Размещено на http://www.allbest.ru/

1

Министерство образования и науки Российской Федерации

ФГБОУ ВПО «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»

Кафедра «Экологии»

Дипломная работа

на тему: Сравнительный анализ изменения интенсивности перекисного окисления липидов в листовой пластинке березы повислой и величины флуктуирующей асимметрии морфологических признаков листа при действии автотранспортной нагрузки

Выполнила:

Стулова Ивана Владимировича

Нижний Новгород - 2012

Содержание

Реферат

Введение

1. Обзор литературы

1.1 Свободнорадикальные процессы в растительном организме

1.1.1 Механизмы перекисного окисления и антиоксидантная система у растений

1.1.2 Действие среды на интенсивность ПОЛ

1.2 Флуктуирующая ассиметрия

1.3 Биолого-экологическая и популяционная характеристика объекта исследования березы повислой (Betula pendula Roth)

2. Материалы и методы исследований

3. Результаты и их обсуждение

Выводы

Цитированная литература

Реферат

Целью данной работы являлось изучение интенсивности ПОЛ в листовой пластинке березы повислой, произрастающей вдоль автомагистралей г. Нижнего Новгорода и величины флуктуирующей асимметрии комплекса морфологических признаков листа при действии автотранспортной нагрузки.

Задачи работы:

· Определить интенсивность ПОЛ в листьях березы повислой, произрастающей вдоль автомагистралей г. Нижнего Новгорода, по содержанию малонового диальдегида.

· Оценить уровень флуктуирующей асимметрии комплекса морфологических признаков листовой пластинки березы повислой при действии автотранспортной нагрузки.

· Провести сравнительный анализ изученных показателей.

Материалом исследования служили листовые пластинки березы повислой, собранные вдоль автомагистралей с разным уровнем автотранспортной нагрузки.

Для определения количества МДА как одного из показателей ПОЛ использовалась стандартная лабораторная методика (Камышников, 2002)

По результатам исследования можно говорить о согласованных изменениях морфогенетических и биохимических показателей листа березы при возрастании интенсивности автотранспортной нагрузки.

Введение

К настоящему времени накоплен огромный фактический материал, позволяющий заключить, что усиление свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов (ПОЛ) являются одной из универсальных клеточных реакций на воздействие различных по своей природе стрессовых факторов на организм животных (Меерсон, 1986, Меерсон, Пшенникова, 1988, Соколовский, 1993) и растений (Мерзляк, 1999, Минибаева, Гордон, 2003). Избыточное образование свободных радикалов происходит в результате интенсификации биохимических реакций, обеспечивающих сохранение гомеостаза при действии на организм экстремальных факторов среды. Это позволяет говорить о неспецифическом характере активации свободнорадикальных процессов и ПОЛ (Свободное…, 2003), что определяет возможность использования показателей интенсивности ПОЛ в биоиндикации. В то же время, вопрос о том, насколько быстро интенсивность ПОЛ изменяется в результате средового стресса и как долго сохраняются эти изменения, изучен недостаточно.

Одним из перспективных подходов для интегральной характеристики качества среды в настоящее время является оценка состояния живых организмов по стабильности развития, которая характеризуется уровнем флуктуирующей асимметрии морфологических структур (Захаров, 1986; Захаров и др., 2001). Стабильность развития рассматривается как показатель уровня средового стресса (Захаров и др., 2000). При нарушении стабильности развития изменяются частные параметры функционирования организма: биохимические и физиологические показатели, морфологические признаки. Поэтому в качестве меры стабильности развития используется уровень флуктуирующей асимметрии морфологических признаков. Поскольку уровень флуктуирующей асимметрии так же, как интенсивность ПОЛ, неспецифически возрастает в ответ на отклонение характеристик среды от оптимальных для данного вида, представляется актуальным определить связь между этими характеристиками и согласованность их изменения.

Особенно значительным представляется изучение этого вопроса в отношении видов-биоиндикаторов, например, березы повислой (Betula pendula), флуктуирующая асимметрия комплекса морфологических признаков которых широко используется для оценки качества среды.

Целью данной работы являлось изучение интенсивности ПОЛ в листовой пластинке березы повислой, произрастающей вдоль автомагистралей г. Нижнего Новгорода и величины флуктуирующей асимметрии комплекса морфологических признаков листа при действии автотранспортной нагрузки.

Для достижения сформулированной цели были поставлены следующие задачи: асимметричный листок флуктуирующий растительный

· Определить интенсивность ПОЛ в листьях березы повислой, произрастающей вдоль автомагистралей г. Нижнего Новгорода, по содержанию малонового диальдегида.

· Оценить уровень флуктуирующей асимметрии комплекса морфологических признаков листовой пластинки березы повислой при действии автотранспортной нагрузки.

· Провести сравнительный анализ изученных показателей.

1. Обзор литературы

1.1 Свободнорадикальные процессы в растительном организме

1.1.1 Механизмы перекисного окисления и антиоксидантная система у растений

В растительных клетках в результате различных процессов образуются активные формы кислорода (АФК) - его радикалы: супероксидный анион-радикал , гидроксильный радикал НО*, пергидроксильный радикал НОО*, алкоксильный радикал RO*, пероксильный радикал ROO*, оксид азота NO*, а также радикалообразующие молекулы - предшественники радикалов и участники свободнорадикальных реакций: перекись водорода Н₂О₂, гипохлорит НОСl, синглетный кислород , озон О₃, гидро(липо)перекиси ROOH, LOOH, ионы металлов с переменной валентностью.

Свободные радикалы из-за наличия у них неспаренных электронов очень реакционноактивные соединения, поэтому время жизни их в клетке невелико - доли секунды.

Они могут вступать в реакции с радикалами, а также соединениями нерадикальной природы, особенно содержащими двойные связи. Скорость и тип этих реакций зависят от концентрации радикалов в клетке, делокализации электрона в радикале (что определяет время его жизни), физико-химических свойств среды, близости мишеней - биомолекул, а также присутствия и количества антиоксидантов (Свободное..., 2003).

Свободные радикалы образуются эндогенно в растительных клетках в результате следующих процессов:

*митохондриальное окисление. В митохондриях происходит перенос электронов по электрон-транспортной цепи от субстратов дыхания на кислород. В результате четырехэлектронного восстановления кислорода образуется вода, а передача электронов по ЭТЦ обеспечивает возникновение трансмембранного градиента протонов и образование АТФ. Таким путем восстанавливается до 98% кислорода, остальные 2% идут на образование активных форм кислорода в результате побочных химических реакций (Скулачев, 1998). Образуется супероксидный радикал, который затем преобразуется (дисмутирует) в перекись водорода и гидроксильный радикал.

Продукция СОР митохондриями возрастает при повышении потребления кислорода и гипоксии.

*микросомальное окисление ксенобиотиков и эндогенных субстратов.

*фотодыхание в пероксисомах.

*в процессе фотосинтеза. Синглетный кислород образуется в процессе фотоокисления воды в фотосистеме 2 (Мерзляк, 1999, Apel, Hirt, 2003), в результате переноса энергии с возбужденного светом хлорофилла и других пигментов-фотосенсибилизаторов.

В хлоропластах при участии ферредоксина и пластосемихинона образуется (Тихонов, 1999, Мерзляк, 1999). Пероксид водорода в хлоропластах образуется в результате действия супероксиддисмутазы и при окислении гликолата - одного из побочных продуктов фотосинтеза, образующегося в результате побочной оксигеназной реакции, катализируемой основным ферментом фотосинтеза - рибулезобисфосфаткарбоксилазой (Тихонов, 1999).

* в ЭПР в процессе метаболизма ксенобиотиков, образование СОР обусловлено цитохромом Р-450 и ферментативным окислением НАДФ*Н (Мерзляк, 1999).

*ряд авторов считают, что основной источник СОР и перекиси водорода при развитии окислительного взрыва - ферментные системы, локализованные на внешней поверхности растительной клетки - НАДФ^.Н-зависимая оксидазная система, подобная таковой в нейтрофилах млекопитающих (Минибаева, Гордон, 2003).

Кроме того, усиление образования АФК может происходить в результате экзогенных процессов и воздействий на растительный организм, чему будет посвящена часть 2 данной главы.

Мишенями свободных радикалов в клетке являются различные макромолекулы: ДНК, белки, липиды.

Наиболее изученной является способность свободных радикалов инициировать процесс перекисного окисления липидов, который приводит к нарушению структуры мембран в результате модификации их липидных компонентов (Свободное..., 2003).

Липиды - один из основных компонентов биомембран, во многом определяющий их проницаемость и свойства, а также активность белковых ферментных систем мембран. Поэтому даже незначительная трансформация липидов приводит к существенному изменению свойств мембран клетки.

Перекисное окисление липидов (ПОЛ) - свободнорадикальное окисление полиненасыщенных жирных кислот в биологических системах (Свободное..., 2003).

Это цепной процесс, инициируемый свободными радикалами и самоподдерживающийся за счет возникновения свободных радикалов в каждой новой его реакции (Владимиров, Арчаков, 1982).

Процесс ПОЛ протекает в три стадии: инициирования, развития (пролонгирование) и завершения (терминации). Инициирование ПОЛ происходит в результате взаимодействия АФК и полиненасыщенных жирных кислот мембран. К АФК, способным инициировать окисление липидов, относятся гидроксил, алкоксирадикал, пероксил.

Пероксид водорода и супероксидный радикал не обладают достаточной реактивностью. В результате инициации образуется радикал жирной кислоты. Легче всего отрыв атомов водорода происходит в - положении к двойной связи, что связано с ослаблением связи вблизи двойной связи. Поэтому ПОЛ наиболее подвержены боковые цепи полиненасыщенных жирных кислот.

Образующийся свободный радикал способен присоединять кислород с образованием пероксила, который в дальнейшем взаимодействует с другими остатками жирных кислот. То есть процесс вступает в стадию пролонгирования:

далее процесс повторяется.

- сильнее, чем , он способен отрывать атом водорода органических молекул (Осипов и др. 1990).

Цепная реакция ПОЛ заканчивается в случае взаимодействия двух свободных радикалов, нейтрализующих друг друга с образованием циклической перекиси:

ПОЛ в биомембранах происходит в присутствии металлов переменной валентности, в частности, (Владимиров, Арчаков, 1972).

Это приводит к активации перекисного окисления - окислительному взрыву. В норме цепь реакций ПОЛ обрывается за счет действия антиоксидантных систем клетки. Усиление ПОЛ в биологических мембранах приводит к резкому изменению их свойств: потере вязкости, падению мембранного потенциала, повышению проницаемости для ионов.

ПОЛ приводит к образованию в клетке целого ряда веществ. Первичный продукт ПОЛ - гидроперекиси. При их распаде образуются гидроксил-ион и алкокси-радикал, из которого, в свою очередь, образуются ненасыщенные альдегиды (Свободное..., 2003).

Вторичные продукты ПОЛ - соединения, образующиеся при биотрансформации пероксидов. К ним относятся альдегиды (прежде всего малоновый диальдегид), флуоресцирующие Шиффовы основания и пигменты (липофусцин) - продукты полимеризации-поликонденсации липидов (Свободное..., 2003), а также другие альдегиды, обладающие токсическим действием. Избыточное образование вторичных продуктов ПОЛ приводит к множеству цитотоксических эффектов: инактивации ряда ферментных систем, угнетению синтеза белка и ДНК, повреждению ДНК, лизису многих клеточных структур, нарушению мембранных процессов, деления клетки, что угрожает клетке гибелью (Свободное..., 2003), фотоингибированию фотосинтеза, побурению плодов (Мерзляк, 1999), а также дестабилизации генома за счет повышения числа хромосомных обменов и подвижности мобильных элементов ДНК - увеличения числа транспозиций (Kovalchuk et al., 2003).

Свободные радикалы присутствуют в организме постоянно и выполняют важные физиологические функции: регулируют специфическую активность некоторых ферментов и мембранных белков, генную экспрессию, активируют факторы транскрипции (Apel, Hirt, 2004). От процессов ПОЛ непосредственно зависит скорость клеточного деления и интенсивность фосфорилирования, обновление фосфолипидных составляющих мембран, проницаемость мембран клетки, а также белковый синтез и распад(Свободное..., 2003). От продукции АФК зависит метаболизм и синтез фитогормонов, регуляция фотосинтеза растений, митохондриальное окисление, апоптоз, старение. АФК играют важную роль в защите растений, участвуя в образовании лигнинина, внеклеточной защите от микроорганизмов, обуславливают специфический иммунитет растений, не только вызывая гибель в результате реакции сверхчувствительности, но и индуцируя активность генов, участвующих в более поздних защитных реакциях растений (Аверьянов, 1991, Мерзляк, 1999). Эти функции АФК выполняют в нормальных физиологических условиях, при которых образование АФК уравновешивается их разрушением, и накопления вредных вторичных продуктов ПОЛ не наблюдается.

Кроме того, АФК играют важную роль в реакции растения на средовые стрессы - патогенные организмы, засуху. Поэтому задача, стоящая перед растением, заключается не в том, чтобы избежать появления АФК, а в том, чтобы контролировать их уровень в организме и управлять индуцируемыми ими реакциями (Минибаева, Гордон, 2003).

Высокие концентрации АФК вызывают повреждения биологических молекул, поэтому в организме существует система защиты от свободных радикалов - антиоксидантная система, предотвращающая резкое повышение концентраций АФК и их продуктов в клетке.

Компоненты антиоксидантной системы классифицируются по нескольким признакам (Свободное..., 2003):

1. по механизмам действия: антирадикальные и антиперекисные;

2. по молекулярному строению: ферменты и неферменты (высокомолекулярные и низкомолекулярные);

3. по фазе, в которой действуют: водорастворимые и жирорастворимые;

4. по локализации действия: внутриклеточные, мембранные и внеклеточные.

К ферментным компонентам антиоксидантной системы относятся супероксиддисмутазы, обеспечивающие антирадикальную защиту, каталаза - фермент антиперекисной защиты, глутатионпероксидаза и другие пероксидазы (Минибаева, Гордон, 2003, Мерзляк, 1999, Гарник и др., 2004 Тихонов, 1999).

К неферментативным антиоксидантам относятся каротиноиды - жирорастворимые пигменты, способные «тушить» синглетный кислород и возбужденный хлорофилл, рассеивая энергию в виде тепла, глутатион, способный взаимодействовать в том числе с гидроксильным радикалом, аскорбиновая кислота, в высоких концентрациях присутствуящая в хлоропластах и других структурах клетки, а также во внеклеточном пространстве - апопласте, где играет важную роль в защите растение от действия озона и других загрязнителей атмосферы, проникающих через устьица (Мерзляк,1999); -токоферол, основная роль которого - устранение свободных радикалов мембранных липидов (Мерзляк, 1999).

Кроме этого, выделяют вторичные антиоксиданты - ферменты, способные обнаруживать и устранять первичные окислительные повреждения. Фосфолипазы избирательно расщепляют поврежденные остатки жирных кислот мембранных липидов, потеолитические ферменты расщепляют поврежденные АФК белки (Мерзляк, 1999). Затем включаются механизмы экспрессии гена, кодирующего синтез поврежденного полипептида (Тихонов, 1999).

Таким образом, антиоксидантная система растительного организма - сложная, многокомпонентная и многоуровневая система, что позволяет растениям поддерживать определенный уровень ПОЛ в клетке в довольно широком спектре условий среды. Однако, образование АФК и функционирование антиоксидантной системы зависят от многих факторов, действующих на организм.

1.1.2 Действие среды на интенсивность ПОЛ

Благодаря функционированию антиоксидантной системы растения способны поддерживать постоянный невысокий уровень ПОЛ, не вызывающий повреждения клеток, в довольно широком спектре условий среды. При отклонении условий среды от оптимальных для данного вида, то есть при любых стрессовых воздействиях, возрастает продукция АФК в растительных клетках, и, следовательно, усиливается процесс ПОЛ. При внешних стрессовых воздействиях Н₂О₂ накапливается в клетках благодаря ингибированию каталазы салициловой кислотой. Перекись является вторичным мессенджером (передатчиком) в каскаде сигнальных реакций, индуцирующих синтез ферментов-антиоксидантов. Уровень их активности и способность растений к быстрому его повышению определяют устойчивость растений к действию стресса (Полесская и др., 2004).

Усиление процесса ПОЛ - неспецифическая реакция растений на средовой стресс, отмечаемая при различных, как естественных, так и антропогенных, воздействиях. Экстремальные значения факторов среды приводят к разбалансировке систем биохимических реакций организмов, что может привести к быстрому нарастанию концентрации АФК - так называемому оксидазному взрыву и, в конечном счете, к гибели клетки.

Внешние факторы в данном случае могут действовать в двух направлениях:

*усиливая продукцию АФК - таким образом действуют прооксиданты - озон, радиоактивное излучение (вызывает радиолиз воды, образуются НО* и Н₂О₂), патогенные микроорганизмы, поранения;

*ингибируя элементы антиоксидантной системы клеток, снижая способность клеток противостоять ПОЛ. Так действуют тяжелые металлы, токсические вещества. Изменение активности ферментов-антиоксидантов наблюдается в ответ на засуху, засоление (снижается активность пероксидазы), действие низких температур, повышение концентрации тяжелых металлов в среде (Полесская и др., 2004, Мерзляк, 1999).

Кроме того, можно выделить факторы, воздействующие на весь метаболизм клетки, например, температура и количество влаги. Действие температуры основано на влиянии на кинетику биохимических процессов, при этом скорости различных реакций при изменении температуры меняются неодинаково. Поэтому при значительных колебаниях температуры происходит нарушение гомеостаза организма, выражающееся в частности в усилении ПОЛ. Гибель термофильных растений при низких положительных температурах наступает в результате усиления ПОЛ (Мерзляк, 1999).

Важную роль в усилении продукции АФК в ответ на стресс у растений отводят внеклеточным пероксидазам (Аверьянов, 1991, Минибаева, Гордон, 2003, Apel, Hirt, 2004). Именно их активность обуславливает своеобразный иммунный ответ растений, выражающийся в повышении продукции АФК и увеличении активности антиоксидантных ферментов в ответ на многие абиотические и биотические стимулы: воздействие ветра и механического трения, обработка растений озоном, воздействие патогенных микроорганизмов и токсичных химических веществ. Предполагают, что в данном случае АФК, в частности супероксидный радикал, могут способствовать обезвреживанию патогенов, подобно действию фагоцитов животных. Эти реакции опосредуются через концентрацию гормонов растений (Минибаева, Гордон, 2003).

Воздействие солености, избыточного солнечного излучения и озона приводит к снижению эффективности фотосинтеза и повышению оксидазного стресса (в частности за счет побочных реакций фотосинтеза) вплоть до оксидазной гибели клетки (Hurst et al., 2004). Также показано усиление ПОЛ в ответ на почвенную засуху и переувлажнение (Калашников и др., 1992).

Газообразные загрязнители атмосферы антропогенного происхождения вызывают образование СР в растениях. Так действуют компоненты фотохимического смога (пероксиацетилнитриты), диоксид серы и озон. Диоксид серы в хлоропластах при участии СОР продуцирует токсические серосодержащие радикалы, озон - прооксидант, приводящий к усилению ПОЛ (Мерзляк, 1999).

Повышение концентрации тяжелых металлов (железа, свинца и др.) также вызывают усиление продукции АФК за счет участия в рекциях свободнорадикального окисления, в том числе в образовании наиболее реакционноспособных гидроксильных радикалов. Но в то же время тяжелые металлы активируют антиоксидантную систему растительного организма, повышая концентрацию и активность аскорбатпероксидазы и других компонентов антиоксидантной системы, в том числе и неферментных (Ratkevicius et al., 2003). При экспериментальном внесении в среду выращивания растений тяжелых металлов низкие их концентрации (5 - 10 мкмоль) стимулируют рост и не вызывают окислительного стресса и повреждения растений, высокие же концентрации вызывают повреждения, развивающиеся в следующей последовательности: усиление ПОЛ, повышение проницаемости мембран, торможение роста, видимые повреждения, гибель отдельных органов и целых растений. По степени токсичности для растения металлы располагаются в следующей последовательности (в порядке ее уменьшения): медь, никель, цинк, свинец (Башаков,2002). Хотя алюминий непосредственно не участвует в реакциях свободнорадикального окисления и не способен их катализировать, повышение концентрации алюминия в среде (как в воздухе, так и в почве) является толчком к усилению ПОЛ и продукции АФК в различных частях растений (Yamamoto et al., 2003, Domingos et al., 2003).

В развитии оксидазного стресса также проявляется эффект взаимодействия факторов: при изменении активности антиоксидантных ферментов в ответ на снижение температуры существенное значение имеет форма и количество азота в почве. Самый высокий уровень ПОЛ наблюдается при одновременном действии пониженной температуры и недостатка азота в почве (Полесская и др., 2004).

АФК - центральный компонент адаптации растений к абиотическим и биотическим стрессам. В связи с этим можно выделить два вида их воздействия: интенсификация и ускорение процесса гибели клеток и активация защитных систем растительного организма (Ratkevicius et al., 2003). При патогенезе в основном реализуется оксидазная гибель клеток, что препятствует распространению патологии по растительному организму. При абиотическом стрессе уровень АФК повышается преимущественно в хлоропластах и митохондриях, что приводит систему в целом на более высокий уровень адаптации, в клетках повышается активность компонентов антиоксидантной системы и гибели клеток, как правило, не происходит (Apel, Hirt, 2004).

Таким образом, уровень ПОЛ и концентрация его продуктов в клетках растений - интегральный отклик растительного организма на условия среды, что позволяет использовать этот показатель в биоиндикации.

1.2 Флуктуирующая асимметрия

Симметрия, как вид согласованности отдельных частей, который объединяет их в единое целое, является одним из наиболее общих и широких понятий (Вейль, 1968). Симметрия - имманентная характеристика тел материального мира - может быть определена как инвариантность физических и геометрических систем по отношению к определенным преобразованиям (Вейль, 1968, Чупрунов и др., 2000, цит. по Гелашвили и др., 2004). Под асимметрией в данном случае понимаются различные отклонения от строгой билатеральной симметрии (Захаров, 1987). Ряд авторов (Захаров, Чубинишвили) считают, что отсутствие абсолютно симметричных организмов является следствием несовершенства механизмов контроля онтогенеза, их неспособности противостоять воздействию окружающей среды. Другие (Вейль, 1968; Гелашвили и др., 2004), напротив, придерживаются мнения, что асимметрия, наряду с симметрией, - имманентная характеристика биообъекта, неизбежно проявляющаяся в онтогенезе, поскольку нормальное развитие организма допускает определенное варьирование признаков и асимметрия увеличивает адаптивные возможности организма.

Наиболее часто используется классификация явлений асимметрии, предложенная Ван Валеном (Van Valen, 1962, цит. по Захарову, 1987), согласно которой все разнообразие явлений асимметрии подразделяется на три основных типа:

1. Направленная асимметрия, когда в норме какая-то структура развита на одной определенной стороне больше, чем на другой.

2. Антисимметрия, характеризующаяся большим развитием структуры то на одной, то на другой стороне тела, что соответствует отрицательной связи между сторонами.

3. Флуктуирующая асимметрия, которая может быть определена по нормальному распределению относительно нуля различий между сторонами, взятых со знаком, - то есть незначительные случайные отклонения от строгой билатеральной симметрии.

Флуктуирующая асимметрия выделяется среди всех явлений асимметрии как широко распространенное явление в силу принципиального сходства по форме выражения (незначительные случайные отклонения от строгой билатеральной симметрии), функциональной значимости (находясь в пределах нормы реакции) и причинной обусловленности. Флуктуирующая асимметрия представляет значительный общебиологический интерес как проявление особой формы изменчивости (относящаяся к эпигенетической изменчивости), а также прикладной интерес как метод оценки нарушения стабильности развития организмов.

Флуктуирующая асимметрия есть проявление внутрииндивидуальной изменчивости, т.е. характеризует различия между гомологичными структурами внутри одного индивида. Подобный тип изменчивости широко распространен у растений, где в пределах одного индивида, можно провести разносторонний анализ метамерных структур, например листьев (они наиболее часто используются для этих целей)(Семериков, Глотов, 1971; Глотов и др., 1975; Семериков, 1975). Но важно отметить, что если уровень флуктуирующей асимметрии является характеристикой индивидуума, а значит, можно оценивать различие разных групп особей по среднему уровню различий между сторонами, то данное явление (флуктуирующая асимметрия) может рассматриваться и с позиции надиндивидуальной (популяционной) изменчивости.

1.3 Биолого-экологическая и популяционная характеристика объекта исследования березы повислой (Betula pendula Roth)

Растения являются важным объектом биомониторинга. Необходимость оценки состояния природных популяций растений вызвана тем, что они, являясь продуцентами, играют огромную роль в сообществах и определяют их вид. Растения - чувствительный объект, позволяющий оценивать весь комплекс воздействий, характерный для данной территории в целом, так как они ассимилируют вещества и подвержены прямому воздействию одновременно из двух сред: почвы и воздуха. В связи с тем, что растения ведут прикрепленный образ жизни, состояние их организма отражает состояние конкретного локального местообитания. Кроме того, использование растений удобно: материал для исследования доступен и прост в сборе и обработке.

Древесные растения менее подвержены воздействию микробиотопических условий, поэтому они чаще используются для оценки состояния среды на какой-либо территории в целом. Разработаны методики для следующих видов растений: береза повислая, липа сердцевидная, акация белая, клевер луговой (Чистякова, Кряжева, Захаров, 1996).

По методике (Кряжева Н. Г., Чистякова Е. К., 1993) вид растений, выбранный для оценки качества среды по уровню стабильности развития, должен удовлетворять следующим требованиям:

- не находиться на периферии ареала,

- не являться гибридным,

- не являться интродуцентом на данной территории,

- являться фоновым видом для исследуемой местности.

Береза повислая, или бородавчатая - Betula pendula Roth., семейство Березовые - Betulaceae. Дерево около 20 м. высотой, нередко с асимметричной кроной, с белой и гладкой корой у молодых экземпляров, которая становится глубоко-трещиноватой и черной у старых. Ветви обычно повислые. Побеги красновато-бурые со смолистыми бородавчатыми железками. Листья яйцевидно-ромбические, в основании клиновидные, острые, двоякозубчатые, гладкие, в молодости клейкие, с черешками 2-3 см. длиной. Цветение в мае, плодоношение поздней осенью.

Светолюбивое дерево, входящее как примесь в таежные и широколиственные леса. Часто береза составляет основу вторичных мелколиственных лесов, формирующихся на месте сведения коренных лесов из ели, дуба и др. Благодаря распространению семян с помощью ветра легко занимает пустоши, гари, заброшенные пашни, обочины дорог.

Ареал растения охватывает европейскую часть страны, Западную Сибирь, Алтай, Кавказ, Дальний Восток, Западную Европу, Среднюю Азию, Монголию, Китай, Корею, Японию.

В сравнении с другими видами берез повислая имеет на листьях более толстую кутикулу, представляющую собой плотную неклеточную жироподобную пленку, сплошь покрывающую эпидермис. Благодаря этому она отличается повышенной устойчивостью к сернистому газу и другим промышленным выбросам, поэтому оказывается возможным произрастание дерева в городах с неблагоприятными экологическими условиями (Алексеев и др., 1997).

При выборе растений важно учитывать четкость определения принадлежности растения к исследуемому виду, поскольку морфологические и биохимические показатели, а также оптимальные условия внешней среды отличаются для разных видов, условия произрастания особи, и возрастное состояние. Березу повислую нужно отличать от пушистой и гибридной формы. Характерными признаками березы пушистой, являются слабопоникающие ветви, белая кора на значительной части ствола, густоопушенные побеги без смолистых бородавочек, яйцевидные листья с округлым основанием, весной опушенные и клейкие, позже сверху гладкие, лоснящиеся, снизу более бледные и опушенные (Алексеев и др., 1997). Береза пушистая, в отличие от повислой, растет в более увлажненных местах, то есть предпочитает повышенную влажность почвы. Гибридизация может повлиять на уровень стабильности развития, поэтому рекомендуется выбирать растения с четко выраженными видовыми признаками.

Листья должны быть собраны с растений, находящихся в одинаковых экологических условиях (уровень освещенности, увлажнения, и т. д.). Рекомендуется выбирать растения, растущие на открытых участках, так как для многих из них условия затенения являются стрессовыми и могут существенно снизить стабильность развития. Рекомендуется использовать растения, достигшие генеративного состояния.

2. Материалы и методы

Материалом исследования служили листовые пластинки березы повислой, собранные во второй половине июля 2011г. в биотопах г. Нижнего Новгорода, расположенных вдоль автомагистралей с разным уровнем автотранспортной нагрузки

Собранные листья транспортировались в лабораторию в термосе со льдом (температура +2-+4С⁰), что препятствует усилению перекисного окисления. От момента сбора листьев до проведения анализа должно проходить не более 3 часов, за этот период содержание продуктов ПОЛ, в частности малонового диальдегида, остается стабильным.

Для определения количества МДА как одного из показателей ПОЛ использовалась стандартная лабораторная методика (Камышников, 2002). Из каждой пробы (25-30 листьев с одного дерева) берется навеска массой 2 грамма. Листья растираются в ступке, вмороженной в лед, с 14 мл среды выделения до однородности. В качестве среды гомогенизации используется смесь 1мМ ЭДТА, 1 мМ. аскорбиновой кислоты и 50 мМ. KH₂PO₄. полученная масса через воронку и фильтр отжимается в пробирку, откуда стеклянной пипеткой отбирается 2 мл. суспензии и помещается в центрифужную пробирку с 2 мл трихлоруксусной кислоты (20 %) - для осаждения белков и создания кислой среды, пробирки нумеруются (1-10). Готовится холостая проба - 2 мл. ТХУ и 2 мл. среды выделения. Затем во все 11 пробирок добавляется по 2 мл тиобарбитуровой кислоты (0.75%) и пробы нагреваются в течение 30 минут на кипящей водяной бане. При повышенной температуре в кислой среде ТБК взаимодействует с МДА, образуется окрашенный триметиновый комплекс с максимумом поглощения при 532 нм ( зеленый светофильтр). Пробы охлаждают, центрифугируют 15 минут при 3000 оборотов в минуту, после чего поочередно фотометрируют надосадочную жидкость из каждой пробы относительно контроля (холостого опыта) на фотоэлектроколориметре ФЭК КФК - 3. Содержание МДА выражали в относительных единицах оптической плотности.

Отсканированные изображения листовых пластинок были обработаны в программе Adobe PHOTOSHOP CS3 ver. 10.0. Был измерен стандартный набор из 5 признаков.

Размещено на http://www.allbest.ru/

1

Рис. 1. Схема промеров листовой пластинки березы повислой

Интегральный показатель ФА был рассчитан по алгоритму нормированной разности:

Где m-количество особей в выборке, n-количество признаков у каждой особи, L-величина признака справа, R-величина признака слева (Захаров, 2000).

Статистическую обработку данных проводили в программе БИОСТАТИСТИКА, с помощью непараметрических критериев Крускала-Уоллеса и Ньюмена-Кейлса.

3. Результаты и обсуждение

Результаты анализа данных показали, что наиболее низкое значение ФА отмечалось в биотопе с минимальной автотранспортной нагрузкой. У березы на участках со средним и высоким уровнем нагрузки величина ФА была практически в 2 раза выше. Что согласовывается с данными других авторов (Кряжева и др., 1996) о том, что загрязнение окружающей среды может приводить к нарушению стабильного развития листа и увеличения величины его ФА (рис.2).

Рис 2. Величина ФА листа березы повислой при действии разного уровня автотранспортной нагрузки.

Примечание: * - р<0.05 по отношению к участку с потоком автотранспорта 64 авто/ч.

# - р<0.05 по отношению к участку с потоком автотранспорта 634 авто/ч.

При сравнении интегрального показателя ФА у деревьев со средним и высоким уровнем нагрузки так же были выявлены статистические значимые изменения показателей. Интегральный показатель ФА листа в наиболее загрязненном участке был незначительно меньше по сравнению с состоянием деревьев на участке со средним уровнем нагрузки

На II этапе работы проанализировали изменения интенсивности липопероксидации при действии автотранспортной нагрузки. Было установлено, что более высокий уровень ПОЛ был у деревьев на участках со средним и высоким уровнем загрязнения. При этом наиболее значительная интенсивность отмечалось на участке со средним уровнем загрязнения (рис.3).

Рис. 3. Интенсивность ПОЛ в листе березы повислой при действии разного уровня автотранспортной нагрузки.

Примечание: * - р<0.05 по отношению к участку с потоком автотранспорта 64 авто/ч.

# - р<0.05 по отношению к участку с потоком автотранспорта 634 авто/ч.

Таким образом, динамика изменения интенсивности липопероксидации и величины ФА листа березы при возрастании потока автомобилей была очень сходной, т.е. можно говорить о согласованных изменениях морфогенетических и биохимических показателей листа березы при возрастании интенсивности автотранспортной нагрузки.

Возможно, снижение величины ФА и уровня липопероксидации у березы повислой при наиболее высокой автотранспортоной нагрузке связано с тем, что в процесс адаптации у растений в этом случае включаются дополнительные защитные механизмы (увеличение синтеза пептидов, связывание тяжелых металлов, синтез ферментов, обеспечивающих детоксикацию органических ксенобиотиков), что позволяет снизить негативное влияние загрязнения. В то же время тяжелые металлы активируют антиоксидантную систему растительного организма, повышая концентрацию и активность аскорбатпероксидазы и других компонентов антиоксидантной системы, в том числе и неферментных (Ratkevicius et al., 2003).

Выводы

1. Содержание МДА было выше у березы повислой при действии средней и высокой автотранспортной нагрузки (ул. Ижорская - 634авто/ч, ост. Казанское шоссе (ул. Родионова) - 2646 авто/ч) по сравнению с данным показателем у деревьев на участке с низкой автотранспортной нагрузкой. При этом интенсивность липопероксидации у деревьев на участке с высокой нагрузкой была ниже по сравнению с деревьями на участке со средней интенсивностью загрязнения.

2. Величина ФА была выше у березы повислой при действии средней и высокой автотранспортной нагрузки (ул. Ижорская - 634авто/ч, ост. Казанское шоссе (ул. Родионова) - 2646 авто/ч) по сравнению с данным показателем у деревьев на участке с низкой автотранспортной нагрузкой. При этом величина ФА у деревьев на участке с высокой нагрузкой была немного ниже, чем у деревьев на участке со средней интенсивностью загрязнения.

3. Изменение содержания МДА в листе березы повислой и величины ФА листовой пластинки имело сходный характер при возрастании автотранспортного загрязнения.

Цитированная литература

1. Аверьянов А.А. Активные формы кислорода и иммунитет растений// Успехи современной биологии. 1991. Вып. 5. С.722 - 737.

2. Алексеев Ю.Е., Жмылев Ю. П., Карпухина Е. А. Деревья и кустарники. Энциклопедия природы России. М., 1997. 592 с.

3. Биотест: интегральная оценка здоровья экосистем и отдельных видов / Ред. Захаров М.В., Кларк Д. Н. М.: Центр экологической политики России, 1993. 63 с.

4. Вейль Г.Симметрия. М.: Наука, 1968. 191 с.

5. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биомембранах. М.: Наука, 1972. 272 с.

6. Гарник Е.Ю., Лазарева Е.В., Константинов Ю.М. Особенности изоферментных спектров анион-пероксидаз и СОД в каллусной культуре Larix sibirika Ledeb. и L. gmelinii Rupr. // Физиология растений. 2004. № 3. С. 429 - 434.

7. Гелашвили Д.Б., Чупрунов Е.В., Иудин Д. И. Структурные и биоиндикационные аспекты флуктуирующей асимметрии билатерально симметричных организмов// Журнал общей биологии. 2004. Т. 65, № 5. С. 433 - 444.

8. Гуськов Е.П., Вардуни Т.В., Шкурат Т.П. и др. Свободнорадикальные процессы и уровень аберраций хромосом в листьях древесных растений как тест-системы на генотоксичность городской среды // Экология. 2000. №4 С. 270 - 275.

9. Захаров В.М. Асимметрия животных. М.: Наука, 1987. 216 с.

10. Захаров В.М. Здоровье среды: концепция. М.: Центр экологической политики России, 2000. 30 с.

11. Захаров В.М. Онтогенез и популяция (стабильность развития и популяционная изменчивость)// Экология. 2001. № 3. С. 185 - 193.

12. Захаров В.М., Жданова Н.П., Кирин Е.Ф. Онтогенез и популяция: оценка стабильности развития в природных популяциях // Онтогенез. 2001. Т. 32, № 6. С. 404 - 421.

13. Здоровье среды: методика оценки./ В. М. Захаров и др. М.: Центр экологической политики России. 2000. 68 с.

14. Здоровье среды: практика оценки./ В.М. Захаров и др. М.: Центр экологической политики России. 2002. 95с.

15. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике. Мн.: Белорусь, 2002. Т.2. 495 с.

16. Калашников Ю.Е., Закржевский Д.А., Балахнина Т.И и др. Действие почвенной засухи и переувлажнения на активацию кислорода и систему защиты от окислительной деструкции в корнях ячменя// Физиология растений. 1992. Т. 39, Вып. 2. С. 263 - 269.

17. Кряжева Н.Г., Чистякова Е. К., Захаров В. М. Анализ стабильности развития березы повислой в условиях загрязнения. // Экология. 1996. №6. С. 365 - 370.

18. Меерсон Ф.З., Пшенникова М. Т. Адаптация к стрессовым ситуациям и физическим нагрузкам. М.: Медицина, 1985. 254 с.

19. Мерзляк М.Н. Активированный кислород и жизнедеятельность растений// Соросовский образовательный журнал. 1999. № 9. С. 20 - 27.

20. Минибаева Ф.А., Гордон Л. Х. Продукция супероксида и активность внеклеточной пероксидазы в растительных тканях при стрессе// Физиология растений. 2003. Т. 50, № 3. С. 459 - 465.

21. Полесская О.Г., Каширина Е. И., Алехина Н. Д. Изменение активности антиоксидантных ферментов в листьях и корнях пшеницы в зависимости от формы и дозы азота в среде// Физиология растений. 2004. №5. С. 686 - 691.

22. Свободное окисление и старение. / В. Х. Хавинсон, Баринов В.А., Арутюнян А.В., Малинин В.В. СПб.: Наука, 2003. 327 с.

23. Скулачев В.П. О биохимических механизмах эволюции и роли кислорода// Биохимия. 1998. Т. 63, Вып. 11. С. 1570 - 1579.

24. Соколовский В.В. Антиоксиданты в профилактике и терапии заболеваний// Международные медицинские обзоры. 1993. № 1. С. 11 - 14.

25. Тихонов А.Н. Защитные механизмы фотосинтеза// Соросовский образовательный журнал. 1999. № 11. С. 16 - 22.

26. Чистякова Е.К. Анализ стабильности развития в природных популяциях растений на примере березы повислой (Betula pendula Roth.): Автореф. дис. … канд. биол. наук. М.: 1997. 19 с.

27. Чистякова Е.К., Кряжева Н.Г. Возможность использования показателей стабильности развития и фотосинтетической активности для исследования состояний природных популяций растений на примере березы повислой// Онтогенез. 2001. Т. 53, № 6. С. 422 -427.

28. Apel K., Hirt H. Reactive oxygen species. Metabolism, oxidative stress and signal transduction// Annual review of plant biology. 2004. Vol. 5. P. 373-402.

29. Domingos М. et al. Combined effects of air and soil pollution by fluoride emissions on Tibouchina pulchra Cogn., at Cubatae, SE Brazil, and their relations with aluminum// Plant and Soil. 2003. Vol. 249. P. 297 - 309.

30. Hurst A.C., Grams T.E.E., Ratajczak R. Effects of salinity, high irradiance, ozone, and ethylene on mode of photosynthesis, oxidative stress and oxidative damage in the CAM intermediate plant Mesembryanthemum crystallinum L. // Plant, cell and environment. 2004. Vol. 27. P. 187 - 198.

31. Kovalchuk I. et al. Reactive oxygen species stimulate homologous recombination in plants//Plant, Cell and Environment. 2003. Vol. 26. P. 1531 - 1540.

32. Ratkevicius N., Correa J. A., Moenne A. Copper accumulation, synthesis of acrobat and activation of ascorbate peroxidase in Entheromorpha compressa (L.) Grew. (Chlorophyta) from heavy - metal - enriched environments in northern Chile//Plant, Cell and Environment. 2003. Vol. 26. P. 1599 - 1609.

Размещено на Allbest.ru