Эколого-биохимическая характеристика микроорганизмов, участвующих в круговороте азота в щелочных гидротермах Прибайкалья

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

03.00.16 - Экология

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Эколого-биохимическая характеристика микроорганизмов, участвующих в круговороте азота в щелочных гидротермах Прибайкалья

Шагжина Айви Петровна

Улан-Удэ 2007

Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Баир Бадмабазарович Намсараев

Научный консультант:

доктор биологических наук

Яков Ефимович Дунаевский

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Александр Иванович Саралов

кандидат биологических наук, доцент

Любовь Батомункуевна Буянтуева

Ведущее учреждение:

Лимнологический институт СО РАН

Защита диссертации состоится «16» мая 2007 г. В 900 часов на

заседании диссертационного совета Д 212.022.03 в Бурятском

государственном университете по адресу: 670000, г. Улан-Удэ

ул. Смолина, 24а, конференц-зал.

Факс: (3012) 211593, e-mail: d21202203@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Бурятского государственного университета

Автореферат разослан « 13 » апреля 2007 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Шорноева Н.А.

Актуальность темы. Азот является одним из важнейших биофильных элементов, во многом определяющий характер и направление микробиологических процессов в различных экосистемах. Избыток или недостаток азотсодержащих соединений отражается на общей продуктивности водоемов. В настоящее время накоплен большой материал, освещающий круговорот азота в таких водных экосистемах как моря, океаны и озера (Кузнецов и др., 1989; Goering, Parker, 1972; Birch, Spiridakis, 1981; Knowles, 1982; Kuenen et. al., 1988; Zehr et al., 1998; Саралов, 1991; Zumpf, 1992; Koops, 2001; Lis, 2006).

В гораздо меньшей степени изучены особенности цикла азота в экосистемах, характеризуемых как экстремальные. В пределах Байкальской рифтовой зоны широко распространены слабоминерализованные источники, газирующие азотом с высокими значениями температуры (до 75оС) и рН (до 10). В щелочных термальных источниках проведено много исследований, посвященных азотфиксирующим цианобактериям. В то же время роль алкалотермофильных азотфиксирующих, нитрифицирующих и денитрифицирующих бактерий в биогеохимическом цикле азота изучена недостаточно.

Цель исследования - изучение бактериальных процессов цикла азота в гидротермах Прибайкалья, выделение и описание алкалотермофильных бактерий, участвующих в этих процессах.

Задачи исследования:

Изучение физико-химических параметров исследуемых щелочных термальных источников Прибайкалья.

Исследование сезонной динамики азотсодержащих соединений в илах.

Определение интенсивности бактериальных процессов цикла азота.

Изучение внеклеточной протеолитической активности в нативных образцах. круговорот азот термальный

Определение численности азотфиксирующих, аммонифицирующих, нитрифицирующих, денитрифицирующих бактерий по сезонам.

Выделение чистых культур бактерий цикла азота и изучение их физиолого-биохимических свойств и определение функциональной активности.

Научная новизна работ. Впервые проведена комплексная оценка интенсивности микробного цикла азота в щелочных гидротермах. Впервые изучено пространственно-временное распространение бактерий, участвующих в процессах трансформации азота в щелочных термальных источниках Прибайкалья. Определено вертикальное распределение бактерий круговорота азота, содержание органических веществ и внеклеточная протеолитическая активность микроорганизмов в илах гидротерм. Выделены накопительные и чистые культуры азотфиксаторов, аммонификаторов, нитрификаторов и денитрификаторов, способные

расти в щелочных условиях среды (рН до 10,2) при высоких температурах (до 700С ). Описана алкалотермофильная нитритокисляющая Nitrospira sp. с оптимумом роста при температуре 48оС и рН 8,7.

Практическая значимость. Количественная оценка функциональной активности микроорганизмов круговорота азота может быть использована для определения экологического состояния водных экосистем. Выделенные культуры представляют интерес для биотехнологии как активные продуценты протеаз, устойчивых к высоким значениям температуры и рН. Материалы, представленные в диссертации, могут быть использованы при чтении курса лекций по предмету “Микробиология”, "Биохимия", “Экология”.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на научно-практической конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004); 8-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2004); Южносибирской научной конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири» (Хакасия, 2004, 2005); Международной конференции “Экосистемы Монголии и приграничных регионов сопредельных стран: природные ресурсы, биоразнообразие и экологические перспективы”, Улан-Батор (Монголия) 2005; V межрегиональной научной конференции молодых ученых «Научный и инновационный потенциал Байкальского региона», (Улан-Удэ, 2006); Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» ИНМИ (Москва, 2005, 2006); Всероссийской конференции с международным участием «Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006).

Публикации. По теме диссертации, включая тезисы, опубликовано 14 работ.

Объем работы. Диссертация включает 9 глав и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка литературы (80 отечественных и 111 зарубежных источников) и приложения. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы и иллюстрирована 29 рисунками и фотографиями.

Благодарности Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н., проф. Б.Б. Намсараеву и сотрудникам Лаборатории микробиологии ИОЭБ СО РАН, научному консультанту д.б.н. Я.Е.Дунаевскому, д.б.н., проф. А.Л. Степанову, родным и близким.

Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке грантов: РФФИ 05-04-97215р_байкал_а; Президиума РАН «Происхождение и эволюция биосферы»; МО РФ № РНП. 2.1.1. НОЦ «Байкал»; Президиума СО РАН №24.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1.1. Объекты исследования

Объектами явились 10 термальных щелочных гидротерм Байкальского региона: Горячинск, Алла, Гарга, Кучигер, Уро, Сея, Умхей, Котельниковский, Змеиный, Хакусы. В газовом составе воды источников содержится до 98-99% молекулярного азота (Борисенко, Замана, 1978).

Объектами более детального рассмотрения процессов круговорота азота явились гидротермы Алла, Кучигер и Горячинск. Источник Алла и Кучигер находятся в Баргузинской долине (Северное Прибайкалье). Источник Горячинск расположен на юго-восточном побережье озера Байкал, где станция Г1 - излив источника, единственное место, которое характеризуется обильными обрастаниями циано-бактериальных матов. Далее по ручью, до станции Г3 сохраняются физико-химические параметры источника, после начинается постепенное снижение температуры, рН и изменение других химических показателей. Станция Г4 - проточный пруд. Станция Г5 расположена в месте смешения естественной воды источника со сточными водами прошедшими очистную обработку. Далее ручей протекает через залесенную местность и втекает в озеро Байкал - станция Г-6.

1.2. Методы исследования

Гидрохимический анализ воды был выполнен по общепринятым методикам. Температуру измеряли сенсорным электротермометром Prima (Португалия), рН определяли потенциометрически при помощи портативного рН-метра (рНер2, Португалия). Для определения окислительно-восстановительного потенциала использовали портативный измеритель redox-потенциала ORP (Португалия). Минерализацию воды определяли при помощи портативного тестер-кондуктометра TDS-4 (Cингапур).

Кислород в воде источника определяли методом Винклера (Резников и др., 1970). Концентрацию сульфида определяли колориметрически с пара-фенилендиамином на полевом спектрофотометре ПФЭК-П-2 (Trьper, Schlegel, 1964). Содержания карбонатов и гидрокарбонатов определяли титрованием (Резников и др., 1970). Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд (Досон и др., 1991), содержание органического вещества - по методу Тюрина в модификации Никитина (Аринушкина, 1979). Концентрацию общего азота определяли по Къельдалю, минеральных форм азота - колориметрически (Аринушкина, 1979) и фотометрически (Лурье, 1984).

Пробы грунтов, микробных матов и растительных остатков для микробиологического исследования отбирали в стерильную посуду. Общую численность микроорганизмов в илах определяли путем подсчета бактерий на мембранных ультрафильтрах (Романенко, Кузнецов, 1974) с диаметром пор 0,23 мкм (фирма Сынпор).

Численность азотфиксирующих, аммонифицирующих, денитрифицирующих и нитрифицирующих бактерий в образцах ила определяли путем посева на элективные питательные среды с учетом температуры и рН in situ методом десятикратных разведений. Значения рН среды доводили карбонатно-гидрокарбонатным буфером. Биохимические свойства бактерий, удельную скорость роста, численность бактерий определяли общепринятыми методами (Методы.., 1984). Молекулярно-генетические анализы выделенных штаммов проводили на коммерческих условиях. Транслированные аминокислотные последовательности сравнивали с последовательностями из Gen Bank, используя программы NCBI BLAST (http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast).

Определение внеклеточной протеазной активности в экстрактах природных образцов на основе фосфатного буфера (рН 7) и в культуральной жидкости проводили по методу Эрлангера с соавт. (Erlanger et.al., 1961), используя 5 мМ синтетические субстраты N-бензоил-L-аргинил-п-нитроанилид (БАПА), карбобензокси-аланил-аланил-лейцил-п-нитроанилид (КААЛП), пироглутамил-аланил-аланил-лейцил-п-нитроанилид (ГААЛП) а также с помощью тринитрофенилирования, используя 1%-ный белковый субстрат желатин (рН 8). Инкубировали в течение 1, 12 и 24 часов при температуре 370С, с последующим спектрофотометрическим определением активности при 410 нм. За единицу ферментативной активности принимали количество фермента в исследуемом образце, которое расщепляет 1 нмоль продукта в указанных условиях инкубации за 1 минуту. Для выяснения природы функциональных групп активного центра штаммов к раствору фермента добавляли раствор соответствующего ингибитора, инкубировали 40 минут при температуре 370С, затем добавляли раствор субстрата и определяли активность, как указано выше. В работе использовались ингибиторы металлопротеаз- этилендиаминтетраацетат Na (ЭДТА), цистеиновых протеаз - иодацетамид (ИAA) и сериновых протеаз - фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ). Для определения оптимума рН активности исследуемых протеиназ по отношению к синтетическим субстратам были использованы цитрат-фосфатные, фосфатные, гидрокарбонатные буферы (Досон и др., 1991) в диапазоне рН 2-11. Температурный оптимум ферментов определяли, измеряя их активность после 5-минутной инкубации при температурах от 20-800С.

Скорости деструкции белка и целлюлозы были измерены аппликационным методом (Мишустин, Петрова, 1987).

Интенсивности процессов дыхания, азотфиксации и денитрификации измерены газохроматографически (Методы.., 2002). Анализ газов (С2Н4, N2O и СО2) проводили на газовых хроматографах Chrom-41 и М-3700/4 (Россия). Общее время инкубации составляло 1-2 часа при определении эмиссии CO2, и 12-48 часов при определении эмиссии N2O. Определение активности денитрификации и азотфиксации проводили в присутствии ацетилена, который вводили во внутренний объем изолятора (10% от объема камеры). Потенциальную (субстрат-индуцированную) активность дыхания и фиксации молекулярного азота, интенсивность эмиссии закиси азота определяли после обогащения образцов донных осадков соответствующими субстратами (Методы.., 1991). Интенсивность процессов нитрификации изучали согласно Кузнецову (1970).

Определение интенсивности бактериальных процессов и химических показателей в образцах илов проводили в нескольких повторностях. Статистическая обработка данных выполнена стандартными методами по Плохинскому Н.А. (1961); Ашмарину И.П., Воробьеву А.А. (1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Физико-химическая характеристика исследуемых термальных источников Прибайкалья

Для исследования были отобраны пробы воды, илов, микробных матов и растительных остатков из гидротерм: Горячинск, Алла, Гарга, Кучигер, Уро, Сея, Умхей, Котельниковский, Змеиный, Хакусы. Температура воды на выходах термальных источников варьировала в широких пределах (45,5 - 76,2оС). Наиболее высокотемпературными были источники Уро (69,9оС), Котельниковский (71,0 оС), Гарга (72,5 оС), Алла (76,2 оС). Воды имели щелочную реакцию, значение рН варьировало от 7,6 до 9,9. Температура и рН в термальных водах снижалась по мере удаления от излива.

Максимальные концентрации сероводорода были зафиксированы в источниках Кучигер (23 мг/л) и Умхей (33 мг/л). В гидротермах отмечены низкие значения окислительно-восстановительного потенциала (до +103 Мв). Концентрация сероводорода по ручью уменьшалась, концентрация кислорода и значения Eh увеличивались.

Содержание гидрокарбонатов в воде исследуемых проб достигало 167,7 мг/л. Для источников характерна низкая минерализация, которая была в пределах от 0,15 до 0,8 мг/л.

Источник Кучигер, расположенный в болотистой местности, содержал до 19,2% органического углерода. Наименьшее количество органического углерода 0,3 - 0,4% определено в источнике Алла, выходы которого приурочены к каменистой местности. Количество белка в исследуемых пробах составляло от 0,36 (ист. Алла) до 0,83 мг/мл (ист. Гарга). В целом концентрация органического вещества в матах и растительных остатках была выше, чем в илах.

Общее количество азота в илах источников варьировало от 0,09 до 2,77 %. Максимальное количество аммонийного азота равное 2,34 мг/100г определено в источнике Кучигер, минимальное - 0,78 мг/100г в источнике Горячинск. Содержание нитритного и нитратного азота в некоторых пробах илов было ниже предела чувствительности прибора. Максимальные концентрации нитритного и нитратного азота были определены в источнике Кучигер и достигали 0,13 мг/100г.

2.2. Сезонные изменения условий среды в источнике Горячинск

Максимальная температура воды (51,5 оС) источника на изливе (ст. Г1) зафиксирована зимой. В летнее время температура снижается до 47 - 48,5 оС. Вниз по ручью наблюдается постепенное уменьшение температуры воды. Летом температура воды на станциях Г5 и Г6 составляет 25 и 18,7 оС, соответственно. Значения температуры воды на станциях Г4, Г5 и Г6 следовали изменениям температуры воздуха. Максимальное значение рН равное 9,0 отмечено на станции Г1 и в течение года ее величина держится приблизительно на одном уровне. Далее по течению отмечено постепенное понижение величины рН до 7,2 и 6,7 (ст. Г6).

Концентрация кислорода в термальном источнике Горячинск увеличивается по ручью и в среднем составляет 1,1 - 4,2 мг/л. В летний период времени на изливе источника отмечено увеличение содержания растворенного кислорода в воде. Максимальное содержание сероводорода в источнике отмечено осенью на станции Г3 в количестве

1,22-1,33 мг/л (рис.1). По концентрации гидрокарбонатов и карбонатов в источнике было отмечено, что в точках максимума гидрокарбонатов наблюдается минимум карбонатов и наоборот. В течение года максимальное количество карбонатов было обнаружено в конце зимы, максимальное количество гидрокарбонатов - летом.

Определение динамики подвижных форм азота в илах выявило разное их содержание по сезонам (рис. 2). Максимальное содержание аммонийного азота в илах источника Горячинск было определено летом, минимальное - весной. В то же время весной отмечено увеличение нитратного азота почти вдвое по сравнению с осенними показателями. Наименьшее количество нитритного азота было определено летом.

Соотношение Сорг./Nобщ. в илах варьировало в пределах от 8 до14

в течение года. На станциях Г1, Г4, Г6 соотношение Сорг./Nобщ. с октября по май держалось на одном уровне в пределах 10-12, и только в летнее время отмечено небольшое снижение на фоне повышенного содержания в источнике аммонийного азота.

Концентрации кислорода, карбонатов, гидрокарбонатов, подвижных форм азота в источнике подвержены внутригодовой динамике. При этом основные факторы среды, такие как температура, рН и минерализация, остаются относительно постоянными.

3.1. Численность функциональных групп бактерий, участвующих в круговороте азота в щелочных гидротермах Прибайкалья

Во всех исследуемых пробах была определена численность азотфиксаторов, аммонификаторов (протеолитиков), нитрификаторов и денитрификаторов. Ключевую роль в биологическом круговороте азота

играют микроорганизмы, фиксирующие молекулярный азот. Численность азотфиксирующих бактерий колебалась от 2,0 Ч102 до 5,5Ч107кл/мл. Максимальная численность азотфиксаторов наблюдалась в пробах источников Горячинск, Алла, Котельниковский. Многократный анализ показал, что при количестве аммония до 1,0 мг/100г ила корреляции содержания аммония с численностью азотфиксаторов не обнаружено, а при повышенном содержании аммония (>1,0 мг/100г) наблюдается обратная зависимость (rср = -0,71). Поэтому невысокая численность азотфиксаторов в источниках Кучигер и Сея, вероятнее всего, связана с повышенным содержанием аммония. В то же время именно в этих источниках была определена наиболее высокая численность бактерий, участвующих в минерализации белков - аммонификаторов. Численность аммонифицирующих бактерий в изученных гидротермах составляет от 1,3Ч103 до 7,0Ч108 кл/мл и коррелирует с содержанием аммония (rср = 0,65). Наибольшее количество аммонификаторов было выявлено в матах и растительных остатках. Количество нитрификаторов I и II фазы в илах источников Горячинск, Алла и Гарга достигало: аммонийокисляющих бактерий - 1,3Ч106 кл/мл, нитритокисляющих бактерий - 4,7Ч105 кл/мл. Обнаружены корреляции численностей нитрификаторов I и II фазы с содержанием аммония (rср = 0,43) и нитратов (rср = 0,64), соответственно. Наибольшее количество бактерий - денитрификаторов (6,3Ч105 кл/мл) наблюдалось в илах источников Кучигер, Сея и Змеиный. Минимальное количество (1,7Ч101 кл/мл) было зафиксировано в пробах источников Алла и Горячинск. Следует отметить, что была установлена линейная зависимость между численностью денитрификаторов с нитратами (rср = 0,63), с нитритами (rср= 0,51) и аммонием (rср= 0,49). Корреляционной связи численности бактерий цикла азота с температурой, рН и минерализацией в исследуемых источниках не установлено.

В источнике Горячинск было изучено вертикальное распределение бактерий по глубине грунта. На станции Г4 максимальная численность бактерий цикла азота определена в поверхностном слое ила (до 2 см) и в придонной воде. На стациях Г1 и Г6 максимальное количество азотфиксаторов и денитрификаторов находится в слое 2-5 см, аммонификаторов - в слое 2-10 см. Нитрифицирующие бактерии были обнаружены только на поверхности (до 2 см), в слое 2-5 см их численность не превышала 0,5Ч101 кл/мл. На глубине 20-30 см выявлено значительное уменьшение численности азотфиксаторов, аммонификаторов и денитрификаторов. Отмечена прямая зависимость (rср = 0,87) между количеством белоксодержащих соединений с численностью аммонификаторов, характерная для всех изученных слоев ила.

3.2. Сезонная численность бактерий в источнике Горячинск

Наименьшая общая численность микроорганизмов (ОЧМ) отмечена в ноябре - 1,35Ч106 кл /мл, наибольшая - в мае (8,1Ч 108 кл /мл). Наибольшее количество азотфиксаторов 4,3Ч107 кл /мл обнаружено в феврале, наименьшее (1,3Ч102 кл /мл) - в августе, что определяется количеством аммонийного азота в илах. Максимальная численность аммонификаторов была отмечена весной, минимальная - летом и осенью. Численность денитрификаторов варьировала от 6,0Ч101 до 4,7Ч105 кл/мл, нитрификаторов от 3,0Ч101 до 1,3Ч106 кл/мл (рис. 3). Повышение количества бактерий в феврале происходит за счет накопления за зимний период легкоусвояемых источников углерода и энергии.

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Уменьшение количества азотфиксаторов летом и осенью определяется увеличением аммонийного азота в этот период. Летнее снижение концентрации нитратов и нитритов в илах при низком содержании нитритокисляющих и денитрифицирующих бактерий обусловлено использованием легкоусвояемых форм азота цианобактериальным сообществом, активно развивающимся в это время. Изменение структуры микробного сообщества в гидротерме связано с сезонными колебаниями физико-химических параметров среды и содержанием минеральных форм азота, которые накапливаются за счет поступления из прибрежной зоны и функционирования биоты.

Детальное изучение зависимости физико-химических условий и численности бактерий в источнике Горячинск позволило установить, что численности азотфиксаторов (rср= - 0,36), аэробных аммонификаторов (rср= - 0,44) и нитрификаторов (rср= - 0,61) отрицательно коррелируют с концентрацией сероводорода. Корреляция содержания сероводорода с численностями денитрификаторов и анаэробных аммонификаторов отсутствует. Содержание кислорода положительно коррелирует с численностью нитрификаторов (rср= 0,73), отрицательно - с численностью денитрификаторов (rср= - 0,34); с численностью азотфиксаторов и аммонификаторов корреляции не обнаружено.

Таким образом, в источниках основными факторами, влияющими на численность бактерий круговорота азота, являются: содержание минеральных форм азота, качественный и количественный состав органических веществ, содержание сероводорода и кислорода в придонной воде.

4.1. Эмиссия СО2 в илах источников Прибайкалья

Значения динамики дыхания варьировали в пределах от 0,07 мкг С-СО2/ г в час до 0,96 мкг С-СО2/г в час. Максимальные значения наблюдались в местах с повышенным содержанием органических веществ. Высокие значения биологической активности илов выявлены в источнике Кучигер, величина скорости эмиссии СО2 составила 0,96 мкг С-СО2/г ч и 0,73 мкг С-СО2/ г ч соответственно. Высокая эмиссия диоксида углерода подтверждается высокими величинами скорости минерализации илов в источнике Кучигер, скорость деструкции белоксодержащих соединений достигала 2,43% в сутки, целлюлозы - 1,2 % в сутки. Самый низкий показатель дыхания обнаружен в пробах источника Алла (Ал 9/4) и Горячинск. Корреляция интенсивности дыхания илов с содержанием Сорг в илах источников составило rср= 0,82.

Исследование динамики дыхания за период осень - весна в илах источника Горячинск показало, что величина потока диоксида углерода изменялась от 0,073 до 0,281 мкг С-СО2/г ч в ноябре и от 0,276 до 0,629 мкг С-СО2/г ч в марте. Показатели потенциальной интенсивности дыхания в исследованных образцах ила на 1-2 порядка выше актуальных.

4.2. Денитрифицирующая и азотфиксирующая активность в илах источников Прибайкалья

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Значения азотфиксирующей активности в минеральных источниках варьировали от 0,002 нг N2/г ч до 0,499 нг N2/г ч (рис.4). Относительно высокие значения выявлены в гидротерме Горячинск (Г-4, Г-6). Здесь азотфиксация была равна 0,499 нг N2/г ч и 0,447 нг N2/г ч. Наиболее низкие значения были установлены в илах источников Алла (Ал 9/3) и Кучигер (Кu 8-20).

Оценка процесса денитрификации в илах минеральных источников показала, что активность была в пределах 0,024 - 0,661 нг N2O/г ч. Максимальное выделение закиси азота выявлено в термальном источнике Алла на станции Ал 9/4 (0,661 мкг N2O/ г ч). Наиболее низкие показатели денитрифицирующей активности установлены в илах термального источника Горячинск. Активность денитрификации в этом источнике не превышала 0,035 нг N2O/ г ч (рис.5).

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Сезонная динамика процессов азотфиксации, нитрификации и денитрификации в илах источника Горячинск. Результаты межсезонных исследований процесса азотфиксации в илах показали увеличение нитрогеназной активности весной до 0,584 нг N2/г ч (рис. 6). Значения скорости азотфиксации коррелируют с сезонной динамикой численности азотфиксирующих бактерий. Весной численность диазотрофов достигала максимума - 10 млн кл/мл. На станциях, где были определены максимальные величины азотфиксирующей активности, величина соотношения С/N варьировала в пределах 10-12, что является благоприятным условием для процесса азотфиксации. Эти результаты согласуются с данными исследований в других биотопах (Саралов и др., 1982, Новиков и др., 2004). Таким образом, наиболее важными регулирующими факторами активности азотфиксации в различных экосистемах является обеспеченность усвояемым азотом и качественный состав органического вещества.



Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Изучение нитрифицирующей активности бактерий в илах выявило ее низкую скорость, которая варьировала в пределах от 0,3 до 1,5 нг NO3-/ г в сутки - осенью и 1,1-2,4 нг NO3-/ г в сутки - весной (рис. 7). Численность нитрифицирующих бактерий по ручью источника составила: осенью от 1,7Ч103 до 5,0Ч104кл./мл, весной - увеличилась на порядок.

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Определение активности денитрификации в разные сезоны, также как и активности процесса нитрификации, не выявило существенных межсезонных различий (рис. 8). В осенних образцах илов активность денитрификации была ниже предела чувствительности прибора. Отсутствие денитрифицирующей активности микроорганизмов в илах источника Горячинск, объясняется низкой нитрифицирующей активностью и, как следствие, низким содержанием нитратов. Незначительное увеличение скорости денитрификации в весенних образцах илов коррелирует с численностью денитрификаторов. Денитрифицирующей активности бактерий в весенний период способствуют более благоприятные физико-химические условия источника, в частности, увеличение нитратов почти в 2 раза и снижение содержания растворенного кислорода в воде.

Потенциальная активность процессов азотфиксации и денитрификации в образцах ила после обогащения глюкозой увеличилась в 3-20 раз. В этих условиях наибольшая активность азотфиксации (0,23 мкг N2 /г ч) и денитрификации (0,39 мкг N2O/г ч) была зафиксирована при температуре 51,5 оС и значении рН 9,0 (ст. Г1), хотя актуальная азотфиксирующая активность бактерий в илах на станции Г 1 была низкой. Вероятно, это связано с активной нитрогеназной деятельностью цианобактерий (Anabaena. variabilis, Calotrix termalis, Gloeocapsa punctata, Gl. minuta), обнаруженных на той же станции, и подавление ими бактериальной азотфиксирующей активности.

На станции Г 3 выявлена низкая активность процессов цикла азота. Это связано с токсичным воздействием сероводорода (1,33 мг/мл) и, как следствие, ингибированием процессов.

Таким образом, в щелочной гидротерме Горячинск нитрогеназная активность может проявляться в широком диапазоне температур от 22 до 510С и значениях рН от 7,6 до 9,0. Основными факторами, определяющими интенсивность биологических процессов круговорота азота в исследуемой гидротерме, являются: наличие органического вещества, минеральных форм азота, концентрация сероводорода и кислородный режим.

5. Внеклеточная протеолитическая активность в нативных образцах термальных источников Прибайкалья

Образцы микробных матов, растительных остатков и илов были отобраны из точек отбора в гидротермах, которые характеризовались различными значениями температур 18,7 - 69,0оС (табл. 1).

Таблица 1

Типы проб, места отбора и температура

Источник	№	Точки отбора и температура отбора ( оС)
		1	2	3	4	5	6
Гор-к	1	м.м. - 49,0	ил - 49,0	ил - 45,0	ил - 22,7	ил - 25,0	ил - 18,7
Котель-й	2	м.м. - 65,3	м.м. - 48,0	ил - 48,0	ил - 45,5	ил - 39,0	ил - 32,0
Змеиный	4	м.м.- 45,5	ил - 45,5	-	-	-	-
Хакусы	5	м.м. - 46,0	ил - 46,0	-	-	-	-
Гарга	6	м.м. - 66,4	р.о. - 57,4	ил - 49,8	ил - 42,0	м.м.- 42,0	ил - 33,5
Сея	7	ил - 49,8	м.м. - 46,5	ил - 46,5	м.м. - 34,0	ил - 31,4	ил - 31,0
Уро	8	м.м. - 69,0	ил - 64,0	м.м. - 52,1	м.м. - 44,2	ил - 44,2	ил - 33,8
Алла	9	м.м. - 65,2	ил - 60,0	ил - 49,0	ил - 49,0	ил - 24,0	ил - 23,5
Кучигер	10	ил - 47,2	м.м. - 45,9	р.о.- 43,0	м.м. - 41,0	ил - 41,0
Умхей	11	р.о.- 47,6	р.о.- 45,7	м.м. - 41,7	ил - 41,7	ил - 39,0

Гор-к .- Горячинск, Котель-й - Котельниковский.

м.м. - микробный мат; р.о. - растительные остатки; «-» - пробы не отобраны

Скорость бактериального разложения белоксодержащих соединений в исследуемых источниках составила от 1,25 до 2,43%, максимальные скорости деструкции отмечены в источниках Кучигер (2,43%) и Умхей (2,14%).

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Максимальная внеклеточная протеолитическая активность по субстрату БАПА (рис. 9) зафиксирована в илах источника Котельниковский (1,65 - 2,29 ед.) и циано-бактериальных матах источника Гарга (1,93 - 2,27 ед.). Для источника Алла характерно увеличение продукции трипсиноподобных протеаз при повышении температуры. Максимальная активность (1,43 ед.) отмечена при температуре 65,2оС. В образцах источников Змеиный, Хакусы, Кучигер и Умхей значения протеазной активности по БАПА составили от 0,48 до 1,07 ед. Образцы источников Сея, Горячинск, Уро характеризовались низкими значениями активности. Исключение составляли микробные маты, где активность была в 6-7 раз выше, чем в илах. Относительно постоянные физико-химические условия, качественный и количественный состав органических веществ в циано-бактериальных матах способствует активному развитию в них различных бактерий - деструкторов.

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Максимальные значения протеазной активности по субстрату КАЛЛП (рис. 10) в источниках Уро, Гарга, Сея и Змеиный были выявлены в образцах микробных матов. Активность образцов циано-бактериальных матов превышает активность илов в 3 - 5 раз. В источниках Сея и Змеиный активность по данному субстрату проявилась только в микробных матах - 1,46 ед. (точка 2) и 1,31 (точка 1), соответственно. Источники Хакусы, Алла и Умхей характеризовались средними значениями активности - от 0,19 до 0,9 ед. Наименьшей активностью по субстрату КААЛП обладли образцы из источников Котельниковский (0,07 - 0,19), Горячинск (0,154 - 0,29) и Кучигер (0,15 - 0,30).

Наибольшие активности по ГААЛП (рис. 11) обнаружены в циано-бактериальных матах источников Сея (2,36 ед.) и Алла (2,18 ед.). Также высокую активность по этому субстрату проявляют термальные источники Гарга (0,20 - 1,56 ед.) и Горячинск (0,14 - 0,75 ед.). В источнике Горячинск субтилизиноподобная активность возрастает с повышением температуры. Протеазная активность по субстрату ГААЛП исследуемых образцов из источников Котельниковский, Змеиный, Хакусы, Уро, Кучигер и Умхей либо отсутствовала, либо характеризовалась низкими значениями.

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Наиболее высокая общая внеклеточная протеолитическая активность (рис. 12), определенная методом тринитрофенелирования, выявлена в источнике Кучигер - от 4,54 до 9,09 ед. в илах и 30,30 - 35,15 ед. в циано - бактериальных матах. Активное разложение желатина было отмечено в образцах источников Умхей (4,55 - 27,42 ед.) и Уро (7,15 - 26,03 ед.). Пробы из источника Алла характеризовались незначительной активностью по желатину (1,30 - 6,06 ед.).

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Исследованные по слоям илы показали высокую ферментативную активность (рис. 13). На станции Г6 на глубине 25-30см, при минимальном количестве бактерий также наблюдалась высокая протеазная активность. Результаты данных исследований показывают, что в деструкции белоксодержащих соединений в исследуемых илах в основном участвуют сериновые протеазы субтилизиноподобного типа. Определение корреляции в илах показало прямую зависимость протеолитической активности от содержания органических веществ rср= 0,91.

Полученные результаты позволяют заключить, что микробное сообщество щелочных термальных источников обладает широким спектром внеклеточных протеаз и характеризуется высокой вариабельностью в распределении протеазной активности по субстратам. Выявлено, что на протеазную активность оказывают существенное влияние тип субстрата, физико-химические условия источников и их специфическое микробное сообщество. Наибольшие значения протеазной активности в нативных образцах характерны для микробных матов. Проведенные исследования показали высокую степень участия внеклеточных ферментатов в деструкции органического вещества в термальных источниках.

6. Выделение и описание бактерий участвующих в круговороте

азота в гидротермах Прибайкалья

Азотфиксирующие бактерии. Для оценки нитрогеназной активности бактерий было отобрано 8 наиболее активно растущих изолята: штаммы АТ2 и АТ3 с диапазоном роста от 30 до 550С (оптимум 45-500С) и pH от 6,5 до 10,0 (оптимум pH 8,7-9,2) и 6 штаммов (А1, А2, А3, А4, А5, А6) с ростом в пределах от 15 до 400С (оптимумы 25 - 350С) и рН от 5,0 до 9,2 (оптимумы 7,1 - 8,2). Полученные изоляты используют широкий ряд сахаров. По морфо-биохимическим признакам азотфиксирующие изоляты были отнесены к представителям родов Pseudomonas, Bacillus, Clostridium.

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Интенсивность фиксации молекулярного азота выделенных штаммов составляла от 0,017 до 1,81 нм N2/107кл ч. (рис.14). Максимальное количество фиксированного азота было зарегистрировано у штаммов А5 (1,81 нм N2/107кл ч) и АТ2 (1,26 нм N2/107кл ч). По морфо-биохимическим признакам штамм А5 (источник Алла) был отнесен к представителю рода Clostridium.

Штамм АТ2, выделенный из щелочного термального источника Горячинск (Г 1) при росте на твердой среде образует колонии 0,2-1,5 мм в диаметре, белого цвета. Клетки - грамположительные, спорообразующие, подвижные прямые палочки 0,3-0,5x 1,1-2,5 мкм. Факультативный анаэроб. При анаэробном росте сбраживает глюкозу, рамнозу, ксилозу и дульцит. Умеренный термотолерантный алкалофил. Рост в пределах 30-55C с оптимумом 45C и в области рН 6,5-10 с оптимумом pH 8,7. На основании данных частичного секвенирования генов 16S рРНК исследуемый штамм АТ2 показал сходство 99,5% с Anoxybacillus pushchinоensis (рис. 16) .

Денитрифицирующие бактерии. В накопительных культурах, полученных на среде Гильтая при различных значениях температуры и рН, в основном присутствовали палочки и только при инкубации культур при 50 ОС и рН 9,0 - 9,3 в среде были обнаружены еще очень мелкие клетки - предположительно археи, которых не удалось выделить в отдельную культуру. Рост денитрификаторов регистрировался с активным образованием газов.

Для дальнейших исследований были отобраны штаммы DM и DАТ. Изолят DАТ, выделенный из источника Алла, был отнесен к умеренным алкалотермофилам. Культура развивается в пределах 30 - 550C с оптимумом 450C и в области рН 6,0 - 9,2 с оптимумом 9,0. Штамм DM (Горячинск, станция Г4) показал активный рост в пределах от 15 до 400C с оптимумом 250C и при рН среды от 6,0 до 8,2 с оптимумом 7,5.



Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Штаммы обладали высокой денитрифицирующей активностью: DАТ - 2,28 нм N-N2О /107 кл ч и DМ - 1,68 нм N- N2О /107 кл ч (рис.15). Выделенные штаммы денитрификаторов были проверены на способность фиксировать молекулярный азот. Незначительная нитрогеназная активность равная 0,03 нм N2/107кл ч была обнаружена у термотолерантного алкалофильного штамма DАТ (рис.16). Грамположительный, спорообразующий штамм DАТ, представленный палочками 0,3-0,8 х 1,5-3,5 мкм, из широкого ряда используемых им углеводов активнее развивается на манните. Результаты анализа сиквенса 16S рРНК (500 пар нуклеотидов) показали, что штамм принадлежит к роду Bacillus. Коэффициент сходства составил 99,7% с B. liсheniformis (рис. 16).

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Рис.16. Филогенетическое дерево бацилл, показывающее положение штаммов АТ 2, DАТ, П 1 в системе порядка термофильных Bacillus. В качестве «внешней группы» использована нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК E. сoli.

Аммонифицирующие бактерии. Из накопительных культур было выделено 4 штамма (П1, П2, П3, П4), спорообразующих аэробных гетеротрофных бактерий. Клетки имели форму крупных прямых палочек. На твердых средах образовывали колонии - от 1 до 4 мм желтого или бежевого цвета. Все штаммы являются термофилами с диапазоном роста 35 - 700С с оптимумами 45-650С и pH 6,0 - 10,2 с оптимумами 8,0-8,5.

Проведенные исследования показали, что все культуры обладают высокой внеклеточной протеолитической активностью. По субстрату БАПА максимальная активность через 12 часов инкубирования проб, равная 1,71 ед./мг, обнаружена в культуре П3. На субстрате КААЛП активность практически отсутствовала, кроме культуры П1 (1,32 ед./мг). Максимальная активность на субстрате ГААЛП для субтилизиноподобных протеаз была зафиксирована в культуре П2, равная 3,76 ед./мг. Все выделенные культуры показали высокую активность по желатину от 2,46 до 2,61 ед/мг. Внеклеточная протеолитическая активность 24-часовых культур была в 2-3 раза выше 12-часовых.

Штамм П1 показал самый высокий оптимум температуры (600С), рН (8,5) и явился активным продуцентом внеклеточных протеаз. На основании данных неполного секвенирования генов 16S рРНК штамм П 1 имеет сходство 99,3% с представителями рода бацилл Anoxybacillus pushchinоensis и Anoxybacillus bogroviensis (рис. 16) .

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Анализ субстратной специфичности и ингибиторный анализ показали, что фермент секретируемый штаммом П 1 активен по отношению к нитроанилидным субстратам трипсиноподобных протеаз. Фермент имеет оптимум pH 10,5 и стабилен в интервале рH от 6 до 11 (рис. 17 а). Температурный оптимум протеазы около 650С (рис. 17б).

Штамм П 1 является активным продуцентом внеклеточных щелочных протеолитических ферментов, относящихся к классу сериновых протеаз, которые активно секретируются при высоких температурах, что позволяет отнести их к алкалотермофильному виду.

Аммонийокисляющие и нитритокисляющие бактерии

I фаза нитрификации Первоначально, аммонийокисляющие алкалотермофильные бактерии, выросшие при температуре 48 0С и рН 8,5, показали активный рост, но при дальнейших пересевах культура была утеряна. В ходе эксперимента отмечалось сильное подкисление среды. Максимальная скорость окисления аммония накопительной культурой определенна на 5 сутки в количестве 0, 71 мМ NН4+/сутки. На 6 сутки следов аммония в среде не обнаружено. В накопительной культуре присутствовало 2 разных морфотипа бактерий, активно окисляющих аммоний. Электронное микроскопирование бактерий не позволило определить их принадлежность к какому-либо роду известных на сегодняшний день аммонийокисляющих бактерий.

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

I

I фаза нитрификации Накопительная культура алкалотермофильных нитритокисляющих бактерий показала стабильный рост в лабораторных условиях. Результат жизнедеятельности нитритокисляющих бактерий не оказывал влияния на значение рН в среде, он был постоянен и составлял в ходе всего эксперимента 8,5. Динамика роста накопительной культуры при различных значениях рН обозначилась в области от 6,5 до 9,8. В накопительной культуре присутствовало, по крайней мере, 2 вида нитритокисляющих бактерий с оптимумами рН 7,1 и 8,7. Определение динамики роста при различных значениях температур выявило рост культуры пределах от 36 до 60 оС. Максимальное окисление нитритов было определено на 3-и сутки при температуре 48 оС (0,92 мМ NO2-/сутки) и при температуре 53 оС (0,61 мМ NO2-/сутки).

Описан изолят, активно окисляющий нитриты с образованием нитратов при алкалотермофильных условиях среды. Температурный диапазон роста культуры отмечен от 36 до 55оС с оптимумом 48оС. Максимальная скорость потребления нитритов при 48оС отмечена на 3 сутки в количестве 0,38 мМ NO2-. При определении оптимума рН было установлено, что культура окисляет нитриты в диапазоне рН среды от 6 до 9,7 с оптимумом 8,7. Максимальная скорость окисления была отмечена на 3 сутки в количестве 0,41 мМ NO2- (рис.18). На 4 сутки следов нитритов в среде не обнаружено. Присутствие нитратов в среде проверяли качественной реакцией. Микроскопирование тотальных клеток и ультратонких срезов нитритокисляющего штамма показало, что выделенная грамотрицательная культура является представителем рода Nitrospira (рис. 19). Из полученных данных мы заключили, что выделенная культура Nitrospira sp. относится к новому алкалотермофильному виду хемолитотрофных нитритокисляющих бактерий.

ВЫВОДЫ

1. В исследованных щелочных гидротермах Прибайкалья численность азотфиксаторов, аммонификаторов, нитрификаторов и денитрификаторов составляет от 1,7 Ч101 до 7,0Ч108 кл/мл. Основным регулирующим фактором сезонного изменения численности бактерий круговорота азота является содержание минеральных форм азота, качественный и количественный состав органического вещества, а также содержание сероводорода и кислорода в воде и илах.

2. Значительные скорости азотфиксации в илах источника Горячинск, равные 0,16 и 0,58 нг N2 /г ч, определены весной при температурах 50,5 и 12,2оС, рН 9,0 и 7,4, соответственно. В илах источника Горячинск отмечены низкие скорости нитрификации и денитрификации, активность которых незначительно возрастает весной. Эмиссия СО2 в илах источника определяется содержанием органического вещества, коэффициент корреляции составляет rср= 0,82.

3. Во всех исследованных гидротермах с различными значениями температуры и рН среды показана высокая протеолитическая активность нативных образцов и выделенных культур аммонификаторов, которая свидетельствует об активном участии микробного сообщества в деструкции белоксодержащих соединений.

4. Среди выделенных чистых культур бактерий азотфиксаторов, аммонификаторов и денитрификаторов доминировали представители родов Bacillus, способные развиваться при 30 - 700С и рН 6-10. Азотфиксирующие изоляты обладали высокой нитрогеназной активностью - от 0,226 до 2,461 нг N2/107 кл ч. Активность денитрификаторов достигала 2,89 нг N-N2О /107 кл ч. Внеклеточная протеолитическая активность аммонификаторов составляла 1,54 - 3,76 ед./мг.

5. Выделены и описаны алкалотермофильные бактерии цикла азота: денитрифицирующий штамм DАТ (1,34 нг N-N2О/107 кл ч) близкородственный к B. liсheniformis, обладающий также и нитрогеназной активностью 0,226 нг N2/107 кл ч; аммонифицирующий штамм П1 представитель рода Anoxybacillus - активный продуцент внеклеточных сериновых протеаз трипсиноподобного типа с оптимумом активности фермента при 650С и рН 10,5; нитритокисляющий штамм Nitrospira sp., с максимальной скоростью окисления нитритов при 48 оС и рН 8,7.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

Шагжина А.П. Внеклеточная протеазная активность в щелочных гидротермах Баргузинской долины/ А.П. Шагжина, Е.В. Лаврентьева, Б.Б. Базаржапов// Биология - наука XXI века: 8-я Пущинская школа - конференция молодых ученых. - Пущино. 2004. - С. 164.

Шагжина А.П. Протеазная активность в источнике Гарга (Бурятия)/ А.П. Шагжина, Е.В. Лаврентьева, Б.Б. Базаржапов// Международная научно-практическая конференция в НГУ: сборник тезисов - Новосибирск, 2004. - С. 84.

Шагжина А.П. Протеазная активность в минеральном источнике Кучигер (Северо-Восточное Прибайкалье)/ Е.В. Лаврентьева, А.П. Шагжина// Экология Южной Сибири: Южносибирская научная конференция студентов и молодых ученых. - Абакан, 2004. - С. 135-136.

Шагжина А.П. Протеазная активность в щелочных гидротермах Прибайкалья/ А.П. Шагжина, Е.В. Лаврентьева, Б.Б. Базаржапов// Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование: материалы Межрегиональной научно-практической конференции. - Иркутск, 2004. - С. 185-187.

Шагжина А.П. Ферментативная активность микроскопических грибов в щелочных гидротермах Северного Прибайкалья/ Е.В. Лаврентьева, Б.Б. Базаржапов, А.П. Шагжина, Б.Б. Намсараев// Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование: материалы Межрегиональной научно-практической конференции. - Иркутск, 2004. - С. 154-156.

Шагжина А.П. Внеклеточная протеазная активность в щелочных гидротермах Баргузинской долины/ А.П. Шагжина, Е.И. Лаврентьева, Б.Б. Базаржапов, Б.Б. Намсараев// Вестник БГУ. Серия 1. Биология. Вып. 8. - Улан-Удэ, 2005. - С. 42-50.

Шагжина А.П. Разнообразие микроорганизмов круговорота азота в гидротермах Монголии и Забайкалья/ А.П. Шагжина, Т.Г. Банзаракцаева // Ecosystems of Mongolia and frontier areas of adjacent countries: natural resources, biodiversity and ecological prospect: International conference. - Ulaanbaatar, 2005. - Р. 124-126.

Шагжина А.П. Разнообразие азотфиксаторов термального источника Горячинск (Бурятия)/ А.П. Шагжина, Д.Д. Балданова// Актуальные аспекты современной микробиологии: Молодежная школа-конференция ИНМИ. - М., 2005. - С. 66.

Шагжина А.П. Биохимическая активность источника Уро/ А.П. Шагжина, Е.И. Лаврентьева// Научный и инновационный потенциал Байкальского региона: V межрегиональная научная конференция молодых ученых. - Улан-Удэ, 2005. - С. 64.

Шагжина А.П. Протеазная активность микроскопических грибов в щелочных гидротермах Северного Прибайкалья/ Е.В. Лаврентьева, А.П. Шагжина, Б.Б. Намсараев// Вестник БГУ. Серия 1. Биология. Вып. 9. - Улан-Удэ, 2006. - С. 97-103.

Шагжина А.П. Микробиологические исследования бактерий участвующих в круговороте азота/ Д.М. Прохоров, А.П. Шагжина// Экология Южной Сибири: Южносибирская научная конференция студентов и молодых ученых. - Абакан, 2005 - С. 142-143.

Шагжина А.П. Процессы азотфиксации и денитрификации в щелочном термальном источнике Горячинск/ Т.Г. Банзаракцаева, А.П. Шагжина, А.Л. Степанов, Д.Д. Бархутова// Вестник БГУ. Серия 2. Биология. Вып. 9. - Улан-Удэ, 2006. - С. 57-62.

Шагжина А.П. Процессы азотфиксации и денитрификации в щелочном источнике Горячинск/ Т.Г. Банзаракцаева, А.П. Шагжина, А.Л. Степанов// Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии: тезисы Всероссийской конференции с международным участием. Т.1. - Улан-Удэ, 2006. - С. 25.

Размещено на Allbest.ru