Методы биотестирования в контроле токсичности и детоксикации нитробензола

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Методы биотестирования в контроле токсичности и детоксикации нитробензола

Специальность:

03.02.08 - экология (биологические науки)

Таран Денис Олегович

Иркутск - 2012

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

токсичность нитробензол загрязненный перекись

Актуальность исследований. В настоящее время загрязнение окружающей среды достигло таких масштабов, что токсиканты стали такими же полноправными экологическими факторами как вода, температура, свет и т.п. (Матишов и др., 2003; Донченко и др., 2007). Количество загрязнителей способных влиять на экологическое состояние биоты, превысило миллион наименований, и ежегодно синтезируется свыше четверти миллиона новых веществ (Маячкина и др., 2009). Одним из таких опасных токсикантов является нитробензол, который широко используется в химической промышленности в производстве анилиновых красителей. Несоблюдение технологии приводит к загрязнению окружающей среды нитробензолом и его метаболитами. Актуальность проблемы загрязнения ароматическими поллютантами резко возросла после ряда техногенных аварии в КНР. Так, после одной из них, в воде р. Амур зафиксировано 20-и кратное превышение ПДК по нитробензолу (Кондратьева, 2008).

Опубликованы сообщения об ослаблении гуматами токсичности различных веществ (Wuи et al., 2000; Wang et al., 2002; Perminova, 2005). Перекись водорода способна окислять многие загрязнители (Pifer, 2003). Известны данные об использовании дождевых червей для детоксикации различных загрязнителей и восстановления плодородия почв (Ingersoll et al., 2003; Langdon et al., 2005). Предполагается, что важную роль в ремедиации червями загрязненных сред играют гуминовые вещества (ГВ) (Atiyeh et al., 2002; Janagan et al., 2003). Существует большое количество приемов для удаления углеводородов с поверхности водоемов. Более трудной и малоразработанной задачей является извлечение находящихся в толще воды растворенных ароматических соединений.

Цель исследования - изучить возможность применения ГВ, верми- культуры, перекиси водорода, гидрофобных веществ для обезвреживания нитробензола, а также близких к нему ароматических углеводородов, и выяснить перспективы и ограничения биотестирования для контроля токсичности и детоксикации нитробензола.

Задачи исследования:

1. Изучить в лабораторных условиях влияние нитробензола и близких к нему ароматических поллютантов на тест-объекты (высшие водные и наземные растения, микроводоросли, простейшие и беспозвоночные животные).

2. Исследовать влияние вермикультивирования на токсичность модельных сред, загрязненных нитробензолом и близкими к нему ароматическими углеводородами.

3. Сравнить действие различных препаратов ГВ на тест-объекты и выяснить возможность их использования для ослабления негативного действия ароматических углеводородов на организмы.

4. Оценить антидотное действие перекиси водорода по отношению к нитробензолу методами биотестирования.

5. Разработать приемы обезвреживания нитробензола, находящегося в толще воды.

6. Выяснить пригодность и особенности использования различных биотестов для контроля токсичности и детоксикации нитробензола.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Препараты ГВ и вермикультура способствуют значительному ослаблению негативного действия ароматических углеводородов на биологические объекты.

2. Присутствие перекиси водорода, суспензий парафина, эмульсий растительного и вазелинового масел снижает токсическое действие нитробензола, находящегося в толще воды.

3. Для оценки качества различных сред наиболее эффективными биотестами являются: для водной среды - выживаемость дафний и изменение численности и флуоресценции хлорофилла клеток микроводорослей; для образцов почвенных моделей - выживаемость и изменение поведенческих реакций дождевых червей и прорастание семян пшеницы.

Научная новизна. Впервые методами биотестирования с использованием беспозвоночных животных (дафнии, парамеции, дождевые черви), высших наземных (семена пшеницы), а также водных растений (элодея, ряска) и микроводорослей (Scenedesmus quadricauda) проведено комплексное исследование ряда препаратов различных ГВ, ароматических углеводородов, в первую очередь нитробензола и некоторых гидрофобных веществ (суспензий парафина, эмульсий вазелинового и растительного масел) и их смесей. Показано снижение токсического эффекта нитробензола и ароматических соединений в присутствии препаратов ГВ, перекиси водорода и ряда гидрофобных веществ. На основании результатов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) на ядрах ¹³С показана возможность связывания нитробензола гуминовыми кислотами (ГК). Выявлен механизм связывания нитробензола ГК. Показано, что в основе детоксикации нитробензола ГВ прежде всего лежит способность гуматов взаимодействовать с ароматическим углеводородом по донорно-акцепторному механизму.

Практическая значимость. Сопоставлены ростовые и антидотные свойства ряда препаратов ГВ. Выявлены диапазоны концентраций препаратов ГВ оказывающих стимулирующее действие на биологические объекты. Показано, что препараты ГВ, перекись водорода, вермитрансформация и обработка эмульсиями и суспензиями гидрофобных веществ существенно снижают токсичность нитробензола и близких к нему углеводородов. Предложен новый способ удаления нитробензола из толщи воды с помощью суспензий парафина (патент № 2424197). Изученные препараты и предложенные подходы можно рекомендовать для практических целей при детоксикации сред, загрязненных нитробензолом и другими близкими к нему ароматическими поллютантами. Проведено сравнение различных методов биотестирования для контроля токсичности и детоксикации воды и почвенных моделей, содержащих ароматические соединения. Выявлены возможности и ограничения использованных методов биотестирования.

Апробация работы: Материалы диссертации были представлены на всероссийских научно-практических конференциях с международным участием: «Проблемы безопасности современного мира: способы защиты и спасения, Безопасность - 07», «Безопасность - 08», «Безопасность - 09» (Иркутск 2007, 2008, 2009); IV Всероссийской научной конференции с международным участием: «Гуминовые вещества в биосфере» (Москва 2007, 2010); Х съезде Гидробиологического общества при РАН (Владивосток, 2009), Международной научной конференции и международной школе для молодых ученых «Проблемы экологии: чтения памяти профессора М.М. Кожова» (Иркутск, 2010); II Международной конференции «Биоиндикация в мониторинге пресноводных экосистем» (Санкт-Петербург, 2011); IV Всероссийской конференции по водной экотоксикологии, посвященной памяти Б.А. Флерова «Антропогенное влияние на водные организмы и экосистемы» (Борок, 2011).

Результаты исследований использованы при чтении курсов лекций «Прикладная экология»; «Экологическая токсикология»; «Рациональное природопользование» на биолого-почвенном факультете ИГУ и проведении учебных практик студентов ФГБОУ ВПО «ИГУ».

Результаты исследований использованы в отчетах о НИР лаборатории водной токсикологии НИИ биологии ФБГОУ ВПО «ИГУ» по проектам РФФИ: № 05-04-97237- Байкал - р; № 06-04-39003-ГФЕН_а; ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России»: ГК № 02.740.11.0018 от 15.06.2009 г.; ГК № 02.740.11.0335 от 07.07.2009 г.; ГК 02.740.11.0418. от 30.09.2009 г.; ФЦП «Исследование и разработка по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы»: ГК № 11.519.11.5016 от 28.10.11. Материалы работы включены российско-китайской Комиссией по подготовке встреч глав правительств в программу научно-технического сотрудничества № 12-35., 24.09.2008 г. «Экологическая безопасность оз. Байкал - р. Амур…».

Публикации: По материалам диссертационной работы опубликовано 20 работ, в том числе 6 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, получен 1 патент РФ.

Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 119 страницах и состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 5 рисунками, содержит 35 таблиц и 5 приложений. Список литературы состоит из 125 библиографических названий, из них 30 иностранных.

Личный вклад автора: Лабораторные исследования, анализ полученных данных, обобщение и интерпретация результатов, подготовка материалов для докладов и публикаций проведены лично или при определяющем вкладе автора. Работа проводилась на кафедре биологии и экологии ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирская государственная академия образования», в НИИ биологии и на биолого-почвенном факультете ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный университет», а также в ФГБОУ ВПО «Национальный исследовательский Иркутский государственный технический университет».

Благодарности: Автор прежде всего выражает особую благодарность за ценные советы и указания данные при проведении исследований и подготовке диссертации к.б.н., в.н.с. Саксонову М.Н.. Автор признателен за оказанную всестороннюю помощь к.б.н., в.н.с. Балаян А.Э.; к.б.н., доц. Бархатовой О.А.; д.х.н., проф. Кушнареву Д.Ф.; д.х.н., проф. Калабину Г.А.; ст. преподавателю кафедры органической химии ФГБОУ ВПО «ИГУ» Баранской В.К.; к.б.н., доц. Приставке А.А..

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Глава 1. Обзор литературы

Приведены литературные сведения по методам биотестирования. Представлены данные о токсичности и источниках поступления в окружающую среду нитробензола и других, близких к нему ароматических углеводородов. Рассмотрены некоторые характеристики и свойства препаратов ГВ.

Глава 2. Объекты и методы исследований

В качестве токсикантов кроме нитробензола использовали анилин, бензол, толуол. Из препаратов ГВ: «Powhumus» (гумат калия из леонардита) производства «Humintech GmbH.» (Германия) и товарные препараты, выпускаемые ООО «Аграрные Технологии» - «Гумат 80», «Гумат + 7», «Гумат - Экстра» (г. Иркутск).

Окислителем была выбрана перекись водорода (концентрация определялась методом перманганатометрии).

Из гидрофобных веществ использовали:

- растительное масло (Масло «Злато» подсолнечное рафинированное дезодорированное вымороженное ГОСТ Р 52465-2005).

- масло вазелиновое медицинское (парафин жидкий) ГОСТ 3164-78, которое представляет собой очищенную фракцию нефти, получаемую после отгонки керосина.

- парафин технический, марка Т-1, ГОСТ 23683-89

Парафин для приготовления водных суспензий нагревали до 45 - 50 ⁰С, вливали в воду и перемешивали на магнитной мешалке.

Объектами тестирования служили парамеции (Paramecium саudatum Еhrenberg), дафнии (Daphnia magna Straus), дождевые черви (красный калифор-нийский гибрид) (Eisenia fоetida Andrei Bouche), микроводоросли (Scenedesmus quadricauda (Тurр.) Breb.), ряска малая (Lemna minor Linne), элодея канадская (Elodea canadensis Rich), семена пшеницы сорта «Заларинка».

Токсичность испытуемых препаратов оценивали по выживаемости дафний, парамеций и по изменению численности и уровня флуоресценции хлорофилла клеток микроводорослей. Содержание, культивирование и эксперименты проводили в лабораторных условиях согласно методикам токсикологического контроля (ФР.1.39.2007.03222; ФР.1.39.2007.03223; ФР. 1.39.2006.02506). В опытах с лабораторной культурой дождевых червей тест - откликом являлось выживание в растворах исследуемых токсикантов и изменение их поведенческих реакций (времени зарывания) (Стом и др., 2004).

Элодею и ряску отбирали на р. Ангаре. Тест - реакцией служило изменение прироста побегов элодеи и числа лопастей ряски при 10 суточной экспозиции.

Эффективность вермитрансформации оценивали по накоплению на поверхности исследуемых образцов почвенных моделей слоя копролитов (Потапов, 1998).

Для проведения опытов по прорастанию семян пшеницы выбран сорт «Заларинка» (получен в ЗАО «Иркутские семена»). Эксперименты проводили в лабораторных условиях, семена предварительно промывали водой, затем высаживали в образцы почвенных моделей по 20 штук на каждую повторность. При прорастании семена изменяют среду (влажность, рН) и для исключения влияния этих факторов на результаты опытов проводили сравнение с контролем, в качестве которого служили образцы почвенных моделей, не содержащие исследуемых веществ. Для повышения экспрессности биотеста семена оставляли на 10 суток при температуре 25 ^оС и постоянном искусственном освещении (2000 лк). В конце опыта измеряли длину корней проростков.

Для изучения сорбции нитробензола ГК из испытуемых препаратов ГВ выделяли ГК (Стадников, 1932). Концентрацию нитробензола определяли методом ВЭЖХ. Спектры ЯМР ¹³С регистрировали на спектрометре «Varian- VXR500S». Исследования проводили на химическом факультете ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный университет» под руководством д.х.н., проф. Д.Ф. Кушнарева.

Для оценки концентраций нитробензола в водных растворах, после взаимодействия с перекисью водорода и суспензиями парафина использовали фотометрический метод, основанный на поглощении растворов нитробензола в ультрафиолетовой области спектра (200 нм -- 360 нм). Измерения проводили на спектрофотометре «Thermo helios 29800» (США). Микроскопирование проводили на микроскопе AxioScope imager M2m.

Все эксперименты проводили не менее чем в 5-и независимых опытах с 3 параллельными измерениями. Расчет LC₅₀ проводили графическим методом с использованием пробит-анализа. Для статистической обработки полученных данных использовали пакет программ Microsoft Exсel. Достоверность различия результатов определяли с помощью критерия Стьюдента. В таблицах представлены средние арифметические значения и их доверительные интервалы при Р?0,95.

Глава 3. Оценка детоксикации ГВ водной среды, загрязненной ароматическими соединениями, методами биотестирования

3.1. Действие ароматических углеводородов на гидробионтов

Изучено влияние нитробензола, а также бензола, анилина и толуола на выживаемость дафний, парамеций, изменение численности клеток микроводорослей, на прирост побегов элодеи и количество лопастей ряски.

На всех испытанных биотестах наибольшее токсическое действие обнаруживали у нитробензола и анилина. Для этих углеводородов получены одинаковые значения LC₅₀ по выживаемости дафний - 0,16 г/дм³ и парамеций - 0,79 г/дм³ (рисунок 1).

Довольно близкие значения величин LC₅₀ были найдены также у бензола и толуола при тестировании этих углеводородов по выживаемости дафний и парамеций.



Рисунок 1. Влияние ароматических углеводородов на тест-объекты

По убыли чувствительности тест-объектов к действию нитробензола можно построить следующий ряд токсичности: выживаемость дафний > изменение числа и уровня флуоресценции хлорофилла клеток микроводорослей > прирост побегов элодеи > прирост числа лопастей ряски > выживаемость парамеций.

3.2. Влияние ГВ на тест-объекты

Изучали влияние ряда ГВ на тест-объекты. Препараты ГВ могут быть расположены в следующем порядке по мере увеличения токсического действия повышенных концентраций на исследуемые тест-объекты: «Powhumus» < «Гумат 80» < «Гумат+7» < «Гумат Экстра». «Powhumus» и «Гумат 80» имеют и другие преимущества: они лучше растворимы в воде, а значения рН ближе к нейтральному.

Опыты по влиянию гуматов на изменение численности клеток водорослей показали относительно высокую чувствительность к действию «Powhumus» LC₅₀ = 0,22 г/дм³ и «Гумата 80» LC₅₀ = 0,08 г/дм³.

Представляет интерес то, что в малых концентрациях гуматы не только не оказывают токсического действия на парамеции, но и стимулируют их размножение. Количество инфузорий увеличивается по сравнению с контролем на 45 % под влиянием «Powhumus» в концентрации 0,1 г/дм³ (таблица 1). В таблице 1 представлена проверка достоверности различия средних арифметических результатов опытов и контроля

Таблица 1

Влияние растворов гуматов на выживаемость парамеций (количество живых особей по отношению к контролю, %)

Концентрация препаратов, г/дм3	«Powhumus»	«Гумат 80»
2,0	42,25,9*	12,51,9*
1,5	70,611,2*	25,94,7*
1,0	93,712,3**	68,110,9*
0,5	131,223,4*	100,012,4**
0,1	145,721,1*	114,918,1**
0,05	111,513,7**	100,012,6**

Примечания:

контроль - дехлорированная водопроводная вода;

*- р < 0,05 - сравниваемые результаты достоверно отличаются;

**- р > 0,05 - сравниваемые результаты достоверно не отличаются.

3.3. Совместное действие ГВ и ароматических соединений на тест-объекты

Как, показывает рисунок 2, присутствие гуматов снижало негативное влияние нитробензола на дафний. Так, например, при добавлении 0,1 г/дм³ «Powhumus» в раствор нитробензола 0,1 г/дм³ дафнии не погибали при 100 % летальности без гуматов. В присутствии 0,1 г/дм³ «Гумат 80», в растворе нитробензола 0,1 г/дм³ отмечали выживаемость 71,8 % рачков.

При исследовании комплексного действия нитробензола, анилина, бензола, толуола в концентрации 1,5 г/дм³ и препарата «Powhumus» в концентрации 0,1 г/дм³ остротоксичная для парамеций концентрация всех соединений становилась безвредной (выживаемость 100%). При добавлении меньшей концентрации «Powhumus» (0,05 г/дм³) выживаемость парамеций в растворах нитробензола и анилина достигала 61,3 % и 67,5 % по отношению к контролю соответственно, тогда как в этих условиях опыта в растворах толуола и бензола гибели инфузорий не наблюдали. В растворах бензола, где уровень прироста побегов элодеи составлял 15,7 % по отношению к контролю при добавлении «Powhumus» в концентрациях 0,1 г/дм³ и 0,05 г/дм³ фиксировали прирост 92,1 % и 81,3 %, соответственно (таблица 2).

Рисунок 2. Совместное действие «Powhumus» и нитробензола, «Гумат 80» и нитробензола на выживаемость дафний

Таблица 2

Влияние растворов ароматических углеводородов (концентрация 1,5 г/дм³) в присутствии «Powhumus» на прирост побегов элодеи и количество лопастей ряски по отношению к контролю, %

Токсикант	Элодея	Ряска
	«Powhumus», г/дм3
	0	0,1	0,05	0	0,1	0,05
1	2	3	4	5	6	7
Бензол	15,72,7	92,111,7**	81,312,6*	11,91,8	89,513,7**	80,612,3*
Нитробензол	0,0	65,59,3*	47,17,4*	0,0	74,711,2*	64,310,9*

Примечания

контроль - дехлорированная водопроводная вода;

*- р < 0,05 - сравниваемые результаты достоверно отличаются;

**- р > 0,05 - сравниваемые результаты достоверно не отличаются

В таблице 2 представлена проверка достоверности различия средних арифметических результатов опытов и контроля.

Близкую картину наблюдали при биотестировании этих же соединений по изменению количества лопастей ряски.

В экспериментах с использованием прямого счета клеток S. quadricauda, после внесения «Powhumus» в количестве 0,05 и 0,01 г/дм³ в растворы 0,1 г/дм³ нитробензола и анилина наблюдали полную детоксикацию водной среды (рисунок 3).

Следует отметить высокую чувствительность флуоресценции хлорофилла микроводорослей к действию нитробензола и эффективность детоксикации последнего «Powhumus»: нитробензол вызывает почти полное гашение флуоресценции хлорофилла S. quadricauda, а добавление гумата восстанавливало уровень флуоресценции хлорофилла до 75 %.В растворе анилина с концентрацией 0,3 г/дм³ численность клеток водорослей падала до 17,3 % по отношению к контролю, а при

внесении «Powhumus» 0,05 г/дм³ отмечали увеличение количества клеток S. quadricauda до 65,2%.



(а) (б)

Рисунок 3. Совместное действие «Powhumus» и нитробензола на уровнь флуоресценции хлорофилла (а) и численность клеток S. quadricauda (б)

В испытанных концентрациях «Гумат 80» значительно ослаблял негативное действие растворов нитробензола и анилина на микроводоросли. Например, при содержании анилина 0,3 г/дм3 и «Гумат 80» 0,05 г/дм3 число клеток составляло 54,9 %, то есть в 3 раза больше чем в отсутствии гумата. Количество клеток S. quadricauda в растворе анилина 0,1 г/дм3 присутствии гумата 0,05 г/дм3 составляло 72,2 % по отношению к контролю, а в растворе нитробензола 0,1 г/дм3 при добавлении «Гумат 80» 0,05 г/дм³ - 84,1 %.

3.4. Возможные механизмы детоксикации нитробензола ГВ

Исследовали сорбционную активность и сорбционную емкость выделенных из гуматов образцов ГК, по отношению к нитробензолу. Из полученных результатов следует, что увеличение количества сорбента и времени экспонирования повышали эффективность связывания нитробензола. При использовании ГК, выделенных из препарата «Гумат 80», наиболее эффективно сорбция протекала в течение первых 30 мин: концентрация нитробензола составляла 0,81 г/дм³, через 60 мин - 0,75 г/дм³, и через 90 мин - 0,61 г/дм³, при исходной концентрации нитробензола 2,0 г/дм³.

Как показал анализ спектров ЯМР ¹³С исходных ГК и после сорбции на них нитробензола происходит взаимодействие ароматических фрагментов ГК с нитробензолом. При этом во взаимодействии не участвуют карбоксильные группы ГК. Для уточнения механизма связывания нитробензола гуминовыми сорбентами были получены спектры водных растворов индивидуальных веществ, структуры которых входят в молекулы ГК (бензойная кислота, фенол) и их растворов с нитробензолом. В спектрах ЯМР на ядрах изотопа ¹³C наблюдали смещение сигналов ароматических атомов углерода в том числе: С - и Н - замещенных ароматических атомов углерода (С_ар); О - замещенных ароматических атомов углерода (С_ар-О), что свидетельствует об определяющем донорно-акцепторном механизме сорбции нитробензола ГК. Это является дополнительным подтверждением проявления детоксицирующих свойств ГВ за счет участия ароматических фрагментов.

Глава 4. Влияние вермикультуры и ГВ на токсичность образцов почв, содержащих ароматические углеводороды

4.1. Влияние ароматических соединений и препаратов ГВ при комплексном и раздельном действии на дождевых червей

Наряду с тестом по выживаемости червей изучали влияние нитробензола на их поведенческую реакцию - скорость зарывания в землю. Следует отметить более высокую чувствительность данной реакции на действие нитробензола. Так, в растворах с концентрацией 0,5 г/дм³ выживало 100% особей, а скорость реакции снижалась в 3 раза по сравнению с контролем.

В растворах «Powhumus» и «Гумат 80» в концентрациях равных и меньше 0,5 г/дм³ гибели дождевых червей не отмечали, и время их зарывания в землю приближалось к контролю.

При добавлении нетоксичных концентраций «Powhumus» в растворы нитробензола, обладающие острой токсичностью по отношению к почвенным олигохетам, отмечали снижение негативного действия данного токсиканта. Так, в смеси с содержанием нитробензола 1,5 г/дм³ и препарата «Powhumus» 0,5 г/дм³ выживало 90,6 % червей (рисунок 4).

В варианте с концентрациями нитробензола 2,0 г/дм³ и препарата «Powhumus» 0,5 г/дм³ выживаемость снизилась до 63,1 %. В растворе нитробензола 1,0 г/дм³ при внесении гумата 0,5 г/дм³ фиксировали выживаемость всех особей, а скорость поведенческой реакции была близкой к контролю. В присутствии «Powhumus» 0,1 г/дм³ в ранее летальных для червей растворах нитробензола 2,0 и 1,5 г/дм³ наблюдали частичное снижение токсичности, а при концентрации нитробензола 1,0 г/дм³ гибели червей не отмечали. Присутствие «Гумат 80» 0,5 г/дм³ в меньшей степени способствовало снижению токсичности нитробензола за исключением раствора нитробензола 1,0 г/дм³, где фиксировали 100 % выживаемость. В растворе с концентрацией нитробензола 2,0 г/дм³ при добавлении гумата 0,5 г/дм³, оставались живыми 36,6 % особей. В смесях препарата 0,5 г/дм³ «Гумат 80», и нитробензола 1,5 г/дм³ выживало 73,3 % червей. При концентрации гумата 0,1 г/дм³ наблюдали менее значительное снижение негативного действия нитробензола на дождевых червей. Во всех вариантах опытов с «Гумат 80» 0,1 г/дм³ время зарывания было значительно выше, чем в контроле.

Рисунок 4. Совместное действие «Powhumus» и нитробензола, «Гумат 80» и нитробензола на выживаемость дождевых червей

4.2. Влияние дождевых червей на токсичность образцов почвенных моделей, загрязненных ароматическими поллютантами

Оценивали эффективность вермитрансформации по изменению толщины накопленного слоя копролитов. Слой копролитов при содержании нитробензола 1,0 г/кг был значительно меньше, чем в незагрязненных образцах почвы. В этом случае только на 5-е сутки толщина слоя приближалась к контролю. Наиболее эффективно вермитрансформация происходила при более низких концентрациях нитробензола (0,5 - 0,1 г/кг). При таком содержании токсиканта уже на 3-е сутки величина слоя копролитов была близка к контролю. Последующий анализ показал, что на 5-е сутки в модельных образцах почвы с концентрацией нитробензола 1,0 г/кг погибло 30 % особей, а при содержании нитробензола 0,5 г/кг и ниже выживали все особи.

Во всех образцах почвенных моделей с бензолом и толуолом, гибели червей не наблюдали при содержании этих токсикантов во всех испытуемых концентрациях (1,0 г/кг, 0,5 г/кг, 0,1 г/кг). В присутствии бензола и толуола 0,1 г/кг и 0,5 г/кг толщина слоя копролитов приближалась к контролю на 2-е сутки. На 3-и сутки уровень слоя копролитов соответствовал контролю в обоих вариантах.

Для оценки изменения токсичности образцов почвы в процессе вермитрансформации в приготовленные водные вытяжки из данных субстратов помещали дафний. Образцы почвы до вермитрансформации с концентрацией нитробензола, бензола и толуола 1,0 г/кг проявляли 100 % летальное, либо остротоксичное действие.

В вытяжках же после вермитрансформации действие нитробензола из летального переходило в остротоксичное, а в случае бензола и толуола - из остротоксичного в малотоксичное.

В образцах почвенных моделей с ароматическими углеводородами в концентрациях 1,0; 0,5 и 0,1 г/кг, не содержащих дождевых червей, происходило угнетение роста корней пшеницы. Но после вермитрансформации наблюдали значительное увеличение длины корней проростков пшеницы даже в опытах с наиболее высоким содержанием токсикантов. Так в опытах с концентрацией ароматических углеводородов 1,0 г/кг почвы длина корней проростков достигало: в случае бензола - 7,5 см (до вермитрансформации - 2,5 см), нитробензола - 5,1 см (до вермитрансформации - 1,3 см), толуола - 6,8 см (до вермитрансформации - 1,8 см) (таблица 3). В таблице 3 все сравниваемые результаты опытов в столбцах 3:4, 3:5, 3:6 достоверно отличаются.

Таблица 3

Средняя длина (см) корней проростков пшеницы в образцах почвенных моделей, в отсутствии и присутствии «Powhumus» 0,5 г/кг

Препарат	Концентрация в образцах почвенных моделей, г/кг	В отсутствии «Powhumus»	В присутствии «Powhumus»
		до вермикультивирования	после вермикультивирования	до вермикультивирования	после вермикультивирования
1	2	3	4	5	6
Бензол	1,0	2,50,4	7,51,2	6,51,0	9,71,3
	0,5	4,70,8	7,91,5	7,71,4	12,22,1
	0,1	5,90,9	8,11,3	7,91,1	18,63,2
Нитробензол	1,0	1,30,2	5,10,9	4,30,7	9,11,4
	0,5	2,60,5	7,41,2	5,60,8	11,21,6
	0,1	3,70,7	7,91,7	6,71,0	15,72,6
Толуол	1,0	1,80,2	6,81,0	5,80,9	13,42,3
	0.5	3,60,6	7,11,2	7,61,4	15,12,2
	0,1	4,10,7	7,90,9	8,11,2	17,52,8
Контроль (образцы почвенных моделей, не содержащие токсикантов)	6,81,0	8,91,1	9,11,5	19,63,1

На следующем этапе экспериментов исследовали действие ГВ на свойства образцов почвенных моделей. В опытах с водными вытяжками из образцов почвенных моделей с «Powhumus» установили, что при содержании гумата 3,0 г/кг происходила гибель всех дафний. Вытяжки с концентрацией данного препарата 2,5 г/кг и 2,0 г/кг обладали острой токсичностью - выживало 16,1 и 29,5 % особей, соответственно. Концентрация «Powhumus» 1,5 г/кг не оказывала острого токсического действия на дафний - выживаемость составляла 60,5 %. При более низком содержании гумата в вытяжках 1,0 - 0,1 г/кг негативного действия на дафний не отмечали, выживаемость составляла 100 %.

В образцах почвенных моделей с содержанием «Powhumus» 3,0 г/кг прорастания семян не фиксировали. При снижении концентрации гумата до 2,0 г/кг, хотя количество проросших семян не отличалось от контроля, но длина корней проростков была значительно ниже и составляла 1,4 см. Стимуляцию роста наблюдали в образцах почвенных моделей с содержанием гумата 0,5 г/кг, где длина корней проростков составляла - 12,6 см.

Рассматривая результаты данной серии экспериментов можно сказать, что «Powhumus» в условиях наших опытов наиболее эффективно стимулировал прорастание семян пшеницы в концентрации 0,5 г/кг. В дальнейшем был поставлен ряд экспериментов с добавлением дождевых червей и 0,5 г/кг гуматов в модельные образцы почв, содержащие бензол, нитробензол, толуол в концентрациях 1,0 г/кг, 0,5 г/кг и 0,1 г/кг. В присутствии всех исследуемых токсикантов в вышеназванных концентрациях толщина слоя копролитов уже на 1-е сутки приближалась к контролю. На 2-е сутки во всех вариантах опытов толщина слоя копролитов соответствовало контролю.

Водные вытяжки, полученные после добавления 0,5 г/кг гумата в образцы почвенных моделей, содержащие ароматические соединения в концентрациях 1,0 г/кг, 0,5 г/кг и 0,1 г/кг переставали оказывать острое токсическое действие на дафний. Так хотя некоторые пробы и обладали токсичностью, полной гибели рачков не фиксировали. После вермитрансформации все вытяжки из испытуемых проб оказались не токсичными (выживало 90 - 100 % рачков по отношению к контролю)

Судя по длине корней проростков пшеницы, присутствие гумата в образцах почвенных моделей ослабляло токсическое действие ароматических углеводородов. Так, например, при содержании нитробензола 1,0 г/кг почвы длина корней проростков составляла - 1,3 см, а после внесения гумата - 4,3 см, а по завершению вермитрансформации - 9,1 см, что означает стимуляцию роста корней проростков (таблица 3).

Таким образом, биотестирование на дождевых червях, дафниях, и проростках семян пшеницы свидетельствует о том, что в присутствии вермикультуры происходила частичная детоксикация модельных образцов почвы, содержащих ароматические углеводороды. В определенном диапазоне концентраций препараты ГВ также ослабляли негативное действие испытуемых токсикантов на лабораторные тест-культуры. Но наиболее эффективно детоксикация ароматических соединений в модельных образцах почвы происходила при совместном действии вермикультуры и гуматов.

В последние годы появились работы об использовании дождевых червей для рекультивации почв, загрязненных нефтью (Филиппова А.В. и др., 2009; Смольникова и др., 2010), опубликованы сообщения о детоксикации гуматами нефтепродуктов (Шаповалов и др.2003; Иванов и др 2007; Perminova et al., 2008), но проблема обезвреживания нитробензола этими авторами не изучалась.

Глава 5. Применение биотестов для изучения антидотных свойств перекиси водорода и гидрофобных веществ по отношению к нитробензолу

5.1. Изменение токсичности ароматических соединений в присутствии перекиси водорода

Концентрация перекиси водорода 0,01 % обладала острой токсичностью, для дафний и парамеций. В растворе перекиси 0,005% выживало 12,3 % по отношению к контролю, а при содержании 0,001 % - 54,5 % инфузорий. Для дафний данные концентрации перекиси водорода обладали еще более высокой токсичностью. Даже при снижении содержания пероксида до 0,0005 % живыми оставались 39,6 % рачков. Видимого влияния на использованные тест-объекты не обнаруживали при уровне перекиси водорода 0,0005 % для инфузорий и 0,0001 % для дафний.

В дальнейшем, исследовали совместное действие ароматических соединений и перекиси водорода. Для этого, в подобранные концентрации, бензола, нитробензола и анилина вносили перекись водорода в безопасных для тест - объектов концентрациях. Так, при содержании Н₂О₂ 0,0001 % выживало 88,3 % парамеции в растворе бензола 1,5 г/дм³ , а при увеличении концентрации перекиси до 0,0005 % гибели парамеций не фиксировали. В присутствии перекиси 0,0005 % в растворе бензола 2,0 г/дм³, число живых инфузорий составило 73,1 %, при полной гибели простейших в случае отсутствия Н₂О₂.

Как и в случае с инфузориями, в присутствии перекиси отмечали снижение негативного действия токсичных концентраций бензола для дафний. В растворе бензола 0,5 г/дм³, при внесении перекиси 0,0001 % и 0,00005 % фиксировали 100% выживаемость, тогда как без добавления Н₂О₂ все рачки погибали. В более высокой концентрации бензола 0,8 г/дм³ в присутствии перекиси водорода 0,0001 % выживало 88,2 % особей, более низкое содержание пероксида - 0,00005 % не влияло на выживаемость дафний.

Ослабление токсичности для парамеций в присутствии 0,0001% и 0,0005 % перекиси водорода фиксировали и при работе с растворами, содержащими 1,0 г/дм³ нитробензола. В смеси нитробензола 1,5 г/дм³ и перекиси водорода 0,0005 %, выживаемость составила 74,3 %, а в отсутствии Н₂О₂ инфузории погибали. Концентрация перекиси 0,0001 % оказалась не достаточна для детоксикации раствора нитробензола 1,5 г/дм³, в этом варианте фиксировали гибель всех парамеций.

В высокотоксичных растворах нитробензола 0,05 г/дм³, в присутствии перекиси 0,0001 % выживало 100 % дафний, а при внесении перекиси 0,00005 % выживаемость составила 77,3 %. В растворе нитробензола 0,1 г/дм³, после добавления перекиси водорода 0,0001 % погибало только 30,7 % рачков, а при уменьшении концентрации до 0,00005 % изменения токсичности не фиксировали.

В растворах анилина 1,0 г/дм³ инфузории выживали при содержании Н₂О₂ 0,0005 %, а в отсутствии перекиси наблюдали гибель всех особей при данной концентрации анилина.

Причиной падения токсичности нитробензола, по-видимому, является снижение его концентрации под действием перекиси водорода. При сравнении спектров поглощения растворов нитробензола и нитробензола в присутствии перекиси водорода не наблюдали изменения формы спектра, сдвига спектрального максимума л₂₇₀. Вместе с тем, оптическая плотность пика уменьшилась почти в 2 раза. Оптическая плотность разбавленных растворов нитробензола прямо пропорциональна концентрации вещества и изменение оптической плотности связано с уменьшением концентрации нитробензола приблизительно в 2 раза в результате окисления ароматического углеводорода перекисью водорода.

Ранее уже сообщалось (Pifer et al., 2003) об окислении нитробензола перекисью водорода. Но в этой работе использовали такой сильный катализатор как металлический палладий и деградацию ароматического углеводорода вели в более жестких условиях (высокая температура и давление). В наших опытах окисление нитробензола происходило при значительно меньших концентрациях перекиси водорода, в более мягких условиях и в отсутствии катализатора.

5.2. Извлечение нитробензола из толщи воды

Принцип метода заключается в том, что в водный раствор нитробензола добавляют суспензии парафина или эмульсии вазелинового, либо растительного масел и тщательно перемешивают. После отстаивания всплывший на поверхность гидрофобный продукт отделяется вместе со связанным им нитробензолом. Ниже приводится пример применения в качестве гидрофобного вещества парафина. Тестирование показало, что водные суспензии парафина при концентрации последнего 100 г/дм³ не оказывали негативного влияния на наиболее чувствительные из испытанных тест-объектов - дафний. Выявлено, что растворы нитробензола в концентрациях 0,05 г/дм³ и выше, вызывающие острое токсическое действие на дафний, после добавления суспензий парафина становятся совершенно безопасными для рачков. При использовании эмульсий растительного и вазелинового масел также происходило снижение токсичности растворов нитробензола. Например, в смеси растительного масла (3,0 см³/дм³) и нитробензола - (0,1 г/дм³) число выживших дафний составляло 30 %, а в отсутствии масла наблюдали гибель всех особей. В присутствии же нитробензола 0,1 г/дм³ в эмульсии вазелинового масла 3,0 см³/дм³, оставались живыми 53,3 % рачков. Гибели рачков не отмечали при соотношении: вазелиновое масло 3,0 см³/дм³ -- нитробензол 0,05 г/дм³, а при соотношении масло 1,0 см³/ дм³ -- нитробензол 0,1 г/дм³ выживало 60 % рачков.

Характер ультрафиолетовых спектров поглощения растворов нитробензола (0,05 г/дм³ и 0,03 г/дм³) до и после добавления к ним суспензий парафина (100 г/дм³) не менялся и длина волны (л = 270 нм) , при которой в спектрах наблюдали максимальное поглощение света, оставалась неизменной. Вместе с тем, оптическая плотность пика уменьшалась в 4 раза. В разбавленных растворах нитробензола, по крайней мере в диапазоне концентраций 0,05 - 0,01 г/дм³, закон Бугера - Ламберта - Бера соблюдался и, следовательно, концентрация нитробензола в растворе уменьшалась приблизительно в 4 раза после взаимодействия с парафином. Принимая во внимание полученные данные, в частности, отсутствие изменений в ультрафиолетовых спектрах поглощения растворов нитробензола и химическую инертность парафина можно предположить, что детоксикация нитробензола суспензией парафина обусловлена его сорбцией на парафине (рисунок 5).

_______ - нитробензол (0,03 г/дм³); __ __ __ - нитробензол (0,05 г/дм³);

…….. - нитробензол (0,03 г/дм³) + парафин;

_ _ _ _ - нитробензол (0,05 г/дм³) + парафин

Рисунок 5. Спектры поглощения растворов нитробензола и нитробензола в присутствии суспензии парафина 100 г/дм³.

С помощью микроскопирования проследили взаимодействие водных суспензий парафина и эмульсий растительного масла с водными эмульсиями нитробензола. Наблюдение показало следующее: капли нитробензола прикреплялись к затвердевающим каплям парафина в воде, а капли растительного масла притягивали капли нитробензола. Таким образом, микроскопирование еще раз подтвердило, что снижение токсичности нитробензола суспензиями парафина и эмульсиями вазелинового и растительного масел обусловлено связыванием нитробензола гидрофобными продуктами.

ВЫВОДЫ

1. Наиболее высокую чувствительность к ароматическим соединениям из испытанных тест-объектов проявляли дафнии и микроводоросли, менее чувствительными оказались ряска и элодея. По отношению к выбранным биотестам ароматические соединения образуют следующий ряд по убыли токсичности: нитробензол > анилин > бензол > толуол.

2. Добавление ГВ существенно снижало, а в ряде случаев, полностью предотвращало токсичное действие нитробензола, бензола, толуола, анилина для всех испытанных тест-объектов. Наиболее эффективными в плане детоксикации были препараты «Powhumus» и «Гумат 80» - они не только ослабляли летальные эффекты ароматических углеводородов, но в определенных концентрациях увеличивали количество лопастей ряски, стимулировали прирост в длину побегов элодеи и размножение парамеций.

3. Вермитрансформация приводила к частичной детоксикации образцов почвенных моделей, загрязненных нитробензолом, бензолом и толуолом, еще большее снижение токсичности ароматических углеводородов отмечали при совместном действии дождевых червей и гуматов.

4. С использованием ВЭЖХ и спектроскопии ЯМР изучена сорбция нитробензола из водных растворов ГК, выделенными из препаратов ГВ, и получены материалы, свидетельствующие в пользу того, что в основе детоксикации и связывания нитробензола ГВ лежит их способность взаимодействовать с нитробензолом по донорно-акцепторному механизму.

5. В определенных концентрацииях перекись водорода ослабляла токсичность нитробензола. Детоксикация нитробензола перекисью водорода происходит за счет снижения его концентрации в результате реакции окисления.

6. Разработан метод обезвреживания нитробензола, находящегося в толще воды, в основе которого лежит извлечение углеводородa суспензиями парафина или эмульсиями вазелинового и растительного масел.

7. Показана эффективность использования биотестов для исследования токсичности ароматических углеводородов. При тестировании водной среды наиболее перспективны методы, основанные на выживаемости дафний, изменении численности и флуоресценции хлорофилла клеток микроводорослей, а для почв - по выживаемости и изменению поведенческих реакций дождевых червей и тест по прорастанию семян.

ОПУБЛИКОВАННЫЕ РАБОТЫ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Стом Д.И. Влияние гумата «Powhumus» на токсичность тяжелых металлов и ароматических углеводородов / Д. И. Стом, О. Д. Таран, Д. С Потапов //Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. - Иркутск, 2006. - № 6. - С. 170-172.

2. Таран Д.О. Модификация токсичности нитробензола гуматами / Д. О Таран, Д. И. Стом, А. Г. Лухнев, О. А Бархатова //Гуминовые вещества в биосфере: Материалы докладов IV Всероссийской научной конференции. - М.: изд-во МГУ, 2007. - Т.2. - С.73-75.

3. Кондакова М.А. Структурные особенности водной матрицы «Гуминовое вещество - углеводород» в спектрах ЯМР ¹³С, ¹⁷О / М. А. Кондакова, А. Л. Бисикало, А. С. Богданова, Д. И. Стом, Д. О. Таран, Д. Ф. Кушнарев // Гуминовые вещества в биосфере: Материалы докладов VI Всероссийской научной конференции. - М.: изд-во МГУ, 2010. - Т.2. - С.78-79.

4. Таран Д.О. Влияние вермикультуры на изменение токсичности почвы, загрязненной нитробензолом / Д О. Таран, Д. И. Стом, О. А. Бархатова, А. С. Чеботнягин //Известия Иркутской государственной экономической академии (серия Экология). - № 5. - Иркутск, 2010. Режим доступа: [ http://eizvestia.isea.ru/reader/article.aspx?id=7149].

5. Стом Д.И. Использование «Powhumus» и «Гумат 80» для детоксикации нитробензола / Д. И. Стом, Д. О. Таран, М. Н. Саксонов //Известия Иркутской государственной экономической академии (серия Экология). - № 1. - Иркутск, 2011 . Режим доступа: [ http://eizvestia.isea.ru/reader/article.aspx?id=7566].

6. Стом Д.И. Детоксикация гуматами токсичных растворов из почв, загрязненных нитробензолом (модельные опыты) / Д. И. Стом, Д. О. Таран, Д. Ф. Кушнарев, В. К. Баранская, М. Н. Саксонов, А. С. Носякова //Агрохимия. - 2011. - № 6. - С. 78-81.

Прочие публикации

1. Таран Д.О., Баранская В.К., Лухнев А.Г. Влияние препаратов гуминовых веществ на некоторые ароматические углеводороды / Д. О. Таран, В. К. Баранская, А. Г. Лухнев // Х Всероссийской научно-практической конференции студентов и аспирантов «Проблемы безопасности современного мира: способы защиты и спасения «Безопасность - 07»» - Тезисы докладов. - Иркутск: изд-во ИрГТУ, 2007. - Т. 1. - С.108-111.

2. Таран Д.О. Комплексное действие перекиси водорода и ароматических углеводородов на красных калифорнийских червей / Д. О. Таран, В. К. Баранская, Е. А. Гулина // Х Всероссийской научно-практической конференции студентов и аспирантов «Проблемы безопасности современного мира: способы защиты и спасения «Безопасность - 07»» - Тезисы докладов. - Иркутск: изд-во ИрГТУ, 2007. - Т. 1. - С. 111-112.

3. Таран Д.О. Использование гуминовых веществ для детоксикации некоторых ароматических соединений / Д. О.Таран, Д. И. Стом, А. Г. Лухнев // Вестник Иркутского университета: Материалы ежегодной научно-теоретической конференции аспирантов и студентов. - Иркутск: изд-во ИГУ, 2007. - Т.1. - С.26-27.

4. Таран Д.О. Изменение токсического эффекта нитробензола в присутствии препаратов неочищенных гуминовых кислот / Д О. Таран, Д. И. Стом // ХI Всероссийской научно-практической конференции студентов и аспирантов «Проблемы безопасности современного мира: способы защиты и спасения «Безопасность - 08»» - Тезисы докладов. - Иркутск: изд-во ИрГТУ, 2008. - Т. 1.- С. 193-194.

5. Стом Д.И. Детоксикация почвы, загрязненной нитробензолом дождевыми червями / Д. И. Стом, Д.О. Таран, Д С. Потапов // Известия ИГУ, серия «Биология. Экология», 2008. - Т.1. - № 2. - С. 90-93.

6. Таран Д.О. Использование дождевых червей для детоксикации почв, загрязненных нитробензолом / Д. О. Таран // ХII Всероссийской научно-практической конференции студентов и аспирантов «Проблемы безопасности современного мира: способы защиты и спасения «Безопасность - 09»» - Тезисы докладов. - Иркутск: изд-во ИрГТУ, 2009. - Т. 1. - С. 282-283.

7. Таран Д.О. Влияние нитробензола на изменение численности клеток микроводорослей в присутствии гуматов / Д. О. Таран, М. Н. Саксонов // ХII Всероссийской научно-практической конференции студентов и аспирантов «Проблемы безопасности современного мира: способы защиты и спасения «Безопасность - 09»» - Тезисы докладов. - Иркутск: изд-во ИрГТУ, 2009. - Т. 1.- С. 283-284.

8. Таран Д.О. Влияние гидрофобных веществ на изменение токсичности нитробензола / Д. О. Таран, А. Э. Балаян // ХII Всероссийской научно-практической конференции студентов и аспирантов «Проблемы безопасности современного мира: способы защиты и спасения «Безопасность - 09»» - Тезисы докладов. - Иркутск: изд-во ИрГТУ, 2009.- Т. 1.- С. 284-285.

9. Саксонов М.Н. Изменение уровня флуоресценции хлорофилла водорослей при действии ряда ароматических углеводородов и дизельного топлива / М. Н. Саксонов, Д. О. Таран // ХII Всероссийской научно-практической конференции студентов и аспирантов «Проблемы безопасности современного мира: способы защиты и спасения «Безопасность - 09»» - Тезисы докладов. - Иркутск: изд-во ИрГТУ, 2009. - Т. 1.- С. 264-265.

10. Стом Д.И. Действие нитробензола на гидробионты и возможность его детоксикации / Д. И. Стом, Д. О. Таран, О. А. Бархатова //Х съезд гидробиологического общества при РАН. - Тезисы докладов. - Владивосток, 2009. - С. 382.

11. Саксонов М.Н. Влияние ряда токсикантов на люминесценцию клеток водорослей / М. Н. Саксонов, А. Э. Балаян, Д. О. Таран, О. А. Бархатова //XII Международная школа -- семинар по люминесценции и лазерной физике. - Тезисы докладов. - Иркутск, 2010. - С. 188 - 189.

12. Таран Д.О. Изучение совместного действия ароматических углеводородов и гумата на инфузорий / Д. О. Таран, М. Н. Саксонов, Д. И. Стом, О. А. Бархатова // В мире научных открытий. - Тезисы докладов. - - №4, Ч. 10. - Красноярск, 2010. - С. 70 - 71.

13. Таран Д. О. Использование гидрофобных веществ для детоксикации некоторых ароматических соединений / Д. О. Таран, Д. И. Стом, А. Э. Балаян // Междунар науч. конф. и междунар. шк. для мол. ученых «Проблемы экологии: чтения памяти проф. М. М. Кожова», Иркутск, 2010 г. - Тезисы докл. - Иркутск: изд-во ИГУ, 2010. - С. 471.

14. Способ детоксикации водной среды, загрязненной нитробензолом: пат. 2424197 Российская Федерация : МПК C02F1/58/C02F101/38 / Д.И. Стом, Д.О. Таран, А.Э. Балаян, М.Н.Саксонов; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО Иркутский госуниверситет - опубл. 20.07.11, Бюл. № 15 . - 3 С.

Размещено на Allbest.ru