Размещено на http://www.allbest.ru/

Эколого-генетическая и эпидемиологическая оценка горных территорий Центрального Кавказа, загрязненных тяжелыми металлами (на примере Кабардино-Балкарской Республики)

Специальность 03.00.16 - Экология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

РЕУТОВА Нина Васильевна

Нальчик. 2008

Работа выполнена в ГУ «Высокогорный геофизический институт» Росгидромет и в ГУЗ «Республиканский центр планирования семьи и репродукции » МЗ КБР.

Научный консультант: Доктор медицинских наук, профессор Г. Д. Засухина

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Д. Н. Кавтарадзе

Доктор биологических наук, профессор Ю. П. Козлов

Доктор биологических наук М. Д. Померанцева

Ведущая организация: Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Защита состоится « 23 » мая 2008 г. в 14 часов на заседании Диссертационного Совета Д. 501.001.55 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук по адресу: 119992, ГСП - 2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, д. 1, корпус 12 (биофак)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « » 2008 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета

Кандидат биологических наук Н.В. Карташева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение влияния возрастающего загрязнения окружающей среды на живые организмы является одной из важнейших проблем современности. Прогресс человечества неразрывно связан с развитием промышленности, а развитие промышленности неизбежно ведет к загрязнению атмосферы, гидросферы, литосферы (почвы) и биосферы. Загрязнение воды, воздуха, почвы негативно сказывается на живых организмах, в том числе и на человеке.

В настоящее время разработан ряд эффективных методов оценки качества окружающей среды, к которым относятся: классический - это отбор проб воздуха, воды, почв и их лабораторный анализ с использованием физико-химических методов. Однако такой подход не дает возможности определить меру опасности выявленного загрязнения для живых организмов (в том числе и человека) и их сообществ. Другой подход - это определение генотоксического эффекта загрязнений с использованием набора тест-систем, что позволяет выявить наличие мутагенного, канцерогенного, тератогенного и других неблагоприятных влияний загрязнителей. С использованием этого подхода было протестировано огромное количество вновь синтезированных веществ, а также компонентов окружающей среды (почв, атмосферного воздуха, поверхностных вод и седиментов), содержащих набор самых разнообразных поллютантов. Однако и этот подход не дает достаточной информации о том, каким образом выявленный с помощью тест-систем генотоксический эффект может влиять на растения, животных и их сообщества, а также на здоровье населения. В настоящее время получает развитие еще один подход к оценке качества окружающей среды. Это определение генотоксического влияния загрязнения непосредственно in situ на растения и животных, обитающих на данной территории. В данном случае будет учтен вклад всего комплекса опасных веществ, включая их возможный синергизм и антагонизм.

Вместе с тем при таком подходе нерешенной проблемой остается оценка влияния загрязнения окружающей среды на здоровье населения. Достаточно трудно определить, как выявленное с помощью тест-систем и видов местной флоры и фауны генотоксическое влияние отражается на сообществах местной биоты и здоровье населения.

Загрязненная среда обитания оказывает токсическое влияние на живые организмы. Если токсическое влияние, как правило, легко определимо, то влияние на генетические структуры организма выявить весьма сложно, а его последствия в ряде случаев могут носить отдаленный характер.

Мутагенные загрязнения, привносимые в среду обитания человека, приводят к тяжелым генетическим последствиям - росту числа спонтанных абортов, врожденных уродств, наследственных болезней, что пагубно отражается на генофонде населения в целом. Не меньшую опасность представляют мутагены и как факторы, инициирующие развитие злокачественных опухолей. Известно, что большинство мутагенов являются канцерогенами. Загрязнение окружающей среды мутагенами - один из факторов, вызывающих преждевременное старение и сокращение продолжительности жизни.

Для выяснения причин роста числа тех или иных заболеваний и принятия мер для их устранения крайне важно своевременное проведение токсико-генетических исследований состояния окружающей среды.

Учитывая вышеизложенное, было проведено настоящее исследование, основой которого являлось: изучение возможности использования растительных тест-систем для определения мутагенного потенциала тяжелых металлов; подбор оптимальных тест-систем и изучение возможности их применения для выявления генотоксичности отходов предприятий цветной металлургии; определение уровня и спектра загрязнения исследуемых территорий химическими компонентами; определение генотоксического влияния разных типов загрязнения с использованием тест-систем и видов дикорастущей флоры и оценка показателей здоровья и структуры заболеваемости взрослого населения на исследуемых территориях в динамике. Для экологической оценки загрязненных территорий нами использован генетико-эпидемиологический подход, позволяющий экстраполировать в некоторой степени данные с тест-систем растительного происхождения на другие высшие организмы, в том числе и на человека.

Цель работы: разработка оптимальных методик оценки генотоксического эффекта загрязнения окружающей среды горных территорий Центрального Кавказа загрязненных тяжелыми металлами, анализ состояния здоровья населения, проживающего на загрязненной территории, и исследование возможности использования выявленных генетических изменений у растений в качестве одного из критериев прогноза возможной угрозы здоровью населения.

Задачи исследования:

Оценка мутагенной активности тяжелых металлов и определение их токсических и мутагенных концентраций с использованием трех растительных тест систем - хромосомные аберрации в клетках корневой меристемы C. capillaris L., мутации в волосках тычиночных нитей традесканции клона 02 (Трад-ВТН) и соматические мутации в листьях сои (Glycine max (L.) Merill) линии Т219.

Оценка возможности использования растительных тест-систем для определения генетических эффектов отходов вольфрамо-молибденового производства.

Изучение уровня загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами в районе расположения горно-обогатительного комбината и в чистых районах, соответствующих ему по геоклиматическим характеристикам.

Разработка методики оценки генотоксического потенциала почв, загрязненных различными типами химических соединений, с использованием растительной тест системы сои (Glycine max (L.) Merill) линии Т219 и определение ее чувствительности и пригодности для этих целей.

Оценка возможности использования видов дикорастущей флоры для целей генетического мониторинга загрязнения окружающей среды и выбор видов, обладающих выраженной чувствительностью к различным типам загрязнений.

Исследование влияния частоты мутаций на фенотипические признаки растений в районах с разными типами загрязнений.

Анализ возможности использования различных тест-систем и определение оптимального их набора для целей генетического мониторинга загрязнения окружающей среды и прогноза угрозы здоровью населения

Анализ состояния здоровья взрослого населения, частоты онкозаболеваний, спонтанных абортов, рождения детей с врожденными пороками развития (ВПР) и частоты наследственных заболеваний у населения, проживающего в районе расположения горно-обогатительного комбината и сравнение его с аналогичными показателями в контрольных районах.

Оценка прогностической ценности предлагаемых методов и методик проведения эколого-генетического мониторинга загрязнения окружающей среды для определения возможной угрозы здоровью населения, проживающего на загрязненных территориях.

Научная новизна.

На основе проведения сравнительной оценки мутагенного потенциала восьми тяжелых металлов (Ag, Hg, Cu, Pb, Cd, Cr, Mo, W) с использованием трех растительных тест систем - C. capillaris L.,Трад-ВТН клона 02 и сои (Glycine max (L.) Merill) линии Т219 составлены ряды токсичности и мутагенности для этих металлов, показано наличие корреляции между их токсичностью и мутагенностью. Выявлены корреляционные связи между результатами, полученными на всех трех тест системах. Доказана пригодность вышеуказанных растительных тест систем для определения генотоксичности тяжелых металлов.

Впервые проведена оценка генотоксичности отходов предприятий цветной металлургии с использованием набора из трех растительных тест систем C. capillaris L.,Трад-ВТН клона 02 и сои (Glycine max (L.) Merill) линии Т219. В результате сравнительного анализа определены наиболее чувствительные к данному типу загрязнений и удобные в работе тест-системы. мутагенный активность загрязнение металл

Для целей генетического мониторинга загрязнения окружающей среды использованы растения дикорастущей флоры - 5 видов растений в случае загрязнения тяжелыми металлами: одуванчик лекарственный (Taraxacum officinale Wigg.s.l); костер кровельный (Anisantha tectorum); тонконог гребенчатый (Koeleria cristata); белена черная (Hyoscyanus niger) и юринея предкавказская (Yurinea ciscaucasica) и 4 вида растений в случае загрязнения нефтепродуктами: одуванчик лекарственный (Taraxacum officinale Wigg.s.l), ромашка непахучая (Matricaria recutita L.), конский щавель (Rumex confertus Willd.) и подорожник большой (Plantago major L). С учетом чувствительности и экономичности предложен наиболее подходящий вид растений дикорастущей флоры - одуванчик лекарственный (Taraxacum officinale Wigg.s.l) - широко распространенный и пригодный для использования в разных регионах для целей генетического мониторинга разных типов загрязнения окружающей среды.

Впервые проведен сравнительный анализ содержания тяжелых металлов и уровня хромосомных аберраций у разных видов растений дикорастущей флоры, произрастающих на отвалах горно-обогатительного комбината.

Впервые проведен сравнительный анализ частоты мутаций, определенных цитогенетическим методом у исследуемых растений с рядом фенотипических признаков и структурой растительных сообществ в изучаемых регионах.

Разработана методика оценки генотоксического потенциала объектов окружающей среды с использованием растительной тест-системы сои (Glycine max (L.) Merill) линии Т219 и видов дикорастущей флоры, пригодная для разных типов загрязнений, экономичная и простая в использовании.

На основе анализа частоты и структуры заболеваемости взрослого населения в загрязненных районах по сравнению с таковыми показателями в контрольных регионах выявлена наибольшая частота встречаемости патологии костно-мышечной системы и соединительной ткани.

В случае загрязнения окружающей среды рядом исследованных тяжелых металлов не выявлено различий между исследуемым и контрольным регионами по показателям онкологических заболеваний, хромосомных и аутосомно-доминантных моногенных заболеваний и рождения детей с врожденными пороками развития.

Получены доказательства мутагенной природы загрязнителей среды в районе расположения горно-обогатительного комбината и выявлено повышение частоты некоторых патологий человека (частота спонтанных абортов).

Показана необходимость использования растительных тест-систем и растений дикорастущей флоры для оценки качества окружающей среды.

Научно-практическая значимость.

На основе изучения ряда растительных тест-систем определены оптимальные методы для выявления генотоксического потенциала тяжелых металлов и комплексного загрязнения окружающей среды отходами предприятий цветной металлургии и показана высокая чувствительность C. capillaris L.,Трад-ВТН клона 02 и сои (Glycine max (L.) Merill) линии Т219.

Разработанная методика использования растительной тест системы сои (Glycine max (L.) Мerill) линии Т219 чувствительной к разным типам поллютантов, значительно упрощает и удешевляет проведение генетического мониторинга, оценку генетической опасности промышленных предприятий разного профиля и определение генотоксического потенциала почв в загрязненных районах.

Предложенный способ использования видов дикорастущей флоры для оценки состояния окружающей среды с точки зрения ее генетической безопасности дает возможность проводить исследования in situ, не требует сложного лабораторного оборудования и высоко квалифицированного персонала. Предлагаемый для этих целей вид - одуванчик лекарственный (Taraxacum officinale Wigg.s.l), обладающий высокой чувствительностью к разным типам загрязнений и произрастающий практически на всей территории России, дает возможность проводить исследования по генотоксическому влиянию загрязнителей окружающей среды в разных регионах с различными типами загрязнения.

Выявленное повышение частоты спонтанных абортов у женщин, проживающих на территории, загрязненной тяжелыми металлами по сравнению с показателями контрольных районов, показывает, что обнаружение генотоксических изменений у растений, как тестовых объектов, могут иметь определенную прогностическую ценность для оценки возможной угрозы здоровью населения.

Предложенная методика проведения генетического мониторинга загрязнения окружающей среды является оптимальной для данных целей, т.к. позволяет проводить исследования in situ, не требует особых материальных затрат и наличия сложной материально-технической базы.

Положения, выносимые на защиту.

Выявленная в данном исследовании высокая чувствительность трех растительных тест систем - C. capillaris L.,Трад-ВТН клона 02 и сои (Glycine max (L.) Merill) линии Т219 - дает возможность использовать их для обнаружения генотоксического потенциала тяжелых металлов и исследования мутагенного влияния как жидких, так и твердых отходов предприятий цветной металлургии.

Использованная растительная тест система соя (Glycine max (L.) Merill) линии Т219 является наиболее удобным и достаточно чувствительным объектом не только для тестирования мутагенов в лабораторных условиях, но и для генетического мониторинга почв и сточных вод.

Предлагаемый метод использования видов дикорастущей флоры для целей генетического мониторинга дает возможность проводить оценку генотоксичности окружающей среды in situ и является очень чувствительным, легко доступным и экономически выгодным.

В случае загрязнения окружающей среды продуктами переработки нефти и рядом тяжелых металлов обнаружена прямая корреляция между частотой мутаций и высотой растений и обратная корреляция между уровнем загрязнения, частотой мутаций и показателями плодовитости растений.

В районе расположения горно-обогатительного комбината не выявлено повышения общего уровня заболеваемости. Однако обнаружено достоверное превышение заболеваемости костно-мышечной системы и соединительной ткани у населения изучаемого района по сравнению с аналогичными показателями одного из контрольных районов.

У населения района, в котором расположен горно-обогатительный комбинат, не отмечено повышения частоты онкологических заболеваний, частоты рождения детей с врожденными пороками развития и увеличения частоты регистрируемых наследственных заболеваний. Однако, в районе расположения горно-обогатительного комбината, повышена частота спонтанных абортов.

Применение растительных тест систем и видов дикорастущей флоры для генетического мониторинга загрязнения окружающей имеет прогностическую ценность для определения возможной угрозы здоровью населения.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены на общих геофизических семинарах Высокогорного геофизического института Госкомгидромета СССР (Нальчик 1988, 1993-1999, 2007 гг.); выездной сессии отделения АН СССР (Нальчик 3-6 мая 1990 г.); Всесоюзном координационном совещании «Генетические последствия загрязнения окружающей среды мутагенными факторами» (Самарканд, 1990); ежегодной конференции по химическому мутагенезу в Институте химической физики (Москва, 1991), Всероссийских чтениях им. Вернадского (Москва, 2000,2001); Региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных регионов России и сопредельных территорий» (Краснодар 2004); Международной конференции «Устойчивое развитие горных территорий: проблемы и перспективы интеграции науки и образования» (Владикавказ. 2004); 5-м Всероссийском съезде медицинских генетиков (Уфа, 2005); международной конференции «Climate and Environment» (Amsterdam, 2006).

Структура и объем работы. Работа изложена на 223 машинописных страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания места исследования, материалов и методов исследования, шести глав, посвященных результатам исследования с обсуждением и заключением в конце каждой главы, общего заключения, выводов и списка литературы, который включает 323 источника, из которых 222 зарубежных. Работа иллюстрирована 43 таблицами, 15 рисунками, 6 микрофотографиями и 2 картами исследуемого района.

Глава II. Материалы и методы.

Определение мутагенного потенциала тяжелых металлов и жидких стоков промышленных предприятий проводили с использованием трех растительных тест-систем: скерды зеленой (С. сapillaris L.), традесканции клона 02 и сои (Glycine max. L. (Merill.) линии Т219. В первом случае использовали метафазный метод. Для этого воздушно-сухие семена С. сapillaris замачивали на 42 часа в исследуемых растворах, при 27^оС. После обработки семена тщательно промывали в водопроводной воде. Затем обрабатывали 0,05% раствором колхицина в течение 3 часов. Фиксацию производили в спирт-уксусной (3:1) смеси. Окрашивали ацетокармином и из темно-окрашенных кончиков корней готовили временные давленые препараты по общепринятой методике (Л.Г. Дубинина 1978).

При работе с традесканцией клона 02 был использован метод определения соматических мутаций в клетках волосков тычиночных нитей (Трад-ВТН). Проводили обработку свежесрезанных черенков с молодыми соцветиями, в которых бутоны уже развились, но цветение еще не началось или расцвели 1-2 цветка. Для каждого варианта брали по 25-30 черенков и ежедневно просматривали 18-24 тычинки. Обработку проводили методом погружения соцветий в исследуемый раствор на 24 часа и производили учет только розовых мутационных событий с 6-го по 17-й день.

При работе с соей (Glycine max. L. (Merill.) 12-15 г воздушно-сухих семян замачивали сначала на 20 часов в водопроводной воде, чтобы гарантированно начался синтез ДНК, а затем еще на 24 часа в растворах изучаемых реагентов при комнатной температуре. Далее семена промывали и проращивали в течение 3-4 недель до появления двух первых простых и одного сложного листа. При подсчете тройчато-сложный лист приравнивается к трем простым. Поэтому на каждое растение анализируется по 5 листьев кроме желтых проростков, у которых успевают развиться только первые 2 простых листа. Поскольку более 80% пятен находятся на верхней стороне листьев, мы просматривали только верхнюю поверхность листьев. Данные приводили в виде числа пятен на лист и анализировали как общее их количество, так и частоту каждого отдельного типа пятен по каждому типу листа, чтобы можно было сделать заключение о специфичности действия мутагена.

При исследовании мутагенного потенциала тяжелых металлов в качестве контроля использовали дистиллированную воду. При изучении мутагенности жидких стоков промышленных предприятий контролем была водопроводная вода.

В случае определения генотоксического влияния почв с использованием сои (Glycine max. L. (Merill.) применяли метод прямого контакта с почвой. Для этого исследуемые почвы привозили в ящиках и высаживали в них смена, далее проводили анализ пятен, появляющихся на листьях проростков.

При работе с видами дикорастущей флоры использовали анафазно-телофазный метод. Для этого собирали семена с растений в загрязненной и чистой зонах, соответствующих друг другу по геоклиматическим характеристикам. Семена проращивали в чашках Петри на фильтровальной бумаге, смоченной водопроводной водой, при температуре 25-26⁰С в термостате. Проросшие корешки длиной 3-5 мм фиксировали в смеси этилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1). Длительность фиксации не менее 2-3 ч. Материал окрашивали ацетокармином (2%-ный раствор кармина в 45% уксусной кислоте) при кипячении на водяной бане в течение 10-12 мин. Готовили временные давленые препараты из кончиков корней по общепринятой методике.

Определение содержания тяжелых металлов в природных объектах в Кабардино-Балкарской республике проводили методом АэмС (атомной эмиссионной спектроскопии) совместно с Высокогорным геофизическим институтом.

Математическую обработку результатов проводили с использованием компьютерной программы БИОСТАТ, программного обеспечения Microsoft Excel. Для определения достоверности выявленных различий использовали преобразование Фишера для сравнения долей (Лакин Г.Ф. 1990; Урбах В.Ю. 1963), однофакторный и двухфакторный дисперсионный анализ, критерий хи-квадрат и критерий Стьюдента (Рокицкий П.В. 1964).

Глава III. Описание района исследования.

Кабардино-Балкарская Республика расположена на северных склонах центральной части Большого Кавказа в бассейне левых притоков реки Терек. Общая площадь составляет 12,5 тыс. км², из которых 5,5 тыс. км² занято горными хребтами, расположенными параллельно друг другу в направлении с северо-запада на юго-восток.

Центральный Кавказ, включающий территорию Кабардино-Балкарии, в целом характеризуется континентальным умеренно теплым климатом с холодной зимой и жарким летом. По мере увеличения высоты над уровнем моря засушливый климат равнины переходит в бореальные климаты лесов и горных лугов. С увеличением высоты возрастает и количество осадков. Высокогорная часть изучаемых районов относится к избыточно влажному климату с умеренно теплым летом и умеренно мягкой зимой, среднегорная - к влажному климату с теплым летом и умеренно мягкой зимой.

В горно-степном поясе в пределах высот от 800 до 1200 м над у.м. в основном на продуктах выветривания карбонатных пород сформировались горные черноземы. Горный лесной пояс представлен в нижней части (высоты от 300-400 до 1000-1100 метров над у.м.) горными серыми лесными, в верхней (от 500-700 до 1200-1700 м) - горными бурыми лесными почвами. В высокогорье (интервал высот 1100-2000 м) представлены горно-луговые почвы (В.В. Разумов и др. 2003).

В данном исследовании проведена эколого-эпидемиологическая оценка территорий трех горных районов Кабардино-Балкарской Республики - Эльбрусского, Чегемского и Черекского. В Эльбрусском районе расположен Тырныаузский горно-обогатительный комбинат (ТГОК). Чегемский и Черекский районы взяты для сравнения в качестве чистой зоны. Районы сходны между собой по геоклиматическим характеристикам и этническому составу населения.

Тырныаузский горно-обогатительный комбинат введен в эксплуатацию в 1940 г. Комбинат к 90-м годам достиг производительности по добыче руды в 8 млн т. в год. В связи с изменением экономических условий в стране потребность в продукции комбината резко снизилась. Свертывание объемов производства горных работ и обогащения на ТГОК безусловно должно было отразиться положительно на техногенной нагрузке на окружающую среду. Однако, отсутствие средств на реконструкцию производства и падение технологической дисциплины, особенно в обогатительном производстве, привели к резкому ухудшению экологической обстановки в долине р. Баксан.

Первое (наиболее старое) хвостохранилище, расположенное в г. Тырныаузе ниже промплощадки комбината, и второе на 8-м километре автодороги в сторону пос. Былым, в настоящее время не эксплуатируются. Оба они имеют необходимую обваловку и до последнего времени не представляли опасности, если не считать пыления с поверхности второго накопителя в период сильных ветров. Однако в июле 2000 года, в связи с затоплением верхней части г. Тырныауза в результате селевой катастрофы, в старое хвостохранилище попали воды р. Баксан, которые вынесли из него накопленные в 50-60-е годы ХХ-го века отходы переработки руды, содержащие соли тяжелых металлов. Третье - самое крупное - хвостохранилище, расположенное ниже по долине реки в 12 км от г. Тырныауза, в месте впадения в реку Баксан реки Гижгит, было введено в эксплуатацию в 1967 г.

Карта Кабардино-Балкарской Республики. Районы исследования. (Атлас Кабардино-Балкарии)

В отвалах ТГОК накопилось 252771 тыс. т отходов, в действующем хвостохранилище обогатительной фабрики комбината площадью 170 га сосредоточено свыше 125 млн т отходов второго класса опасности, содержащих мышьяк, вольфрам, молибден и другие металлы (Государственный доклад о состоянии окружающей природной среды в Кабардино-Балкарской республике в 1998г.; 1999 г.; 2000 г.; 2001 г.).

Система нейтрализации сточных вод, применяемая в технологическом процессе, позволяет существенно снизить содержание металлов в жидкой фазе пульпы, сбрасываемой в накопитель отходов. Однако состав пульпы способствует переходу вольфрама и молибдена в растворимые соединения, и они из хвостохранилища за счет процессов фильтрации и инфильтрации попадают в реку Баксан. В результате содержание этих металлов речной в воде значительно возрастает, и превышение предельно допустимых концентраций, несмотря на разбавление, наблюдается вплоть до нижнего течения реки (Атлас природно-техногенных опасностей Кабардино-Балкарской республики).

Содержание вольфрама ниже сбросов ТГОК колебалось от 5 до 51,5 ПДК, молибдена до 8 ПДК. Несмотря на то, что комбинат не работает с октября 2001 года, изменения качества сточных вод в лучшую сторону не наблюдается. Концентрации вольфрама и молибдена на данном участке реки Баксан увеличиваются, класс качества воды не изменился - остался шестой (очень грязная) (Государственный доклад о состоянии окружающей природной среды в Кабардино-Балкарской республике в 2003 г.).

Особую опасность представляет токсичная пыль с пляжной части действующего хвостохранилища и вскрытой части законсервированного хвостохранилища, используемого в настоящее время под карьер инертных материалов. Общая площадь поверхности, подвергаемая ветровым процессам порождающим огромные тучи токсичной пыли, в общей сложности составляет порядка 25000 м². Пыль оседает на территории г. Тырныауза, пос. Былым, в пойме р. Баксан с ее притоками и на склонах, используемых под естественные пастбища. Отмечено значительное увеличение концентрации молибдена в молоке, шерсти и экскрементах животных, что может только подтверждать факт передачи молибдена по трофической цепи. Серьезной проблемой является приуроченность ареалов сильного загрязнения к наиболее интенсивно используемым пастбищным угодьям, примыкающим к населенным пунктам (Справка в Кабинет Министров КБР по оценке влияния производственной деятельности Тырныаузского вольфрамо-молибденового комбината на окружающую природную среду).

Глава IV. Растительные тест-системы как чувствительный объект для обнаружения мутагенного потенциала тяжелых металлов

Работ по оценке генотоксического влияния органических веществ на растительные тест системы значительно больше по сравнению с исследованием влияния тяжелых металлов (ТМ). Поэтому наши исследования были начаты с определения пригодности растительных тест систем для выявления мутагенного потенциала именно тяжелых металлов. Нами были использованы три растительные тест-системы. Это хромосомные аберрации (ХА) у скерды зеленой (C. capillaris L.), мутации по окраске в системе волосков тычиночных нитей традесканции (Трад-ВТН) и индукция соматических мутаций на листьях сои (Glycine max. (L.) Merill) линии Т219. Были протестированы неорганические соединения восьми металлов с использованием этих тест-систем. Это - Ag, Cu, Cd, Cr, Hg, Mo, Pb, W. Часть из них высоко токсичны (Ag, Cu, Cr, Hg), некоторые являются известными канцерогенами (Cd, Cr и Pb), есть и необходимые для живых организмов в качестве микроэлементов (Cu, Mo), а Ag и W с точки зрения их мутагенных свойств были очень мало изучены.

C. capillaris. Уровень спонтанных мутаций колебался от 0,05 до 0,34%, т.е. был достаточно вариабельным. Это связано со сроками хранения используемых семян. Во всех случаях были использованы семена текущего года, т.е. срок хранения не превышал 1 года. Но и в течение одного года спонтанный уровень мутаций у семян C. capillaris увеличивается (Дубинина Л.Г.). В наших опытах по изучению мутагенного потенциала ТМ двукратное превышение относительно контроля было статистически не значимым. Размах статистически значимых отклонений колебался от 3,3 раза до 22,5 раза (табл. 1).

C. capillaris оказалась высоко чувствительной системой к тяжелым металлам, мутагенные концентрации были весьма низкими от 10^-4М до 10^-8М и только для вольфрама они составили 10^-2М.

Таблица 1

Влияние тяжелых металлов на C. capillaris L

Вариант	Концентрация (М)	Всего метафаз	В т.ч. с хромосомными мутациями	%	Р
Kонтроль		3866	3	0,08
AgNO3	10-6	2617	47	1,80	?0,001
Kонтроль		1205	3	0,25
Hg(NO3)2?H2O	10-5	692	0	0	?0,05
HgI2	3*10-6	904	12	1,38	?0,01
Контроль	_	1192	3	0,25	_
K2Cr2O7	10-8	1287	21	1,63	? 0,001
Контроль		1531	1	0,07
Cd(NO3)2*2H2O	10-5	1087	14	1,29	?0,001
Контроль		1476	1	0,07
PbI2	10-4	1841	11	0,60	<0,01
Контроль	_	1241	2	0,16	_
Na2MoO4.2H2O	10-5	1205	9	0,75	? 0,05
Контроль	_	1176	4	0,34	_
Na2WO4.2H2O	10-2	986	11	1,12	? 0,05
Контроль		1490	4	0,27
CuSO4	10-4	1380	2	0,14	?0,05
CuI	10-5	1296	7	0,54	?0,05
Контроль		2113	1	0,05
ДЭС	10-4	1619	1	0,06	?0,05

Поскольку в литературе имеются данные о том, что более токсичные металлы обладают большим мутагенным потенциалом (Sharma A, Talukder G. 1987), мы провели сравнительный анализ результатов по токсичности и мутагенности изученных металлов, полученных для C. capillaris, и коэффициент корреляции составил r=0,61. Также мы провели сравнительный анализ между низшими мутагенными концентрациями и атомным весом исследованных металлов. Коэффициент корреляции составил r=0,35.

Трад-ВТН оказалась менее чувствительной к изучаемым тяжелым металлам. Действующие мутагенные концентрации были на порядок выше, чем для C. capillaris, причем у соединений ртути, кадмия и вольфрама не было обнаружено мутагенного влияния (табл. 2).

Меньшая чувствительность Трад-ВТН может быть связана с меньшей длительностью обработки (24 часа у Трад-ВТН и 42 часа у C. capillaris). Но, с другой стороны, у C. capillaris обрабатываются семена, покрытые плотной кожурой, а у Традесканции - соцветия.

Таблица 2

Влияние тяжелых металлов на традесканцию (клона 02)

Вариант	Концентрация (М)	Просмотрено ВТН	В т.ч. с мутациями	%	Р
Kонтроль	-	36340	48	0,13
AgNO3	3?10-5	13490	50	0,37	?0,001
Контроль	_	20931	2	0,009
K2Cr2O7	10-5	21034	8	0,038	? 0,05
Контроль	-	24038	9	0,037
Hg(NO3)2?H2O	10-5	18508	11	0,059	?0,05
HgI2	10-5	10441	3	0,03	?0,05
Контроль	-	7963	0	0
Cd(NO3)2*2H2O	10-5	5405	0	0
Контроль	-	10801	19	0,18
PbI2	1,5?10-3	10663	37	0,35	? 0,05
Контроль	_	23811	4	0,017	_
Na2MoO4.2H2O	10-2	17964	11	0,061	? 0,05
Контроль	-	21076	3	0,014
Na2WO4.2H2O	10-1	18952	5	0,026	?0,05
Контроль	-	24038	9	0,04
CuI	10-5	19810	4	0,02	?0,05
Контроль	-	49797	62	0,12
ДЭС	10-3	14062	44	0,31	?0,001
Контроль	-	44148	64	0,14
НММ	5?10-3	18133	148	0,82	?0,001

Спонтанный уровень мутаций в контролях системе Трад-ВТН также был весьма вариабельным от 0,009% до 0,18%. На такой недостаток данной тест системы, как изменчивость спонтанного уровня мутаций, указывали и авторы последних обзоров по исследованию генотоксичности почв и воды (P.A. White, L.D. Claxton 2004; Ohe et al. 2004).

Соя линии Т219. В нашем сравнительном исследовании только медь и вольфрам не проявили мутагенных свойств в данном тесте. Спонтанный уровень мутаций также оказался очень вариабельным от 0,154 до 0,966 пятен на лист (табл.3).

Таблица 3

Влияние тяжелых металлов на сою линии Т219 (общие данные)

Вариант	Концентрация(М)	Всхожесть %	Пятен на лист
Контроль	-	33	0,616
AgNO3	5?10-6	35	1,729
Контроль	_	41	0,326
K2Cr2O7	10-6	38	0,883
Контроль	-	27	0,154
Hg(NO3)2?H2O	10-5	28	0,407
Контроль	-	52	0,761
HgI2	10-5	35	1,620
Контроль	-	23,5	0,492
Cd(NO3)2*2H2O	10-4	41,5	1,193
Контроль	-	39	0,826
PbI2	10-3	37	3,375
Контроль	_	30	0,391
Na2MoO4.2H2O	10-2	29	0,857
Контроль	_	36	0,307
Na2WO4.2H2O	10-1	44	0,459
Контроль	-	53	0,966
CuI	10-5	52	1,110
Контроль	-	32	1,948
ДЭС	10-3	49	3,957
НММ	2?10-3	37	20,282

Такие значительные различия также связаны со сроками хранения используемых семян. Кроме того, в данном случае на спонтанный уровень мутаций могут влиять и условия выращивания растений, т.к. растения на семена выращиваются в открытом грунте (как и в случае C. capillaris), а годы отличаются один от другого и температурой, и влажностью, и уровнем солнечной инсоляции.

Для сравнения результатов, полученных на трех тест системах, мы вычислили коэффициенты корреляции - r - отдельно для рядов токсичности и для рядов мутагенности, полученных для каждой тест-системы:

Токсичность

Ряды токсичности:

C.capillaris L.- Hg > Ag > Cr⁶⁺, Pb > Cd, Cu > Mo⁶⁺ > W⁶⁺;

Трад-ВТН - Hg, Ag > Cd > Cr⁶⁺ » Mo⁶⁺ > W⁶⁺, Pb.

Glycine max. (L.) Merill - Ag > Cr⁶⁺ > Hg > Pb > Cd, Cu, Mo⁶⁺, W⁶⁺ (в конце ряда мы поставили металлы, для которых токсические концентрации не были определены).

Коэффициенты корреляции:

C. capillaris L. и Трад-ВТН (клон 02) - r = 0,66;

C. capillaris L. и соя (Glycine max. (L.) Merill.) - r = 0,83;

Трад-ВТН (клон 02) и соя (Glycine max. (L.) Merill.) - r = 0,38.

Мутагенность

Ряды мутагенной активности:

C.capillaris L - Cr⁶⁺ » Ag > Hg > Cd, Mo⁶⁺ > Pb > W⁶⁺ > Cu;

Трад-ВТН - Cr⁶⁺, Ag > Pb > Mo⁶⁺ > Hg, Cd, W⁶⁺.

Glycine max. (L.) Merill Cr⁸⁺ > Ag > Hg > Cd > Pb > Mo⁶⁺ > Cu, W⁶⁺.

Коэффициенты корреляции:

C. capillaris L. и Трад-ВТН (клон 02) -r = 0,72;

C. capillaris L. и соя (Glycine max. (L.) Merill.) - r = 0,94;

Трад-ВТН (клон 02) и соя (Glycine max. (L.) Merill.) - r = 0,77.

Таким образом, данные по мутагенности, полученные на всех трех тест-системах прекрасно совпадают. Наилучшие корреляции у пары C. capillaris L и соя (Glycine max. (L.) Merill.). Для этой пары растительных тест систем имело место практически полное совпадение результатов и по токсичности (r=0,83), и по мутагенности (r=0,94).

Если говорить об удобстве использования и легкости в работе, то наиболее простой тест системой из всех является соя. Что касается чувствительности, то наиболее чувствительной оказалась скерда (C. capillaris L.) для которой токсичные и мутагенные концентрации тяжелых металлов и диэтилсульфата (ДЭС) были примерно на порядок ниже, чем для остальных тест-систем.

Исходя из результатов наших исследований можно с уверенностью сделать заключение, что все три растительные тест системы вполне пригодны для тестирования тяжелых металлов как на токсичность, так и на мутагенность и являются весьма чувствительными к такому типу загрязнителей, поскольку выявленные с их помощью действующие концентрации тяжелых металлов значительно ниже, чем мутагенные концентрации у супермутагенов (ДЭС и НММ).

Глава V.

Использование растительных тест систем для оценки генетического влияния отходов горно-обогатительного комбината.

После проверки пригодности трех растительных тест систем для определения мутагенного потенциала тяжелых металлов, мы использовали их для определения возможных мутагенных свойств отходов Тырныаузского горно-обогатительного комбината (ТГОК). ТГОК занимается разработкой вольфрамо-молибденового месторождения и обогащением добытой руды. Свои отходы комбинат в виде пульпы по пульпопроводу перекачивает в хвостохранилище, расположенное на берегу р. Баксан. В результате высыхания пульпы формируется хемозем, а на верху расположено озеро со свежей пульпой, которое частично сформировано также и водами р. Гижгид. Вода из озера фильтруется через всю толщу отвалов и в виде дренажных вод стекает в р.Баксан. В таблице 4 для сравнения приведены данные по содержанию тяжелых металлов в воде р. Баксан выше по течению от г. Тырныауза, в котором расположен ТГОК. Наиболее сильно повышено содержание молибдена, также повышено содержание меди и вольфрама, но медь в исследуемых тестах не являлась мутагеном, а вольфрам проявил мутагенные свойства только на одной тест-системе, да и то в высоких концентрациях - 10^-2М (табл. 1-3).

Таблица 4

Содержание тяжелых металлов в жидких стоках комбината

Вариант	Содержание тяжелых металлов мкг/л
	Mo	Pb	Cu	Zn
Дренажные воды	15000-17000	2-3	55	7-16
Пульпа	>>25	3	15	0
Речная вода	2-3	2	7	0

При использовании всех трех растительных тест систем для исследования мутагенной активности жидких стоков ТГОК оказалось, что они пригодны для этих целей. Данные, полученные на всех тест системах, хорошо совпадали. Жидкие отходы комбината оказались токсичными и обладали мутагенными свойствами.

Чтобы сравнить чувствительность всех трех растительных тест-систем к генотоксическому действию жидких стоков горно-обогатительного комбината, мы определили возрастание частоты индуцированных сточными водами мутаций относительно контроля для всех использованных тест-систем и для наглядности представили их в виде диаграммы (рис. 1).

Максимальный диапазон возрастания уровня мутаций (в 45 раз) был у традесканции (Трад-ВТН). На рисунке не представлены данные по влиянию пульпы на традесканцию, т.к. она оказалась очень токсичной для данного растения и все черенки погибли. Для сои это возрастание составило 2,3-2,7 раза; для C. capillaris - 5 раз.

Что касается удобства работы, то значительно легче работать с соей. Для работы с C. capillaris нужен более квалифицированный персонал, т.к. в данном случае используется метафазный метод. Что касается сроков, то все три тест-системы требуют примерно одинаковых затрат времени, т.е. проведение исследований занимает 20 - 25 дней.

Таким образом, все три растительные тест-системы, использовавшиеся нами для генетического мониторинга отходов промышленных предприятий цветной металлургии, выявили мутагенное влияние жидких стоков горно-обогатительного комбината.

Глава VI. Оптимальные методы оценки генотоксичности почв.

В мировой практике для исследования генотоксичности почв в основном использовались бактериальные и растительные тест-системы. Чаще всего проводилось тестирование с использованием почвенных вытяжек, хотя предпочтительнее использовать прямой контакт с почвой. Мы для этих целей использовали наиболее удобную на наш взгляд растительную тест-систему сою линии Т219. С использованием этой тест-системы была проведена оценка генотоксичности почв загрязненных тяжелыми металлами (отвалы горно-обогатительного комбината) и продуктами горения и кустарной переработки нефти (почвы из некоторых районов Чеченской республики).

Работы по определению генотоксического потенциала почв, загрязненных нефтепродуктами, были проведены нами с Джамбетовой П.М. (Джамбетова П.М. 2005; Джамбетова П. М., Реутова Н.В. 2006). В данном случае были протестированы почвы шести населенных пунктов с разным уровнем загрязнения. Источниками загрязнения были мини-заводы по переработке нефти и горевшие на протяжении многих лет нефтяные скважины. Содержание углеводородов в загрязненных почвах колебалось от 0,63 до 1,72% (в наиболее загрязненном пункте) по сравнению с 0,03% в условно чистой зоне. Имело место и увеличение содержания нефтепродуктов от 0,52% до 1,56% в загрязненных населенных пунктах (в условно-чистой зоне 0,02%). Самое большое превышение наблюдалось по бенз(а)пирену. В наиболее загрязненном населенном пункте его было в 61 раз больше, чем в чистой зоне (1,83мг/кг и 0,03мг/кг соответственно). В остальных загрязненных населенных пунктах это превышение колебалось от 2-х до 8 раз.

В исследованных почвах было повышено и содержание тяжелых металлов (Pb, Cd, Cr, Co, Mn) по сравнению с условно чистой зоной, но практически нигде ПДК превышено не было. Исключение составил только свинец, содержание которого во всех населенных пунктах несколько превышало ПДК, а в наиболее загрязненном населенном пункте имело место двукратное превышение по содержанию свинца по сравнению с ПДК и с контрольным районом.

Загрязнение почвы нефтепродуктами привело к снижению всхожести семян в 1,2 - 1,4 раза по сравнению с условно чистой зоной. Во всех загрязненных зонах общее количество пятен на лист возрастало в несколько раз, что свидетельствует о наличии мутагенного эффекта. Так, пятикратное увеличение общего числа пятен на листьях проростков загрязненных участков по сравнению с условно чистой зоной наблюдалось в наиболее загрязненном населенном пункте. В остальных населенных пунктах общее число пятен возрастало в 3,7-4,9 раза.

Поскольку каждый тип пятен обусловлен определенным типом мутаций, то анализ их соотношения позволяет судить о специфичности действия исследуемого мутагена. В данном случае не было отмечено увеличения числа какого-либо определенного типа пятен. Частота всех типов пятен на всех типах листьев возрастала примерно одинаково. Следовательно, никакой специфичности в мутагенном влиянии почв, загрязненных нефтепродуктами, не было. В данном случае имело место общее генотоксическое влияние, обусловленное и генными, и хромосомными мутациями.

Следует отметить хорошее совпадение полученных результатов с уровнем загрязнения почв бенз(а)пиреном и нефтепродуктами. Так наибольшее число всех типов соматических мутаций на листьях было характерно для растений, выращенных на почвах из наиболее загрязненного населенного пункта (Джамбетова П.М. 2004).

Эта же тест-система была использована и для тестирования почв, сильно загрязненных тяжелыми металлами (Биттуева М.М.2004). Это был хемозем с отвалов Тырныаузского горно-обогатительного комбината (ТГОК), который формируется после высыхания пульпы. В опытах семена проращивали в хемоземе и в смеси хемозема и чистой почвы.

Хемозем с отвалов горно-обогатительного комбината обладал генотоксическим влиянием и вызывал все типы мутаций - генные, хромосомные и митотический кроссинговер, поскольку наблюдалось увеличение всех типов пятен на всех типах листьев. Причем имел место дозо зависимый эффект - с увеличением количества хемозема увеличивалась и частота индуцированных соматических мутаций на листьях сои линии Т219.

Таким образом, растительная тест-система соя Glycine max. (L.) Merrill линии Т219 оказалась пригодной для тестирования почв, загрязненных как органическими (полициклические ароматические углеводороды и бенз(а)пирен), так и неорганическими (тяжелые металлы) веществами.

Поскольку мы использовали сою для оценки генотоксичности почв, загрязненных разными типами веществ, то было весьма интересным провести сравнительный анализ реакции этой тест-системы на тяжелые металлы и нефтезагрязнения.

На рис. 2 приведена сравнительная характеристика относительного возрастания различных типов пятен на разных типах листьев по сравнению с контролем. Как видно из рисунка, оба типа загрязнений обладали общим генотоксическим действием и вызывали как генные, так и хромосомные мутации. Генотоксическое влияние нефтезагрязнений было более выраженным.

Поскольку бактериальные тест-системы (тест Эймса) считаются стандартными, было проведено сравнительное тестирование тех же самых почв, загрязненных продуктами горения и кустарной переработки нефти с использованием теста Эймса (Джамбетова П.М. 2005; Джамбетова П.М., Реутова Н.В. 2006). Использовалась стандартная версия теста Эймса со штаммами ТА98 и ТА100 с метаболической активацией.

Из исследуемых образцов почв мутагенную активность показал только экстракт почвы из наиболее загрязненного населенного пункта, который индуцировал мутации у обоих штаммов в присутствии системы метаболической активации. В почвах данного населенного пункта содержалось максимальное количество бенз(а)пирена - 1,83 мг/кг. Во всех остальных (в том числе и загрязненных) населенных пунктах содержание этого вещества на порядок ниже. Следовательно, данная тест-система не обладала высокой чувствительностью к исследуемому типу загрязнителей среды.

Мы не использовали тест Эймса в случае загрязнения почв тяжелыми металлами, т.к. бактериальные тесты в основном не пригодны для их тестирования (P.A.White, L.D. Claxton 2004).

В случае загрязнения почв продуктами горения и переработки нефти тест Эймса оказался менее чувствительным по сравнению с соей. По всей видимости, это связано с целым рядом ограничений: вытяжки не обеспечивают полную экстракцию всех поллютантов, находящихся в почве; время экспозиции составляло всего 24 часа; на данной тест-системе нельзя обнаружить всего возможного спектра мутаций - а именно хромосомных, геномных и митотического кроссинговера.

Таким образом, использованная нами тест-система соя Glycine max.(L.) Merill линии Т 219 оказалась значительно более чувствительной по сравнению с тестом Эймса в случае загрязнения продуктами переработки нефти и более удобной в работе, так как мутагенное влияние обнаруживалось и в менее загрязненных населенных пунктах. Поэтому можно полагать, что для исследования генотоксичности почв предпочтительнее использовать растительные тест-системы, в частности сою - Glycine max.(L.) Merill линии Т 219.