18

Размещено на http://www.allbest.ru/

Микробиологическое состояние и ферментативная активность нефтезагрязненных почв

А.У. Чукпарова

Аннотация

В статье приведены результаты по изучению микробиологического состояния и активности почвенных ферментов в почвах трех месторождений Атырауской области в разной степени загрязненных нефтью. В результате проведенных исследований установлено, что в сильнозагрязненной нефтью почве происходит ингибирование активности почвенных ферментов каталазы, инвертазы, целлюлазы, урезы, за исключением дегидрогеназы, и подавляется численность актиномицетов и мицелиальных грибов; более устойчивыми оказались бактериальные культуры микроорганизмов.

Основное содержание исследования

Казахстан на длительную перспективу предусматривает увеличение добычи "черного золота", а это, в свою очередь, ведет к расширению сети трубопроводов, возрастает количество перевозок нефти и нефтепродуктов и, как следствие, невозможность полностью исключить вероятность новых аварий, разливов нефти и нефтепродуктов. Попадая в почву, углеводороды нефти влияют не только на количество органического вещества, но и на его качественный состав. Количество органического углерода в гумусовом горизонте загрязненного участка возрастает в несколько раз [1].

Действие такого антропогенного фактора, как нефть не может быть однозначным, оно определенным образом распространяется на всю изучаемую почвенную экосистему [2]. При нефтяном загрязнении изменяется состав почвенных сообществ и микробиологических популяций, поддерживающих гомеостаз в почве. Все процессы в почве, в том числе микробиологические, взаимосвязаны, взаимообусловлены и тесно скоординированы, обеспечивая равновесие экосистем. Основную долю в микробоценозе почв составляют гетеротрофные бактерии, которые могут составлять 99,7 % от общего числа микроорганизмов. Количество микроскопических грибов - до 5,9 %, актиномицетов - до 28,2 %, углеводородокисляющих бактерий - не более 0,01 %. Жизнедеятельность микроорганизмов является одним из важнейших факторов образования почвы и ее плодородия, а также способности самоочищения от загрязняющих органических веществ [3]. Попадая в почву, углеводороды нефти оказывают токсическое воздействие на ее микрофлору, замедляют развитие или вызывают гибель. По данным некоторых авторов [4, 5], при нефтяном загрязнении спорообразующие бактерии и актино-мицеты испытывают угнетение, значительно снижается численность целлюлозоразрушающих микроорганизмов, нитрификаторов. Загрязнение почв нефтью и продуктами ее переработки приводит к заметному сдвигу в составе биоты и определяется ее концентрацией. Известно [6, 7], что в низких концентрациях нефть оказывает стимулирующее действие на почвенную биоту, так как является энергетическим субстратом для большой группы почвенных микроорганизмов и содержит вещества, стимулирующие их рост и развитие. Например, нефть стимулирует рост некоторых почвенных грибов (Paecilomyces, Fusarium), некоторые виды ^luobasidium обнаружены только в почве, насыщенной нефтепродуктами [7].

С другой стороны, массивное нефтяное загрязнение почвы, возникающее при аварийных разливах, сопровождается острым токсическим действием нефти на живые организмы. Последнее проявляется наиболее ярко сразу же после попадания загрязнителя в почву. Микробная система почв при разного рода антропогенных загрязнениях реагирует сходным образом путем изменения состава активно функционирующих популяций, входящих в сообщество микроорганизмов. Реакция микроорганизмов зависит от количества и качества загрязнителя [8, 9].

Опасность нефти заключается в том, что она включает почти 3000 ингредиентов, большинство из которых легкоокисляемы. В нефти различного происхождения выделяют легкие, средние и тяжелые фракции. Большой процент в нефти составляют углеводороды тяжелых фракций (плотностью от 0,86 до 1,05 г/см³). К ним относят ароматические и полиароматические углеводороды, смолистые вещества. Тяжелые углероды, вследствие низкой растворимости в воде и высокой температуры кипения, накапливаются в почве и ухудшают водный режим почвы и ее физические свойства. Они резко снижают содержание подвижных соединений азота и фосфора и оказывают токсичное воздействие на рост растений. В результате этого усиливаются эрозия почв и их деградация [10].

Острая токсичность высоких доз нефти (50-300 мл/кг почвы) для микробиоты определяется главным образом наличием в ней летучих ароматических углеводородов (толуола, ксилола, бензола), нафталинов и зависит во многом от свойств ее отдельных фракций. Легкие летучие фракции нефти (бензин, керосин) проявляют биологический эффект сразу же после контакта с клетками микроорганизмов. Эти соединения сравнительно быстро и легко улетучиваются из почвы или разрушаются. Поэтому период острого токсического действия нефти на почвенную биоту является относительно коротким [11]. При загрязнении почвы легкими фракциями нефти гидрофобность почвы практически не изменяется.

Эффект тяжелых компонентов нефти проявляется позже, при котором значительно увеличивается гидрофобность почвы. Подавляющая часть внесенной нефти оказалась сосредоточенной в самом верхнем слое почвы. Подобный характер распространения поступившей нефти в почве связан с ее механической задержкой в верхней части профиля в результате большой вязкости нефти и запечатывания пор почвенных агрегатов, что также приводит к потере способности почвы впитывать и удерживать влагу. В процессе загрязнения почвенного покрова нефтью происходят адсорбция его токсических и канцерогенных углеводородов, склеивание структурных отдельностей, нарушается аэрация, снижается скорость транспирации влаги через вышележащий слой загрязненной нефтью почвы, создаются анаэробные условия [10].

Все эти изменения отрицательно сказываются на жизнедеятельности почвенных микроорганизмов, приводя к изменению естественных колебаний численности микроорганизмов. Кроме того, повышение количества органического вещества загрязненного участка также неблагоприятно влияет на микроорганизмы почвы из-за токсичности углеводородов, но после преобразования нефтепродуктов в процессе выветривания может стать важным фактором, способствующим восстановлению плодородия почвы. При исследовании влияния антропогенных загрязнений на плодородие почвы показатели её биологической активности входят в состав мероприятий по охране окружающей среды во многих странах [11]. Начиная с 80-х годов прошлого столетия ведется поиск универсальных коэффициентов определения плодородия почв по ферментативной активности почвы. Было предложено множество тестов [12, 13], наиболее интересными из которых, на наш взгляд, являются тесты, основанные на определении активностей ферментов полифенолоксидазы и пероксидазы, уреазы и инвертазы, дегидрогеназы и кислой и щелочной фосфатазы. В связи с этим целью данного исследования являлось изучение влияния нефтяного загрязнения на численность групп почвенных микроорганизмов и биологическую активность почв месторождений Жанаталап, Терен-Узек и С. Балгимбаев Атырауской области.

Объекты и методы исследования

Объектами исследований являлись почва месторождений С. Балгимбаев, Жанаталап и Терен-Узек Атырауской области, загрязненная в разной степени нефтью, и физиологические группы почвенных микроорганизмов, в том числе и углеводородокисляющие микроорганизмы.

Для определения современного состояния почвы были отобраны образцы. Отбор проб почвы для микробиологического анализа, определения численности почвенных микроорганизмов проводили общепринятыми в микробиологии методами [14].

Содержание нефти определено гравиметрическим методом [15].

Активность почвенных ферментов (каталазы, инвертазы, дегидрогеназы, целлюлазы и уреазы) определяли методами, предложенными в [16].

Математическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета прикладных программ Excel на персональном компьютере "Pentium-IV".

микробиологический почвенный фермент загрязненный нефть

Результаты исследований и их обсуждение

Проведенный гравиметрический анализ содержания нефтепродуктов в почвах месторождений показал, что наибольшее содержание нефти отмечено в почве месторождения Терен-Узек - 34155 мг/кг почвы, наименьшее - в почве месторождения Жанаталап - 5451 мг/кг почвы. Если сравнить содержание нефти в почве месторождений, то к наиболее загрязненным можно отнести почвы месторождения Терен-Узек. По литературным данным [19] содержание нефти в почве до 1500 мг/кг позволяет отнести их к незагрязненным, от 1000 до 5000 мг/кг - к слабозагрязненным, от 5000 до 13000 мг/кг - к средне-, от 13000 мг/кг и выше - к сильно загрязненным нефтью.

При загрязнении почвы нефтью активность инвертазы резко снижается - в 2-5 раз по сравнению с контролем, тогда как активность дегидрогеназы находится в прямой зависимости от дозы нефти. С увеличением нефти в почве увеличивается и показатель активности дегидрогеназы - по сравнению с контролем активность дегидрогеназы увеличивается в 2,7-3,0 раза.

Отмечается снижение активности каталазы с увеличением концентрации нефти в почве в 1,2-1,6 раза по сравнению с контролем. Это подтверждается и данными Киреевой [18], хотя имеются и противоположные мнения [1]. По-видимому, снижение или увеличение активности каталазы зависит от компонентного состава нефти, наличия в ней токсичных компонентов и возможности кислорода поступать в загрязненную почву.

Изучение активности целлюлазы показало, что биодеструкция целлюлозы в загрязненных нефтью почвах резко падает, в зависимости от степени загрязнения. Так, в сильнозагрязненных почвах месторождений наблюдалось снижение активности целлюлазы по сравнению с контролем в 15-27 раз.

Активность уреазы также снижается в нефтезагрязненных почвах. Так, высокое содержание нефти в почве ингибирует ее активность в 4-7 раз по сравнению с незагрязненной почвой.

Нефтяное загрязнение снижает активность целлюлазы [20, 21] и в значительно меньшей степени каталазы и уреазы, что находит подтверждение в литературе [22, 23]. Изменение показателей активности почвенных ферментов, таких как инвертаза, уреаза и целлюлаза, можно использовать в качестве теста при изучении степени загрязнения почв нефтью.

В районах нефтегазовых месторождений даже слабое загрязнение углеводородами приводит к снижению количества микроорганизмов, которые играют основную роль в процессе самоочищения почвы от загрязнения. Поступление нефти и нефтепродуктов в почву вызывает экологическую сукце-сию-репрессию функциональной активности флоры и фауны, приводит в движение все компоненты микробного сообщества, находящегося в состоянии гомеостаза: изменяются структура почвенного микробиоценоза, характер трофических связей, активность биоценоза, направленность и скорость биохимических реакций. Действие нефти на живые организмы почвы в значительной степени определяется ее концентрацией. Известно, что в низких концентрациях нефть оказывает стимулирующее действие на почвенную биоту, так как является энергетическим субстратом для большой группы микроорганизмов и содержит вещества, стимулирующие их рост и развитие [1, 3].

С другой стороны, массивное нефтяное загрязнение почвы, возникающее при аварийных разливах, сопровождается острым токсическим действием нефти на живые организмы, которое проявляется наиболее ярко сразу же после попадания загрязнителя в почву [4].

С целью получения сведений о численности основных групп микроорганизмов для оценки состояния почв в районах нефтедобычи Атырауской области нами были проанализированы отобранные пробы почв с разной степенью загрязнения. Микробиологический анализ загрязненных нефтью почв месторождения С. Балгимбаев Атырауской области показал снижение численности микроорганизмов (табл.2).

Так, общая численность микроорганизмов в образцах сильнозагрязненных почв на 2 порядка, среднезагрязненных почв на 1 порядок ниже значений численности микроорганизмов контрольного образца почвы. Количество клеток микроорганизмов при этом в образцах сильнозагрязненных почв составило 2,04х10⁵ КОЕ/г почвы, в образцах среднезагрязненных почв - 1,92х10⁴ КОЕ/г почвы против 6,53х10⁶ КОЕ/г почвы в контроле.

Результаты микробиологического анализа почв месторождения С. Балгимбаев показали, что в загрязненных нефтью почвах довольно значительную часть комплекса почвенных микроорганизмов составляют спорообразующие бактерии. На долю спорообразующих бактерий в контрольных (незагрязненных) образцах почв приходится 1,3 % от общего числа микроорганизмов. В образцах почв, в различной степени загрязненных нефтью, это значение составляет 11,7 и 4,21 % соответственно. Присутствие спорообразующих бактерий в неблагоприятных условиях обитания связано с их способностью переходить в форму спор, в виде которых они переживают любое стрессовое воздействие и которые позволяют давать вспышку роста при улучшении условий обитания [11].

Как известно, в микробиоценозах ведущая роль в разрушении нефти принадлежит углеводородокисляющим микроорганизмам, основным экологически важным свойством которых является их способность усваивать углеводороды нефти и нефтепродуктов. Углеводородокисляющие микроорганизмы широко распространены в природе в различных биоценозах и играют важную роль в экосистемах. Поэтому при микробиологическом изучении нефтезагрязненной почвы на фоне численности всей микрофлоры особое внимание уделялось этой группе микроорганизмов.

По данным некоторых авторов [24], численность углеводородокисляющих бактерий в загрязненных почвах на несколько порядков превышает значения контрольных почв. Данные, полученные нами, показывают обратное. Численность углеводородокисляющих микроорганизмов в фоновом образце почвы 1, 20х10⁶, что составляет 18,4 % от общего числа микроорганизмов. Численность углево-дородокисляющих бактерий в среднезагрязненных почвах ниже значений контрольных образцов почв на 1 порядок, их доля составляет 7,5 %, а в сильнозагрязненных почвах - на 3 порядка, и на их долю приходится 49,5 % от общего числа микроорганизмов. Это еще раз свидетельствует о том, что почва испытывает неблагоприятные антропогенные воздействия. Общеизвестно, что количество уг-леводородокисляющих микроорганизмов, а также их активность в определенной мере отражают интенсивность процессов окисления нефти. Следовательно, в данном случае низкая численность этой группы микроорганизмов в загрязненных почвах из-за нарушения физико-химических условий среды и высокого содержания нефти - 29675 мг/кг почвы приводит к снижению интенсивности процессов окисления нефти в почве. Кроме того, наиболее важными условиями активной деятельности микрофлоры в присутствии нефтяных загрязнений также являются влажность и температура почвы [25], а в аридных почвах Атырауской области и всего Казахстана лимитирующим деятельность микроорганизмов фактором выступает недостаток влаги в почве.

Велика роль актиномицетов и микромицетов в деструкции нефти. По данным авторов [18, 26], численность микромицетов при нефтяном загрязнении повышается, что указывает на их устойчивость и огромную роль в начальных этапах трансформации нефти [27, 28]. Среди мицелиальных грибов наиболее устойчивыми являются Penicillum и Aspergillus, а среди актиномицетов высокой деструктивной активностью по отношению к нефти и нефтепродуктам обладают стрептомицеты [29]. Однако изучение численности почвенных грибов показало, что в образцах среднезагрязненных нефтью почв обнаружено 1,11х10² КОЕ/г почвы, а актиномицетов - 1,18х10² КОЕ/г почвы, тогда как в образцах сильнозагрязненных нефтью почв обе группы микроорганизмов встречаются единично, что указывает на высокую чувствительность актиномицетов и мицелиальных грибов к нефтяному загрязнению.

Кроме того, следует отметить, что в загрязненных нефтью образцах почв снижено видовое разнообразие микроорганизмов. На питательных средах в чашках Петри вырастают преимущественно однотипные по морфологии колонии микроорганизмов. На месторождении Жанаталап при проведении микробиологического анализа нами отмечена такая же картина, как на месторождении С. Балгимбаев. Результаты анализа представлены в таблице 3.

Как показали результаты исследований, для незагрязненной почвы характерна высокая общая численность микроорганизмов (общий титр КОЕ в почве, 10⁵).

В среднезагрязненных почвах отмечается снижение углеводородокисляющих микроорганизмов на два порядка по сравнению с контролем и на один порядок - численность актиномицетов. Численность спорообразующих и мицелиальных грибов при сравнении с контролем практически не изменяется и составляет 1,55х10⁴ и 0,83х10³ КОЕ/г почвы соответственно.

В сильнозагрязненных почвах на два порядка снижается численность спорообразующих, численность же углеводородокисляющих несколько выше по сравнению с среднезагрязненными почвами, тогда как численность актиномицетов и мицелиальных грибов единична.

При высеве на чашках Петри отмечается преобладание бактерий, образующих мелкие пигментированные колонии.

При исследовании проб почвы с месторождения Терен-Узек нами отмечено снижение на порядок общей микробной численности в среднезагрязненных и на два порядка - в сильнозагрязненных нефтью почвах. Значительную часть в комплексе почвенных микроорганизмов сильнозагрязненных почв составляют спорообразующие бактерии - 6,9 % от общей численности микроорганизмов. Однако с увеличением степени загрязнения почвы нефтью отмечается снижение их численности на один и два порядка по сравнению с контролем (табл.4).

Численность углеводородокисляющих микроорганизмов в среднезагрязненных нефтью почвах составила всего 1-2 клетки, тогда как в сильнозагрязненных нефтью почвах они не были обнаружены. Вероятно, это связано с качественным составом нефти (высокое содержание селикагелевых смол и асфальтенов), нарушением водно-воздушного режима почвы, высокой засоленностью почв и близким залеганием грунтовых вод.

Данные таблицы 4 показывают сильное угнетение почвенной микрофлоры месторождения Те-рен-Узек. Отмечена элиминация таких физиологических групп микроорганизмов, как актиномицеты и мицелиальные грибы.

Различная устойчивость компонентов микробного сообщества почвы к антропогенному прессингу приводит к выпадению наиболее чувствительных звеньев, нарушению естественного равновесия между отдельными группами микрофлоры. В свою очередь это меняет интенсивность отдельных стадий процессов круговорота биогенных элементов и ведет к деградации почв, минерализации гумуса, нарушению экологических функций почвы. По данным Д.Г. Звягинцева и др. [30], такое состояние почвы соответствует высокому уровню загрязнения почв нефтью. Снижение численности, видового разнообразия и активности почвенных микроорганизмов может стать причиной увеличения срока естественного очищения почвы от нефтяного загрязнения и восстановления ее плодородия.

Таким образом, проведенные исследования ex situ показали, что содержание нефти свыше 27 994 мг/кг почвы резко угнетает активность ферментов азотного и углеродного цикла в почве, и это в дальнейшем негативно скажется на её плодородии. Наиболее чувствительными к загрязнению почвы нефтью оказались инвертаза, уреаза и целлюлаза. Также сильно нарушен микробный баланс почвы нефтедобывающего региона Атырауской области, а микробоценоз почвы находится в угнетенном состоянии, снижено видовое разнообразие микроорганизмов. Показатели микробиологической оценки антропогенно нарушенных почв можно применять в индикации загрязнения их поллютантами. Так, повышенной чувствительностью к нефтяному загрязнению обладают актиномицеты и мицели-альные грибы, так как высокие концентрации нефти оказывают на них подавляющее воздействие. Более устойчивыми являются бактериальные культуры микроорганизмов, участвующие в процессах окислительной трансформации нефтяных углеводородов в почве.

Список литературы

1. Исмаилов Н.М. Нефтяное загрязнение и биологическая активность почвы // Добыча полезных ископаемых и геохимия природных экосистем. - М.: Наука, 1992. - С.227-235.

2. Оборин А.А., Калачникова И.Г. и др. Нефтяное загрязнение почв и способы рекультивации // Влияние промышленных предприятий на окружающую среду. - Пущино, 1987. - С.284-287.

3. Ильин Н.П., Калачникова И.Г. и др. Наблюдение за самоочищением почв от нефти в Средней и Южной тайге // Добыча полезных ископаемых и геохимия природных экосистем. - М.: Наука, 1992. - С.245-258.

4. Оборин А.А., Колесникова Н.М. и др. Трансформация нефтяных углеводородов почв, загрязненных нефтью // Влияние промышленных предприятий на окружающую среду. - Пущино, 1987. - С.139-1

5. Колесникова Н.М., Плещева О.В. Микробиоценоз почвы в условиях нефтяного загрязнения // Микробиологические методы защиты окружающей среды (5-7 апреля, 1988, Пущино): Тезисы докл. - Пущино, 1988. - С.144-145.

6. Гузев В.С., Левин С.В. и др. Роль почвенной микробиоты в рекультивации нефтезагрязненных почв // Микроорганизмы и охрана почв. - М.: Наука, 1989. - С.129-150.

7. БабьеваИ.П., Зенова Г.М. Биология почв. - М.: Изд-во МГУ, 1983. - 248 с.

8. Звягинцев Д.Г., Голимбет В.Е. Биомасса микроорганизмов в почве и их активность // Сельскохозяйственная биология. - Пущино, 1983. - № 12. - С.112-116.

9. ЗвягинцевД.Г. Почва и микроорганизмы. - М.: Изд-во МГУ, 1987. - 256 с.

10. Методы контроля качества почвы / Под. ред.А.П. Воронина. - Воронеж, 2007. - 106 с.

11. Устинов М.Т., Казанцев В.А. и др. Мониторинг территорий нефтегазовых промыслов методом почвотестирования // Исследования эколого-географических проблем природопользования для обеспечения территориальной организации и устойчивости развития нефтегазовых регионов России: Теория, методы и практика. - Нижневартовск, 2000. - С. 197-199.

12. АбрамянA. Изменение ферментативной активности почвы под воздействием естественных и антропогенных факторов // Почвоведение. - 1992. - № 7. - С.70-82.

13. Шемелина Т.Н., Новоселова Е.И. и др. Диагностирование степени загрязненности почв нефтью по показателям ферментативной активности // Вестник Оренбургского гос. ун-та. - 2007. - № 75. - Окт. - С.432-434.

14. Практикум по микробиологии // Под ред.Н.С. Егорова. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1976. - 307 с.

15. БогомоловА.И. Современные методы исследования нефтей. - Л.: Недра, 1984. - 431 с.

16. Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. - М.: Изд-во МГУ, 1991. - 231 с.

17. Гилажов Е.Г., Диаров М.Д., Муликов Р.Р. Экология и нефтегазовый комплекс. - Алматы: ?ылым, - Т.4 - 832 с.

18. Киреева Н.А., Галимзянова Н.Ф. Влияние загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами на численность и видовой состав микромицетов // Почвоведение. - 1995 - № 3-4. - С. 20-27.

19. Давыдова С.Л., Тагасов В.И. Нефть и нефтепродукты в окружающей среде. - М.: Изд-во РУДН, 2004. - 163 с.

20. Хазиев Ф.Х., Фатхиев Ф.Ф. Изменение биохимических процессов в почвах при нефтяном загрязнении и активация разложения нефти // Агрохимия. - 1988. - № 2. - С.56-61.

21. Абрамян С.А. Изменение ферментативной активности почвы под воздействием естественных и антропогенных факторов // Почвоведение. - 1992. - № 7. - С.70-82.

22. Кочетков И.А., Лазарева И.О. Влияние некоторых загрязнителей на показатели биологической активности почв // Вопросы экологии и охраны природы в лесостепной и степной зонах: Сб. науч. тр. - Самара: Изд-во СГУ, 1999. - С.160

23. Рахимова Э.Р., Гарусов А.В., Зарипова С.К. Биологическая активность нефтезагрязненной почвы при засолении // Почвоведение. - 2005. - № 4. - С.481-485.

24. Краснопевцева Н.В., Крашенинникова Т.К. и др. Разработка технологий получения биодеградантов нефти для очистки мест добычи и переработки // Экология 2002: эстафета поколений: Материалы II Путинской междунар. школы-семинара по экологии, 23-26 апреля 2002 г. - Пущино, 2002. - С.50-51.

25. Капотина Л.Н., Морщакова Г.Н. Биологическая деструкция нефти и нефтепродуктов, загрязняющих почву и воду // Биотехнология. - 1998. - № 1. - С.85-92.

26. Киреева Н.А. Микроскопические грибы-биодеструкторы нефтяных углеводородов в почве // Ботанические исследования на Урале. Информационные материалы. - Свердловск, 1990. - С.41.

27. Кузнецов В.Д., Зайцева Т.А. и др. Streptomyces albiaxialis sp. nov. - новый вид термо - и голотолерантного стрептоми-цета, разлагающего углеводороды нефти // Микробиология. - 1984. - Т.53. - № - С.116-121.

28. Заборина О.Е., Барышникова Л.М. и др. Разложение пентахлорфенола в почве интродуцированным штаммом Streptomyces rochei303 и активированной почвенной микрофлорой // Микробиология. - 1997. - Т.66. - № 5. - С.661

29. Rhykerd R. L., Weaver R. W., Mclnnes K. J. Influence of salinity on bioremediation of oil in soil // Environ. Pollut. - 1995. - 90. - № 1. - P.127-130.

30. Звягинцев Д.Г., Гузев В.С. и др. Диагностические признаки различных уровней загрязнения почв нефтью // Почвоведение. - 1989. - № 1. - С.72-78.

Размещено на Allbest.ru