в условиях техногенной нагрузки крупного промышленного города

Анализ полученных данных показал, что на территории Волгограда циркулирует значительное количество клебсиелл. Удельная значимость их постоянно растет. Так, в сумме заболеваний ОКИ в 2000 году этот микроб вызвал клебсиеллез у 26,5% больных, в 2001 - 28,4, 2002 - 32,2, 2004 - 40,3%, 2005 - 40,0%.

Помесячная оценка состава микрофлоры у жителей Волгограда позволила определить типичную динамику сезонности высева клебсиелл для этой территории (табл. 2). Установлено, что в первые три месяца года обнаружение клебсиелл регистрируется почти на одном уровне (5,8; 5,8%; 6,8% соответственно). Рост обсемененности наблюдается с апреля месяца, а в августе превышает среднегодовые показатели на 40%, при этом остается на цифрах 12,7% в октябре месяце, снижаясь в ноябре, декабре месяце (8,1; 8,9 и 8,8 соответственно).

Таблица 2. Среднемесячная встречаемость клебсиелл в микрофлоре жителей Волгограда (2000 - 2005)

Известно, что на развитие эпидемического процесса при клебсиеллезе может влиять множество факторов, не исключена возможность связи их с климатогеографическими влияниями.

В связи с этим возникла необходимость выделить из суммы метеорологических составляющих климата те конкретные ситуации, которые при определенных обстоятельствах способны вызвать у предрасположенных к развитию нарушений микроэкологии той или иной экониши колонизацию биоценоза этими микроорганизмами и вызвать клебсиеллез.

Климатическая ситуация в период исследования по характеристике конкретных факторов проявлялась резкой континентальностью и создавала хорошие модельные условия для изучения вопросов, связанных с влиянием факторов внешней среды.

Сводный дисперсионный анализ регрессии влияния метеорологических факторов на некоторые изучаемые слагаемые климата позволил выявить наличие сезонности для всех составляющих. Полученные данные свидетельствуют, что в зимние месяцы с преобладанием отрицательных температур воздуха распространенность клебсиелл падает. Максимальная корреляция при этом отмечается в летне-осенний сезон, для которого характерен наибольший коэффициент влияния (r= - 0,78).

Используя математическую модель, показано значение отдельных факторов метеокомплекса на распространенность клебсиелл в регионе обследования. Проведенные расчеты позволили установить, что погодные ситуации, связанные с температурой 170С, способствуют значительному уменьшению, а ниже 100С почти полному прекращению влияния температурных факторов на распространенность клебсиелл.

Выявлено, что клебсиеллы в микропейзаже здорового человека встречаются редко (6,5%) в невысоком титре lg 1,34±0,08 КОЕ/ед.суб., при этом наибольшая колонизация регистрировалась на коже промежности (4,2%), наименее заселенной этими микроорганизмами была грудь, живот и лоб (соответственно 1,2; 1,7 и 1,4%). Наибольшая интенсивность обсеменения обнаружена на коже промежности lg 1,4±0,18 КОЕ/ед.суб. В минимальных количествах обсеменялась спина (lg 0,54±0,18 КОЕ/см). Среднеарифметическая величина микробной колонизации кожи здоровых людей составила lg 1,23±0,07 КОЕ/ см.

Анализ представленных сведений показал, что часто клебсиеллы высевались у лиц с дисбактериозом кишечника. При этом микроорганизмы обнаруживались не только в кишечнике, но также в полости рта. Обращает на себя внимание увеличение частоты и плотности их колонизации кожи, которая была заселена у 47,5% обследуемых со средней величиной обсемененности равной lg 3,28±0,10 КОЕ/см, что достоверно было выше, чем в группе здоровых людей. Часто клебсиеллы вегетировали на коже промежности (33,7%), где отмечена максимальная плотность их колонизации lg 8,30±0,08 КОЕ/см. Эти микроорганизмы определялись также на коже правой руки (10,4%), спины (8,3%) и груди (8,3%). Наименее заселенными микроорганизмами были правая голень и лоб (2,1 и 3,8% соответственно). Величина колонизации данными бактериями всех биотопов была высока и колебалась от lg 2,28±0,18 - на коже правой до lg 3,38±0,24 КОЕ/см- левой голени.

Таблица 3. Частота встречаемости и плотность колонизации клебсиеллами больных обследуемых групп (%, Мm lg КОЕ/ед.суб.)

Изучение микрофлоры полости рта при декомпенсированном дисбактериозе кишечника показало, что в этой экосистеме колонизация клебсиелл достигала 9,5% с плотностью микробной обсемененности равной lg 2,94±0,26 КОЕ/ед.суб., чаще всего клебсиеллы высевались в зубном налете - 4,2% (lg 3,21±0,04 КОЕ/ед.суб.).

Анализ сочетанности колонизации клебсиеллами исследуемых биотопов установил, что изучаемые микроорганизмы иногда вегетируют как на коже, так и в кишечнике (76,6%), при этом у 14,4% обследуемых они заселяли все биотопы.

Проведенные исследования показали, что частота встречаемости клебсиелл в микрофлоре кожи и кишечника практически здоровых людей, живущих в южных районах города (16,7±2,3 %) превышала среднеарифметическую величину колонизации, характерную для всей изучаемой популяции - 6,4±1,4 (р0,05). При этом нарастание значений величины обсемененности микроорганизмами установлено в ряду центральный (lg 0,86±0,18 КОЕ/ед.суб.) - северный (lg 1,28±0,12 КОЕ/ед.суб.) - южный топодем города (lg 1,64±0,06 КОЕ/ед.суб.).

Аналогичные результаты зарегистрированы и при анализе колонизации клебсиеллами исследуемых биотопов у больных дисбактериозом кишечника (lg 2,56±0,24 - 3,08±0,14 - 3,48±0,09 КОЕ/ед.суб. соответственно).

Высеваемость клебсиелл на объектах внешней среды увеличивалась в ряду: центр (12,4±1,3 %) - север (15,5±2,1 %) - юг (16,8±1,2 %). Наряду с этим максимальное значение плотности данных бактерий отмечалось также в южном топодеме, составив lg 1,28±0,16 КОЕ/ед.суб. (рис. 1).

микрофлора экологический биологический дисбактериоз

Рис. 1. Частота встречаемости клебсиелл в микрофлоре лиц обследуемых групп и на объектах внешней среды в зависимости от региона города

Анализ полученных данных свидетельствует о зависимости микробиоценоза у лиц обследуемых групп от экологических условий проживания. Установлено, что у жителей южного топодема клебсиеллы в микрофлоре за счет высокой плотности колонизации и частоты встречаемости переходят из транзиторных в разряд доминирующих видов.

Учитывая, что в последние годы появились сообщения о возрастающей роли клебсиелл при внутрибольничных и других обусловленных этими микроорганизмами инфекциях представляло интерес изучение колонизации Kl.pneumoniae медицинского персонала и внешней среды больниц. Выявлено, что в биоценозе медицинского персонала весьма часто встречаются энтеробактерии (28,8%), при этом наименьшая колонизация зарегистрирована у врачей (11,4%0, наибольшая - у вспомогательного персонала (40,0%), при этом доля клебсиелл составила 4,6%, 10,3% и 14,0% соответственно.

Длительное переживание возбудителя в организме хозяина является бесспорно целесообразностью для клебсиелл. Наиболее оптимальным вариантом жизнедеятельности бактерий в этом случае следует признать устойчивое сосуществование с хозяином, что возможно при наличии определенных свойств микроорганизмов.

В связи с поставленной задачей представлял интерес анализ биологических свойств клебсиелл, колонизирующих различные экологические ниши. Анализу подвергнуто 662 штамма, из которых 394 были выделены у больных, 58 - у бактерионосителей, 23 - у медицинского персонала и 87 - из внешней среды.

Биохимическая идентификация, проводимая по 24 признакам, показала, что в основном штаммы имели однотипную ферментативную активность. Отклонения по некоторым признакам наблюдались у отдельных культур и касались реакций на среде Симмонса (69,4%), малоната натрия (70,3%), лизиндекарбоксилазы (70,3%), ферментация маннита (99,0%), лактозы (96,1%). Более вариабельное поведение культур наблюдалось при ферментации дульцита (66,9%), адонита (71,9%), сорбита (48,3%).

Атипичные характеристики отмечены у штаммов, выделенных из различных источников. Так, культуры, ферментирующие глюкозу, без газа выделялись из мокроты (3), раны (5), замедленно ферментирующие лактозу - из мочи (3), салицина - из испражнений (10), мочи (3) и крови (2), мокроты (5), раффинозу - из испражнений (5) и мочи (6), адонит - из мочи (6) и с кожи (5).

Не ферментирующие адонит культуры выделялись в основном из внешней среды (5), замедленно утилизировали цитрат в среде Симмонса, штаммы из послеоперационной раны (10), мокроты (5), имели лизиндекарбоксилазу культуры, выделенные из испражнений (5), крови (10).

Анализ биохимической активности выделенных клебсиелл позволил установить, что техногенное воздействие в Южном топодеме города вместе с количественными и качественными изменениями в биоценозе изменяет уровень ферментативной активности штаммов.

Полученные данные позволили выделить 6 вариантов клебсиелл, циркулирующих в различных экологических нишах города. К I биовару отнесены 29,9% культур, ко II - 24,9%, III - 23,9%, IV - 6,8%, V - 12,9% и к VI - 2,3%. Проведенный анализ биохимических свойств дал основание заключить, что на территории Волгограда циркулируют клебсиеллы I, II и Ш биологических вариантов.

У выделенных штаммов клебсиелл проведено изучение вирулентности, при этом рассматривались свойства, относящиеся к 3-м различным группам: адгезивность, персистенция и токсинемия.

Определение адгезивности микроорганизмов на эритроцитах человека показало, что активными было 75,8% культур, выделенных у бактерионосителей при этом они были обнаружены преимущественно в низкой (33,5%) и средней (20,03%) активности. Установлено, что среди микроорганизмов, колонизирующих больных, живущих в разных регионах города, отмечены колебания значений этого показателя. Так, в группе микроорганизмов северного и южного топодемов адгезивно-активными были 82 и 90% штаммов соответственно. Тогда как у больных, госпитализированных в стационары Центрального района, клебсиеллы были адгезивно-активными в 60% случаев. При этом у бактерий, колонизирующих больных Центрального района в 2,5 раза чаще встречались штаммы, обладающие низкими знячениями показателя.

Выявлено, что 59% штаммов из коллекции клинических изолятов Klebsiella pneumoniae и 40% из неклинических соответствующих штаммов обладали маннозочувствительными гемагглютинами (МSHA) (37,7%). Среди клебсиелл встречались также маннозорезистентные (MRHA) и смешанные типы гемагглютининов (22,3 и 32,0% соответственно). Гемагглютинины смешанного типа чаще встречались у клинических штаммов (31,44,5), чем у клебсиелл, выделенных от здоровых людей и внешней среды (18,22,3 и 12,41,5).

Среди культур, высеянных от бактерионосителей, выявлено почти в 6 раз больше негемагглютинирующих штаммов, чем среди клинических изолятов.

Установлено, что клебсиеллы, выделенные из внешней среды, в 48% из них были маннозочувствительными. В составе штаммов, колонизирующих внешнюю среду больниц, регистрировались гемагглютинирующие варианты микробов (50,0%).

В качестве факторов, способствующих персистенции клебсиелл, была оценена их антилизоцимная, каталазная и антиинтерфероновая активность.

Полученные данные показали, что антилизоцимной активностью обладала 381 культура, из больничной коллекции. При этом анализ распространения антилизоцимной активности внутри популяции клебсиелл показал неоднородность последней как по частоте встречаемости, так и по интенсивности выраженности.

Штаммы, полученные из объектов внешней среды, обладали в 24,9% случаев антилизоцимной активностью, при этом уровень ее был весьма низким и колебался от 1 до 2 мкг. Все культуры клебсиелл, высеянные у пациентов хирургического и терапевтического стационаров, обладали равной степенью АЛА (60,0%), а штаммы от больных с клебсиеллезным дисбактериозом значительно более высокими показателями (100% равнозначно).

При рассмотрении данных распространенности антиинтерфероновой активности выявлено, что штаммы, имеющие этот признак, выделенные из абиотической среды, встречались весьма редко (11,1%), в то время как у медицинского персонала величина признака была выше и колебалась от 21,4 до 23,9%, а клебсиеллы, выделенные у пациентов хирургического и терапевтического стационаров 22,9% и 18,1% штаммов обладали антиинтерфероновой активностью.

После анализа данных по наличию факторов, способствующих персистенции, встал вопрос, как соотносятся эти свойства бактерий с известными факторами патогенности микроорганизмов.

Наличие факторов патогенности у клебсиелл было неодинаковым. При этом токсигенность, адгезия и гемолитическая активность наиболее часто встречались у людей с клиническими проявлениями клебсиеллеза. В то время как при дисбактериозе кишечника без клинической симптоматики эта способность зарегистрирована лишь в 13,0% наблюдений, способность к адгезии обнаружена у 78,3% штаммов клебсиелл клинического происхождения, тогда как у культур, высеянных при дисбактериозе, этот признак определен в 47,8%, а у бактерионосителей лишь в 21,0% наблюдений.

Сводный дисперсионный анализ регрессии признаков вирулентности позволил выявить у клебсиелл, высеянных от больных 5 основных признаков патогенности - ДНК-азную, РНК-азную, лецитиназную гемагглютинирующую активность, сопряженных с высокой антилизоцимной активностью.

На основании показателей множественной регрессии была построена математическая модель вирулентности клебсиелл.

В расчетной формуле для штаммов, высеянных от здоровых людей, значимым оказался показатель гемагглютинации (r=0,71).

Максимальные коэффициенты корреляции у культур, обнаруженных у больных, оказались у антилизоцимной, антиинтерфероновой активностей, лецитиназы, ДНК-азы и РНК-зы.

У клебсиелл, выделенных из внешней среды, коэффициенты корреляции у ферментов агрессии и токсинов были в количествах достоверно невысоких, не имеющих диагностических целей.

По результатам многофакторного анализа была проведена дифференциация клебсиелл на 5 патоваров: высоковирулентные (6 признаков), средне-вирулентные (5 - 4 признака), вирулентные (3 признака), слабовирулентные (2 признака) и вирулентные (1 признак).

Самым информативным признаком вирулентности у клебсиелл являлась антилизоцимная активность, присутствие которой было обязательным у всех клинических штаммов.

Полученные данные свидетельствуют, что ни одни из изученных нами факторов патогенности клебсиелл не может быть достоверно связан ни с одной из форм нарушения микроэкологии, обусловленной данным микроорганизмом.

Установленная разнородность штаммов клебсиелл по наличию отдельных факторов патогенности позволяет их использовать как маркеры патогенности.

При проведении плазмидного скрининга культур K.pneumoniaе, выделенных из различных источников двух географических регионов, в 22 из анализируемых штаммов этого вида микроорганизма обнаружены плазмидные ДНК различного размера. Причем, у большинства культур выявлены плазмидные ДНК относительно большого размера 70 - 87 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов). Клебсиеллы, экологически связанные с Южным топодемом, были более «богаты» внехромосомными репликонами, при этом в штаммах K.pneumoniaе выявлено 6 типов различных плазмид (от 3,8 до 87 т.п.н.).

Наибольшее количество штаммов K.pneumoniaе, содержащих плазмиды, выявлено в микрофлоре объектов внешней среды и в группе больных с дисфункцией кишечника, дисбактериоз которых обусловлен клебсиеллами. Бесплазмидные штаммы встречались во всех географических регионах и во всех исследуемых группах. На основании проведенных исследований было сделано предположение, что обнаруженные плазмиды могут служить эпидемиологическим маркером штаммов этого микроорганизма.

Нумерический анализ электрофореграмм, основанный на реакции амплификации с праймером ПР13 и UPGMA кластеризации позволил разделить сравниваемые K.pneumoniaе на несколько групп, состоящих из двух и более штаммов, в зависимости от уровня сходства. В одну кластерную группу вошли культуры, выделенные от больных и здоровых людей одного географического региона (Центр). Основу второй группы сформировали 3 штамма, выделенные от больных из другого географического региона (Юг).

В результате исследования выявлено, что в Южном топодеме исследуемые клебсиеллы отличались большей генетической гетерогенностью.

На основании проведенного анализа было заключено, что генотип штаммов, выделенных из объектов окружающей среды, является более вариабельным. Это касается как наличия плазмид, так и RAPD группирования. Причем, ни один генотип, характерный для этих штаммов, не встречался в культурах, выделенных от больных или здоровых.

Сочетание генотипических методов делает внутривидовую дифференциацию штаммов более эффективной, за счет выявления их «тонких» инфравидовых особенностей. Паспортизация штаммов по плазмидному маркеру и RAPD-типу позволит проводить мониторинг инфекции, правильно оценивать эпидемиологическую ситуацию и рекомендовать адекватные профилактические или лечебные мероприятия.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что клебсиеллы входят в состав биоценозов человека, а также в микрофлору внешней среды. Наибольшее количество штаммов и наивысший процент обнаружения регистрируется у больных кишечными инфекциями (33,7%).

2. Проведенные исследования показали, что частота встречаемости клебсиелл в аутофлоре практически здоровых людей в различных районах города была неодинакова. Наибольшая колонизация выявлена у жителей южного района (16,72,2%).

3. При обследовании больниц установлено, что наиболее обсемененными клебсиеллами были учреждения хирургического профиля. При этом вышеуказанные микроорганизмы контаминировали как персонал, так и больных. Наивысший процент колонизации выявлен у вспомогательного персонала (14,7%).

4. При клебсиеллезном дисбактериозе изменениям подвержена энтеробактериальная составляющая нормальной микрофлоры. это проявляется снижением общего количества эшерихий, появлением в составе ассоциаций других условно-патогенных представителей семейства Enterobacteriaceae (протея, энтеробактера и др.).

5. Кластерный анализ, проведенный с учетом всех изученных признаков, подтвердил эмпирический факт близости биопрофилей клебсиелл, обнаруженных во внешней среде c таковыми, входящими в состав биоценозов здорового человека, что свидетельствует о естественных миграционных процессах в системе человек - внешняя среда и существенно отличается от клебсиелл, входящих в состав микрофлоры при дисбактериозе.

6. Частота обнаружения у клебсиелл факторов патогенности тесно связана с напряжением экологической ситуации в исследуемом районе. Наибольшее число факторов и высокая степень их активности выявлены в экологически неблагоприятном Южном топодеме (Красноармейский район).

7. В штаммах K.pneumoniaе, выделенных в различных географических регионах города, содержатся отличающиеся по размеру и рестрикционному профилю плазмиды, которые могут быть использованы в качестве эпидемиологического маркера при внутривидовом типировании штаммов клебсиелл по плазмидному спектру.

8. Плазмидный профиль и нумерический анализ электрофореграмм, основанный на реакции амплификации с произвольными праймерами и UPGMA кластеризации, показали большую генетическую гетерогенность штаммов, выделенных в Южном топодеме.

9. Сравнительный анализ биологических свойств клебсиелл позволил построить математическую модель, дающую основание выявить степень нарушения микроэкологии в экосистеме.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Колонизационная резистентность кожи при псориазе // Вестник ВолГМУ. - 2004. - №10. - С.60-61. (Соавт. В.С.Крамарь, А.Ю.Родин, Т.Н.Савченко и др.).

2. Клебсиллезное носительство в условиях крупного промышленного города // Вестник ВолГМУ. - 2004. - №12. - С.38-40. (Соавт. Т.Н.Климова, В.О.Крамарь).

3. Экология энтеробактерий в кишечнике человека // Деп. рукоп. №Д-27 576 от 10.01.2005г. - 7с. (Соавт. Т.Н.Климова, Е.А.Загороднева).

4. Частота встречаемости клебсиелл у жителей г.Волгограда при дисбактериозе кишечника // Деп. рукоп. №Д-27 577 от 10.01.2005г. - 8с. (Соавт. Е.А.Загороднева, Т.Н.Климова).

5. Энтеробактерии в микробиоценозе полости рта людей, страдающих синдромом раздраженной толстой кишки // Актуальные вопросы экспериментальной, клинической и профилактической стоматологии. - Волгоград, 2006. - С.154 - 156. (Соавт. Лиманская И.В., Чернышова О.В., Климова Т.Н.).

Размещено на Allbest.ur