Экологическое состояние водоемов

2. Биотестирование природной воды требует использования в первую очередь непрерывных методов, поскольку в ходе анализа качества природных вод необходимо установление как острого, так и хронического токсического действия испытываемой воды.

3. Необходимо расширить круг используемых в настоящее время тест-объектов с целью поиска более чувствительных и экспрессных биотестов.

Актуальными остаются вопросы выбора контроля (фоновая вода из водного объекта или питьевая вода данного региона), в связи с этим и оценка различий опыта и контроля (с каким контролем сравнивать). Очень серьезного осмысления требует процедура воспроизводимости биотестов. Время воздействия на тест-объект довольно ограничено, поскольку в воде водного объекта непрерывно идут процессы ассимиляции и/или диссимиляции, продукции и/или деструкции, загрязнения и/или самоочищения, интоксикации и/или детоксикации и т.д., т.е. через сутки качество воды будет уже совершенно иным. Иными словами, требуется одновременная постановка экспериментов как можно с большим числом тест-объектом в силу невозможности повторения эксперимента с той же самой водой и необходима разработка требований к отбору и хранению проб воды для биотестирования. Так же важно обозначить специфические требования к основным положениям процедуры биотестирования с использованием различных организмов.

Для этого целесообразно использование методов биотестирования, включающих в качестве тест-объектов организмы короткоцикличные с высокой скоростью оборачиваемости популяции и имеющие небольшие размеры, широко распространенные, легко культивируемые в лабораторных условиях.Для подтверждения данных, полученных методами биологического анализа и количественной оценки комплекса загрязняющих веществ в компонентах экосистемы, требуется контроль за трансформацией загрязняющих веществ методами аналитической химии. Из выше изложенного, можно сделать вывод, что биотестирование позволяет получить:

· отклик лабораторных культур представительных тест-объектов либо выборки видов тест-объектов, взятых из фонового (условно чистого) участка;

· отклик тест-объектов, адаптировавшихся к воздействию, как правило, на уровне организма. На уровне популяций можно получить данные по адаптации только на короткоцикличных видах тест-объектов;

· информацию об условиях адаптации тест-объектов к воздействию исследуемой воды без учета такого важного фактора, как биотический;

· оценку токсического действия природных вод.

Получить прогноз развития экосистемы в естественных условиях затруднительно. Возможно получение только "сигнальной" (ориентировочной) информации об уровне влияния на те систематические группы сообществ, представители которых были взяты в качестве тест- объектов из "нормальных" для жизнедеятельности условий.

Таблица 3.5.Вопросы качества вод, решаемых методами биотетсирования

Объект биотестирования	Основные характеризуемые показатели	Параметры токсичности	Цель биотестирования	Тест-объекты
Химические вещества различной химической природы	· Выживаемость (гибель), · Динамика численности, · Плодовитость · Функциональные показатели, Тератологический, мутагенный эффект	Концентрации: · ЛК50, · ЛК100, · НДК, · ПДК, ОБУВ	· Предварительная оценка токсичных веществ, вводимых в природно-хозяйственный оборот. · Сравнительная оценка чувствительности и устойчивости различных гидробионтов к токсическим веществам и их сочетанием в комплексе. · Получение исходной информации для разработки рыбохозяйствен-ных и экологических ПДК (нормирование)	· Представитель-ные текст-объекты основных трофических уровней водных экосистем. · Стандартный набор биотестов
Сточные воды (производственные, технологические, бытовые).Точечные источники загрязнения. Аэротенки	Гибель	Кратность разбавления	· Оценка токсичности сточных вод и ее проявление в условиях взаимодействия с природными факторами среды · Оценка эффективности очистки: разработка ПДС; · Экологическая паспортизация предприятий	Набор биотестов (не менее трех)
Природные воды, испытывающие антропогенное воздействие (неточечные источники загрязнения), фоновые участки и объекты	· Выживаемость(гибель), · Динамика численности, Функциональные показатели.	· Острое токсическое действие (ОТД). · Хроническое токсическое действие (ХТД)	· Проверка соответствия качества воды установленным регламентом. · Оценка токсикологического состояния водных объектов. · Выявление зон экологического неблагополучия. · Получение "мониторинговой" информации об уровне токсичности загрязненности природных вод. · Выявление соответствия условий существования биологическим требованиям гидробионтов и установления опасности повышенных (пониженных) концентраций обычных факторов среды (рН, БПК и т.д.)	Набор биотестов (не менее трех)

3.8 Методическое обеспечение токсикологического контроля водных объектов методом биотестирования

В мировой практике для исследовательских целей используется более сотни различных методов биотестирования, однако для целей практического применения список используемых методов ограничен буквально несколькими. Основной принцип практического лабораторного биотестирования природных и сточных вод, реализуемый в развитых странах, - применение одновременно 3-4 методов с тест-организмами, представляющими разные трофические группы (бактерии, водоросли, беспозвоночные, рыбы).

В России при осуществлении экотоксикологического контроля предложено при первичном исследовании вод обязательно использовать не менее двух стандартных методов биотестирования с тест-организмами из разных систематических групп (бактерии или водоросли и беспозвоночные животные). После экспериментальной проверки и выбора, наиболее чувствительного к исследуемым водам тест-объекта для постоянного контроля используется один, проявивший наибольшую чувствительность к данной пробе, метод токсикологического контроля.

Методики биотестирования для целей контроля выбраны таким образом, чтобы использовать гидробионтов не только из разных трофических уровней, важных для водных экосистем, но и обладающих различной чувствительностью к разнообразным загрязнителям (см. Приложение 3).

При использовании нескольких тест-организмов для исследования одной и той же пробы воды возникает вопрос о сопоставимости полученных результатов. Очень часто можно получить данные с низким коэффициентом корреляции между результатами, полученными на разных тест-организмах. При использовании нескольких биотестов за окончательный результат степени токсичности исследуемой воды принимается тот, который получен при использовании тест-организмов, проявивших наибольшую чувствительность, в соответствии с принципом учета чувствительности наиболее слабого звена экологической системы.

В целях реализации закрепленной за Госкомэкологией РФ координирующей роли в области охраны окружающей природной среды [47] сформирована самостоятельная Система природоохранительной нормативной документации (ПНД) для целей экологического контроля объектов окружающей среды. В рамках этой деятельности подготовлены проекты основополагающих нормативных документов Системы, регламентирующие требования и правила формирования блока взаимоувязанных актуализированных природоохранных нормативных документов. С целью обеспечения единства измерений и достоверности аналитической информации в системе государственного надзора, контроля и экологического мониторинга в рамках системы ПНД создан "Государственный реестр методик количественного химического анализа и оценки состояния объектов окружающей среды, допущенных для государственных экологического контроля и мониторинга". Методам, включенным в реестр, присваивается статус национальных стандартов в области охраны окружающей среды.

При осуществлении экотоксикологического контроля допускается использование только тех методик биотестирования, которые внесены в Госреестр или пока они не внесены в Госреестр, - РД 118-02-90. Требования к внесенным в Госреестр методикам биотестирования таковы:

· изложены в соответствии с ГОСТ 8.010-90 ГСИ. "Методики выполнения измерений", с 1 июля 1997 г. в соответствии с требованиями ГОСТ Р.8.563-96 ГСИ. "Методики выполнения измерений";

· содержат свидетельство о метрологической аттестации, проведенной в соответствии с требованиями ГОСТ 8.505-84 "Метрологическая аттестация методик выполнения измерений содержаний компонентов проб веществ и материалов".

· согласованы в Главном управлении аналитического контроля и метрологического обеспечения природоохранной деятельности при Госкомэкологии РФ и Главным метрологом Госкомэкологии РФ и утверждены в Госкомэкологии РФ.

Методики, вносимые в Госреестр, относятся к категории федеральных природоохранных нормативных документов - ПНД Ф. Регистрационный номер методики в Госреестре состоит из номера комплекса системы ПНД, номера группы ПНД, порядкового номера государственной регистрации и двух последних цифр года утверждения МКХА. Обозначение методики вод: 14 - номер комплекса системы ПНД (для охраны поверхностных вод, включая методики анализа); номера группы ПНД (1 - сточные воды, 2 - поверхностные воды, 3 - подземные воды, 4 - питьевые воды). Символом Т перед номером системы ПНД отмечены токсикологические методы контроля. Символами СБ отмечены санитарно-биологические методы контролля (см. Приложение 3). Например, ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.1-96, 16.2:2.2.1-96. Методика допущена для целей экологического контроля вод (сточных, поверхностных, подземных, питьевых), почв, донных осадков. Поскольку в Госреестр включено еще явно недостаточное число методик биотестирования, для использования при осуществлении государственного и производственного экологического контроля качества природных и сточных вод допускаются методы биотестирования, изложенные в нормативном документе "Методическое руководство по биотестированию воды. РД 118-02-90. Данное руководство является нормативным документом как для природоохранных органов, так и для водопользователей. В качестве биотестов предлагается по данному РД использовать гидробионты различных систематических групп: водоросли - Scenedesmus quadricauda, Chlorella vulgaris; беспозвоночные - Daphnia magna, Ceriodaphnia affinis; рыбы - Poecilia reticulata Peters, Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan. Включенные в РД 118-02-90 методы допускаются для использования до внесения их в Госреестр. Методы биотестирования, рекомендованные для экологического контроля, приведены в табл. 3.6.

Таблица 3.6.Методы биотестирования, рекомендованные для экологического контроля

Метод биотестирования	Тест-организмы	Критерии токсичности	Области применения	Средства измерений
1	2	3	4	5
Определение токсичности воды по жизнедеяте-льности дафний	Daphnia magna	Смертность 50% за 96 ч (острая токсичность). Достоверное снижение плодовитости за 30 сут в сравнении с контролем (хроническая токсичность)	Поверхностные, природные пресные, сточные и очищенные сточные, грунтовые, питьевые воды	-
Определение токсичности воды по жизнедеятель-ности цериодаф-ний	Ceriodaphnia affinis	Смертность 50% за 48 ч (острая токсичность). Достоверное снижение плодовитости за 7 сут в сравнении с контролем (хроническая токсичность)	То же	-
Определение токсичности воды, почв и донных отложений по ферментативной активности бактерий	иофилизиро-ванные мутантные бактерии Escherichia coli	Изменение интенсивности окрашивания исследуемой среды	Поверхностные, природные пресные, сточные и очищенные сточные, грунтовые, питьевые воды, водные вытяжки из почвы и донных осадков	Комп-лект "Тохуkit"
Определение токсичности воды по ингибированию темпа роста водорослей	Chlorella vulgaris, Scenedesmus quadricauda	Изменение численности клеток водорослей за 96 ч экспозиции (острая токсичность). Изменение численности водорослей за 14 сут (хроническая токсичность)	Поверхностные, природные пресные, сточные и очищенные сточные воды	-
Определение токсичности воды по жизнедеятельнос-ти рыб	Роеciliа reticulata Peters или Brachyda- nio rerio Hamilton- Buchanan	Смертность 50% за 96 ч. Достоверное снижение плодовитости за 30 сут экспозиции	То же	-
Определение Токсичности воды по хемотаксической реакции инфузорий	Инфузории Paramecium caudatum	Хемотаксическая реакция (хемотаксис)	Поверхностные, Природные пресные, сточные и очищенные сточные, грунтовые, питьевые воды, водные вытяжки из почвы и донных осадков	Прибор "Биотестер"

Выбор метода биотестирования для применения в лабораторной практике является чрезвычайно важным как для лабораторий, начинающих выполнять токсикологические исследования, так и для лабораторий с многолетним опытом работы. Это связано с многочисленными объективными обстоятельствами, ограничивающими применение того или иного метода: условия культивирования, чувствительность к токсикантам и т.д. Наиболее универсальными тест-объектами по чувствительности, адекватности реагирования на различные токсиканты следует признать дафний и цериодафний. Именно эти объекты имеют самую долгую историю их использования для целей биотестирования, методы отработаны, а данных по чувствительности рачков к различным загрязняющим веществам накоплено достаточно много. Поэтому при появлении трудностей интерпретации плохо согласующихся между собой результатов биотестирования, полученных на разных тест-объектах, в первую очередь рассматривается вопрос о результатах дафниевого теста. Однако цериодафний и особенно дафний нельзя отнести к легко культивируемым в лабораторных условиях тест-объектам: они реагируют на присутствие в помещении паров различных химических веществ и их сложно культивировать в тех лабораториях, где выполняются химические анализы. Кроме того, при наличии в питьевой воде какого-либо фонового загрязнения (например, железа при использовании подземных вод) возникают трудности получения культивационной воды для дафний и цериодафний.

Культивирование водорослей - менее сложная процедура и требует только тщательного соблюдения условий культивирования. Водоросли в меньшей степени чувствительны к загрязненности воздуха, а культивирование их на средах, приготовленных на дистиллированной воде, не создает, как правило, проблем с качеством вод (см. Приложение 3). Однако данные, полученные на водорослях при биотестировании сточных, в некоторых случаях и природных вод, сложно интерпретировать из-за часто регистрируемого эффекта стимуляции, вызываемого наличием в исследуемых водах питательных веществ. Пятнадцатилетняя практика использования биотестирования в лабораториях, осуществляющих контроль за качеством окружающей среды, показала, что использование рыб в качестве тест-объектов - чрезвычайно трудоемкая, дорогостоящая и неоперативная процедура. При использовании рыб требуются большие объемы воды как для культивирования, так и для проведения экспериментов; данные, полученные на рыбах, плохо согласуются с результатами токсикологического контроля на других объектах, так как рыбы обладают более совершенной системой выведения ядов и, как правило, более устойчивы к воздействию токсикантов.

Определение токсичности вод, почв и донных отложений по ферментативной активности бактерий является наиболее доступным методом биотестирования для лабораторий, не обеспеченных удовлетворительными условиями. Метод требует простого разбавления сухих бактерий исследуемой водой, чрезвычайно оперативен и включен в реестр, поскольку применим в любых условиях, даже при отсутствии лабораторий, что важно для природопользователей, обязанных представлять информацию о токсичности вод, сбрасываемых в водоемы, не реже одного раза в квартал.

Метод с использованием светящихся бактерий (прибор "Биотоке") недостаточно отработан для целей широкого практического использования в экологическом контроле.

Результаты межлабораторной (в системе Госкомэкологии России) проверки прибора "Биотестер" с использованием в качестве тест-объекта инфузорий позволяют рекомендовать этот прибор как для широкого применения службами, осуществляющими государственный контроль, так и при осуществлении производственного контроля за качеством сточных и природных вод (см. Приложение 3).

Результаты биотестирования, какой бы методикой они не были получены должны сопровождаться результатами гидрохимических анализов качества исследуемой воды, не считая обязательно представляемых данных о температуре, содержании растворенного кислорода и рН измеряемых в процессе биотестирования.

В данной работе, для определения токсичности водных объктов использовались: тест-организм инфузория туфелька Paramecium Caudatum, тест-культура; водоросли хлорелла (chlorella vulgaris beijer); тест-объект Daphnia magna straus; тест-система - «Эколюм» (см. п.2.5., Приложеине 2).

3.9 Основные этапы метода биотестирования

Для получения надежной информации выделяют основные для всех мето-дов биотестирования этапы: общий (предварительный), специализированный и заключительный этапы и по рядок их соблюдения для методик биотестирования показан на рис. 3.4 и табл.3.7.

Общий этап (Предварительный). Используется методика в соответствии с областью ее применения. Корректность получения материала для биотестирования испытываемой пробы, включающая регламентацию способов отбора, хранения и подготовки проб для биотестирования.

Специализированный этап.

1.Стандартные условия содержания культуры тест-объекта на основе требований к тест-объектам. Полное название вида и точное указание систематической принадлежности (результаты биотестирования на одном виде не распространяются на другие виды, чувствительность к токсическому воздействию у разных видов существенно отличаются). Требования к тест-объектам включают:

· морфо-функциональные и возрастные показатели;

· способы получения;

· физико-химические условия, режим кормления содержания культуры тест-объекта (см. Приложеие 2).

Размещено на http://www.allbest.ru

Рис 3.4. Основные этапы метода биотестирования: 1 - Общий этап (Предварительный), 2 - Специализированный этап, 3 - Итоговый этап

2.Требования к чувствительности и точности методики биотестирования. Регламентации подлежат параметры, характеризующие чувствительность тест-объекта (порог чувствительности и диапазон реагирования), а также характеристики точности метода (сходимость и воспроизводимость результатов). Параметры чувствительности и точности устанавливают в ходе токсикологических экспериментов.

Порог чувствительности и диапазон реагирования тест-объкта определяется экспериментально с помощью эталонного токсиканта по величине того тест-параметра, который принят за критерий токсичности в биотесте.

Таблица 3.7.Основные этапы метода биотестирования

Общий этап	Специализированный этап:	Итоговый этап
Отбор и хране-ние проб	Стандарт-ные условия содержания культуры	Пригодность тест-объекта	Стандартные условия проведения биотестирова-ния	Регистра-ция тест-показателя	Выбор контроля	Оценка результатов
	Температура	Синхронии-зация	Уравнивание температуры пробы и лабораторной культуры	Визуально	Фоновый створ	Математичес-кая обработка
	Кислород	Калибровка по эталонному токсиканту	Дополнительная информация о О2,рН, жесткости исследуемой пробы воды	Приборами	Водопроводная вода	Шкала оценки токсичности
	pH		Кормление	Временной интервал		Способ выражения результатов
	Корм

3.Пригодность тест-объекта к биологическому анализу. В биотестировании используется синхронизированные культуры.

4.Характеристика точности биотеста - определения нормативных метрологических характеристик, т.е. гарантируемых значений показателей точности методики, выполняемой при всех допускаемых вариациях влияющих факторов и характеризующих точность любого результата биотестирования, который может быть получен по данной методике при ее строгом соблюдении. Нормы точности устанавливают в ходе токсикологических экспериментов, проводимых в одной (сходимости) или нескольких лабораториях (воспроизводимости) (см. Приложение 4, 5).

5.Требования к процедуре выполнения методики биотестирования, включающие требования к числу повторностей, емкостям для биотестирования, объему воды и плотности посадки тест-объектов, соблюдение оптимальных условий жизнедеятельности тест-объектов (температура, концентрация растворенного кислорода, жесткость воды, рН), содержанию взвешенных веществ в испытываемой воде, и др.

6.Требования к регламентации факторов, влияющих на точность результатов. Задачей является определение допустимых колебаний значений факторов среды и условий выполнения биотеста, соблюдение которых считать результаты правильными. Допустимый количественный диапазон колебаний факторов среды и условий биотестирования устанавливают по данным литературы и исследованиям разработчиков методики о биологических особенностях тест-объекта используемого в опыте (см. Приложение 3).

7.Точная формулировка принципа методики и четкое описание тест-показателей, приемов их регистрации, критериев токсичности, временного интервала наблюдений. Учет тест-показателей проводится визуально или с помощью приборов. Особенно важным является соблюдение срока экспозиции и временного интервала учета тест-показателей.

8.Обязательное использование двух контрольных серий: например, вода из условно чистого (фонового) участка, профильтрованная через планктонный газ высоких номеров, и дехлорированная водопроводная вода местного региона [55] (см. Приложение 1, 3).

Итоговый этап.

В зависимости от задач исследования и используемых биотестов результаты токсического загрязнения оценивают по-разному. Токсическое загрязнение водных объектов методами биотестирования проводят экспертным путем и характеризуют следующим образом:

· "острое" и "хроническое токсическое действие"

· "острое", "подострое" и "хроническое токсическое действие" для биотестов на микрозоопланктоне, выявляемое при биотестировании [55].

В случае высокой токсичности в качестве признака для ранжирования токсичности используют коэффициент разбавления: величина разбавления, устраняющая токсичность (см. Приложение 1). В случае нерезко выраженной токсичности необходима статистическая доказательность результатов биотестирования. Биометрическую обработку результатов биотестирования проводят с помощью приемов, применяемых в водной токсикологии (см. Приложение 3).

1.Оценка результатов биотестирования, включающая либо статистическую обработку, либо оценку по шкалам токсичности (см. Приложение 2).

2.Способ выражения результатов - словесное выражение степени токсического действия от острого до хронического.

3.Требования к документации, представляемой по результатам биотестирования, обеспечивающей возможность контроля качества информации.

Сопоставление данных биотестирования с установленным нормативом [49] позволяет выявить возможные нарушения норм качества вод по токсикологическим показателям. Частота обнаружения нарушений и степень токсичности могут быть использованы для выявления территорий экологического неблагополучия: напряженной экологической ситуации, зон экологического кризиса и экологического бедствия, методика анализа экологического неблагополучия по токсикологическим показателям в настоящее время находится в стадии доработки [55].

Результаты биотестирования водных объектов включают следующие материалы:

· характеристику пробы отобранной воды и условия отбора;

· результаты биотестирования пробы по каждому из использованных биотестов;

· общее экспертное заключение о токсичности пробы по набору биотестов.

3.10 Основные подходы биотестирования

Для того чтобы быть пригодными для решения комплекса современных задач, методы биотестирования, используемые для оценки среды, должны соответствовать следующим требованиям:

· быть применимыми для оценки любых экологических изменений среды обитания живых организмов;

· характеризовать наиболее общие и важные параметры жизнедеятельности биоты;

· быть достаточно чувствительными для выявления даже начальных обратимых экологических изменений;

· быть адекватными для любого вида живых существ и любого типа воздействия;

· быть удобными не только для лабораторного моделирования, но также и для исследований в природе;

· быть достаточно простыми и не дорогостоящими для широкого использования.

Одним из наиболее важных требований при оценке состояния среды является чувствительность применяемых методов. Потребность в таких методах особенно возрастает в настоящее время, когда в силу повышенного внимания к проблемам охраны природы и в связи с развитием природоохранных мероприятий становится необходимым оценивать не только и не столько существенные, как правило, уже необратимые изменения в среде, но первоначальные незначительные отклонения, когда еще возможно вернуть систему в прежнее нормальное состояние (см. Приложение 1). Рассмотрим используемые методы в биотестирование (см. рис.3.5.).

Размещено на http://www.allbest.ru

Рис.3.5. Основные методы биотестирования

3.10.1 Генетический метод

Наличие и степень проявления генетических изменений характеризует мутагенную активность среды, а возможность сохранения генетических изменений в популяциях отражает эффективность функционирования иммунной системы организмов.

В норме большинство генетических нарушений распознаются и элиминируются клеткой, например путем апоптоза за счет внутриклеточных систем или посредством иммунной системы.

Достоверное превышение спонтанного уровня таких нарушений является индикатором стресса. Генетические изменения могут выявляться на генном, хромосомном и геномном уровнях.

Принято выделять следующие типы мутаций. Генные, или точковые, - их делят на две группы: замены оснований в ДНК и вставки или выпадения нуклеотидов, приводящие к сдвигу рамки считывания генетического кода. Генные мутации делят также на прямые и обратные (реверсии). Мутации типа сдвига рамки считывания значительно менее склонны к спонтанным реверсиям, чем мутации типа замен оснований. Хромосомные перестройки (аберрации) заключаются в различных нарушениях структуры хромосом. Геномные мутации - изменение количества хромосом в ядре.

Для выявления канцерогенов и мутагенов применяются краткосрочные генетические тесты.

Исследования такого рода могут длиться в течение двух или трех лет и требуют дефицитных реактивов и высококвалифицированных специалистов. Это обстоятельство привело к поиску альтернативных путей выявления химических веществ, обладающих канцерогенными свойствами, в результате чего был разработан ряд сравнительно недорогих тестов, во многих из которых вместо цельного организма млекопитающих используются другие биологические системы. Поскольку на проведение тестов уходит значительно меньше времени, чем на классические долгосрочные исследования на грызунах, их стали называть краткосрочными тестами.

Почти все краткосрочные методы, позволяющие получить результаты в течение максимум нескольких недель, основаны на демонстрации хромосомных повреждений, генных мутаций или повреждения ДНК, при этом многие из них являются тестами «in vitro» (т.е. проводятся на экспериментальных биологических системах без использования целостных живых организмов). В этих тестах применяется очень широкий спектр организмов - от бактерий и дрожжей до насекомых, растений и культивируемых клеток млекопитающих. Существуют также краткосрочные тесты, в которых лабораторные животные подвергаются воздействию изучаемого химического вещества на протяжении периодов от нескольких часов до недель.

В литературе описано более сотни тест-систем для исследования генотоксичности, охватывающих различные организации живого - от бактериофага до млекопитающих, регулярно применяются менее 20 из них, а некоторые доступны лишь в специализированных лабораториях.

Чаще всего для выявления мутагенных химических веществ применяются тесты с использованием бактерий; эта группа тестов в целом и наиболее апробирована.

В отличие от эукариотических организмов, у которых ДНК организована в сложные хромосомные структуры, у бактерий присутствует лишь одна кольцевая молекула ДНК, которая легкодоступна для химических веществ, проникающих сквозь клеточную стенку. Бактериальные госты имеют также то преимущество, что в одном опыте может быть получена популяция, состоящая из многих миллионов клеток с относительно коротким периодом размножения. В классическом варианте используются штаммы бактерии, уже имеющие мутации по определенным генам.

Мутации, индуцированные тестируемым веществом, так называемые обратные мутации, выявляются в результате роста таких «ревертантных» бактерий с образованием колоний в соответствующей селективной среде. Бактериальные тесты могут быть использованы для выявления мутагенных метаболитов в биологических жидкостях (например, в моче, цельной крови, плазме) животных или людей, подвергшихся воздействию химических факторов.

На основе штаммов сальмонеллы были созданы полуколичественные и количественные тесты для оценки мутагенной активности. Количественные тесты целесообразно использовать в целях определения частоты мутаций, а также в тех случаях, когда исследуемые вещества являются высокотоксичными и вызывают гибель большей части клеток тест-объекта. Поэтому наиболее широкое распространение получил ставший классическим полуколичественный тест Эймса с метаболической активацией in vitro (или, как его иногда еще называют, тест Эймса сальмонелла/микросомы).

Химические вещества можно оценить в отношении их способности индуцировать хромосомные повреждения у растений, насекомых и млекопитающих. Для млекопитающих обычной тест-системой является культура клеток, можно использовать какую-либо перевиваемую клеточную линию или культуру лимфоцитов человека.

Для изучения повреждения хромосом «in vivo» хорошо разработан метод анализа метафазных хромосом в клетках костного мозга крыс, мышей или хомячков. Кроме того, хромосомные фрагменты в некоторых клетках костного мозга и других тканей можно идентифицировать в виде микроядер: так называемый микроядерный тест зарекомендовал себя как сравнительно простой метод выявления химических веществ, способных индуцировать хромосомные повреждения.

Благодаря огромным успехам, достигнутым в области применения в генетической токсикологии тестов с использованием микроорганизмов и клеток млекопитающих, растительные объекты стали применяться в таких исследованииях значительно реже, чем раньше.

Однако некоторые растения, например конские бобы (Vicia faba), лук (Allium сера), традесканция (Tradescantia paludosa), кукуруза (Zea mays), ячмень (Hordeum vulgare), соя (Glycine max), могут обладать существенными преимуществами по сравнению с другими тест-системами, в частности при скрининге химических веществ на мутагенность (их роль до конца пока не выяснена).

Исследование генетических изменений как на генном, так и на хромосомном уровне можно проводить на растениях без использования сложного лабораторного оборудования, необходимого для постановки других тестов, что при некоторых обстоятельствах может оказаться большим преимуществом.

Возможным недостатком этих тестов является существенное различие метаболизма растений и млекопитающих.

Следовательно, в настоящее время еще рано ставить вопрос о возможности достоверной экстраполяции на человека результатов, полученных в экспериментах на растениях.

3.10.2 Биофизический метод

Биофизические методы основаны на инструментальном определении нарушений биохимических и биофизических процессов тест-организмов. Одни из них регистрируют изменения функций мембранных структур клеток, другие оценивают показатели электропроводности тканей, третьи - способность генерировать электрические потенциалы и т.д.

Для контроля состояния важнейших функциональных систем организмов наибольшее распространение получили люминесцентные и флуориметрические методы. Они обладают высокой чувствительностью, позволяют проводить количественные измерения в режиме реального времени, а в ряде случаев и автоматизировать процесс измерения. Люминесцентные и флуориметрические методы в ряде случаев дают возможность не только экспрессно тестировать качество среды, но и проводить, например, детальный анализ состояния фитопланктонного сообщества, а также прогнозировать его развитие. Высокая скорость измерения позволяет анализировать получаемую информацию непосредственно по ходу экспедиционных работ и вносить коррективы в планы исследования. Комплексное использование люменометрической и флуорометрической аппаратуры могут дать информацию о пространственно-временной изменчивости биофизических и физиологических процессов, определяющих нормальное функционирование биосистем, а также могут служить составной частью системы экологического мониторинга.

Для оценки фотосинтетической активности фототрофов в лабораторных и полевых условиях используют: компактный погружной импульсный флуориметр, который позволяет проводить зондирование параметров флуоресценции с одновременной регистрацией температуры и подводной освещенности на всех глубинах фотического слоя, где освещенность достаточна для протекания реакций фотосинтеза (см. Приложение 1). Математическая обработка данных ведется в автоматическом режиме с использованием стандартных процедур в программе Statistica.

Подобные зонды могут быть рекомендованы для изучения динамики токсичности водоемов, а также для быстрой оценки реакций природных популяций фитопланктона на различные антропогенные и природные воздействия в акваториях со сложным гидрологическим режимом.

Прибор для оценки биолюминесценции: в России наибольшее распространение получила тест-система «Эколюм», разработанная в лаборатории антибиотиков кафедры микробиологии биологического факультета МГУ под руководством доктора биологических наук В. С.Данилова. Мониторинг окружающей среды с применением биосенсора «Эколюм» и соответствующей аппаратуры ориентирован на использование реактивов и сервисных приспособлений отечественного производства.

Тест-система «Эколюм» может с успехом применяться при экспрессном контроле за отходами и сбросами промышленных предприятий; контроле технологических процессов в режиме реального времени; постоянном мониторинге питьевой воды, водоемов, почв и воздуха на содержание токсических веществ; определении уровня токсичности новой продукции; контроле за токсическим эффектом фармацевтических материалов и лекарственных веществ; контроле качества и безопасности продуктов питания; оценке профвредности рабочих мест на предприятиях (см. Приложение 1, 2).

3.10.3 Биохимический метод

Стрессовое воздействие среды можно оценивать по эффективности биохимических реакций, уровню ферментативной активности и накоплению определенных продуктов обмена. Изменения содержания в организме определенных биохимических соединений, показателей базовых биохимических процессов и структуры ДНК в результате биохимических реакций могут обеспечить необходимую информацию о реакции организма в ответ на стрессовое воздействие.

1. Измерение адаптационного стресса: каждый физиологический процесс требует определенных затрат энергии, поэтому любое изменение физиологического состояния немедленно сказывается на энергетическом обмене.

Биоэнергетические показатели живых систем позволяют выявлять последствия стрессового воздействия среды до наступления необратимых изменений в организме.

Количество энергии, необходимое организму в единицу времени для обеспечения всех физиологических процессов, характеризует интенсивность энергетического обмена. На реализацию одного и того же физиологического процесса в неблагоприятных условиях организму требуется больше энергии, чем в оптимальных, из-за необходимости компенсации неблагоприятных воздействий среды.

В процессе жизнедеятельности всех аэробных организмов в ходе нормальных реакций кислородного метаболизма образуются свободные радикалы (СР) супероксид и другие формы активного кислорода. В норме уровень СР регулируется системой антиоксидантной защиты клетки, так как эти радикалы и продукты их превращения представляют серьезную угрозу: подавляют активность ферментов, разрушают нуклеиновые кислоты, вызывают деградацию биополимеров, изменяют проницаемость мембран. Высокий уровень образования супероксидных радикалов токсичен и может вызвать гибель организма. Уровень их образования, слегка превышающий базовый, может стимулировать рост клеток и играет важную роль в процессе канцерогенеза. Одним из универсальных механизмов стресса является развитие окислительных СР-реакций. Под действием окислительного стресса может происходить повреждение ДНК. Один из механизмов такого повреждения включает прямое окисление нуклеиновых кислот, другой - переваривание ДНК. Образование супероксидных радикалов увеличивается при разных видах облучений, изменении парциального давления кислорода под влиянием ксенобиотиков и при других воздействиях.

Стрессовая реакция биотестов может быть измерена по изменению в них уровня свободных радикалов по сравнению с контролем. Известно, что быстрые изменения интенсивности СР-реакций в живых объектах типичны для начальных стадий разных патологических состояний, в том числе для первичных процессов лучевого поражения.

2. Исследование ферментативной активности почвенного микроценоза: различные виды антропогенного воздействия на почву может изменять условия существования почвенных микроорганизмов, нарушать нормальное протекание в почвах процессов микробной трансформации и, следовательно, отражаются на процессах трансформации веществ в биосфере.

Почвенные микроорганизмы участвуют в циклах жизненно-важных элементов, таких как N, Р, S, Fe, Mn и др.

Им принадлежит роль в очистке ниосферы от загрязнений, так как микроорганизмы обладают высокой способностью к адаптации и могут быстро трансформировать загрязняющие вещества, как естественные для биосферы, так и чужеродные.

Изучение сукцессии и особенностей функционирования микробных комплексов в техногенных экосистемах представляет большой научный и практический интерес. Такие экосистемы могут служить моделью для исследования скорости и направления микробиологических и биохимических процессов.

Методы энзимологии широко применяются при решении экологических задач. Они позволяют оценить биохимическую активность почвенного микроценоза. Ферменты, выделяемые микроорганизмами в результате их жизнедеятельности, способны иммобилизоваться и накапливаться в почве в активном состоянии и в соответствующих условиях проявлять специфические биокаталитические функции.

К настоящему времени разработаны методы определения активности большого количества ферментов, участвующих в разнообразных почвенных биохимических процессах.

3.10.4 Иммунологический метод

Иммунологический подход при оценке состояния окружающей среды заключается в изучении изменений врожденного и приобретенного иммунитета у беспозвоночных и позвоночных животных.

Предлагается использовать параметры иммунитета животных как критерий состояния организмов, их популяций и сообществ экосистем в норме и при техногенном воздействии. Разрабатываются технологии производства новых антимикробных и иммунотерапевтических препаратов на основе иммуномодулирующих веществ, выделенных из клеток и биологических жидкостей гидробионтов.

Широко изучаются реакции врожденного иммунитета рыб, иглокожих, ракообразных, моллюсков, насекомых, червей. Показано, что врожденный иммунитет низших позвоночных и беспозвоночных животных во многом подобен таковому у млекопитающих и представляет собой совокупность реакций неспецифической антимикробной защиты, которая действует практически без латентного периода, с высокой эффективностью и избирательностью распознавания «своего» и «чужого».

Исследование параметров иммунологического статуса водных животных (рыб, моллюсков, морских звезд) в зависимости изменений условий среды обитания, развития заболеваний или антигенного воздействия показало увеличение количества макрофагоподобных клеток, концентрации лизоцима и, как следствие, появление в жидкостях организмов новых цитотоксических белков и антимикробных пептидов.

3.10.5 Морфологический метод

Воздействие на организм стрессирующих факторов приводит к отклонениям от нормального строения различных морфологических признаков. Процессы воспроизведения организмов - это сложная цепь взаимообусловленных событий, любое из звеньев которой может быть нарушено воздействием токсичной среды.

Для диагностики воздействия загрязнений на морфологические характеристики применяются методы оценки флуктуирующей асимметрии.

При работе с биологическими объектами в настоящее время используется классификация асимметрий (нарушения симметрии) по Л. Ван Валену (Van Valen, 1962), согласно которой они подразделяются на три типа:

1)направленная асимметрия, когда какая-то структура развита на одной стороне больше, чем на другой;

2)антиасимметрия - большее развитие структуры на одной из сторон

3)флуктуирующая асимметрия - незначительные ненаправленные отклонения.

Флуктуирующая асимметрия является результатом неспособности организмов развиваться по точно определенному плану. Флуктуирующая асимметрия может быть охарактеризована как одно из наиболее обычных и доступных для анализа проявлений случайной изменчивости развития.

Возможность использования асимметрии показана многими авторами, которые доказали на примере различных видов растений и животных, что величина асимметрии реагирует на различные стрессоры антропогенного характера и может являться мерой нарушения развития организма. Флуктуирующая асимметрия - это один из общих онтогенетических показателей, характеризующий стабильность индивидуального развития, дающий оценку состояния природных популяций и зависящий от состояния среды (см. Приложение 2).

3.10.6 Физиологический метод

Одна из наиболее важных характеристик, высокочувствительная к стрессовому воздействию среды, - энергетика физиологических процессов. Наиболее экономичный энергетический обмен имеет место лишь при строго определенных условиях среды, которые могут быть охарактеризованы как оптимальные. Интенсивность энергетического обмена аэробного организма может быть определена посредством измерения скорости потребления кислорода. При оптимальных условиях организм находится на самом низком энергетическом уровне, при любых негативных изменениях среды обитания потребность в кислороде будет увеличиваться.

Для характеристики энергетического обмена две величины являются фундаментальными: основной обмен и максимальный обмен. Основной обмен отражает минимальный уровень потребления энергии, необходимый для обеспечения нормального функционирования организма при отсутствии каких-либо внешних воздействий. Максимальный обмен соответствует предельному количеству энергии, которое организм способен выработать в случае необходимости. Разность между этими величинами представляет энергетический ресурс адаптации конкретного вида животных, поскольку основной и максимальный уровни обмена являются видоспецифическими величинами.

Другая базовая характеристика, перспективная для оценки стрессовых воздействий, - темп и ритмика ростовых процессов.

Важной характеристикой физиологических процессов является поведенческая активность живых организмов.

В качестве тест-функций применяются физиологические параметры пресноводных беспозвоночных гидробионтов разных уровней филогенеза.

Свойства внешней среды, и в частности гидросферы, проявляются в интенсивности воздействия на организм или популяцию отдельных факторов или их комбинаций. Вещества, поступающие в водоем антропогенным путем, могут оказывать регулирующее, трофическое, токсическое и информативное воздействие на гидробионты. При незначительных концентрациях в водоеме эти вещества можно выявить, оценивая физиологический статус гомеостатических показателей организма, которые могут изменяться при сдвигах в окружающей среде.

Вопрос о роли поведения в иерархии индикационных показателей состояния окружающей среды поднимали в своих работах такие ученые, как Н.С. Строганов, А.Д. Слоним, Б.А, Флёров, Л.П. Брагинский, Н.А. Тушмалова. Степень отклонения от стандартных поведенческих реакций животных служит одним из первичных, регистрируемых на визуальном уровне сигналов изменений в окружающей среде и может быть отнесена к реакциям «первого ранга».

Наибольший интерес представляют типы поведения, относящиеся к эволюционно-универсальным реакциям, свойственным всем эукариотам, включая человека. К таким феноменам относятся спонтанная двигательная активность как врожденная форма поведения и память - приобретенная форма поведения.

В опытах на инфузориях показателями исходного функционального состояния служили объективно регистрируемые реакции: спонтанная двигательная активность, уровень спонтанных сокращений, уровень пищевой возбудимости, состояние ядерного аппарата. Была продемонстрирована применимость основных физиологических показателей, используемых в опытах на позвоночных животных, для определения функционального состояния организмов, лишенных нервной системы. Исследования поведенческих реакций в ответ на внешнее воздействие проводились на пресноводной гидре Hydra attenuate, имеющей примитивную нервную систему. Оценивались реакции привыкания к раздражителю, при этом критерием выработки привыкания служило сокращение щупалец гидры. В экспериментах на плоских червях планариях Polycelis nigra, Euplanaria gonocephala, Dugesia tigrina были изучены основные реакции гидробионтов на экологически значимые раздражители. В дальнейшем для оценки качества водной среды стал успешно применяться метод выработки условных рефлексов у планарий.

Целостное поведение животных рассматривается как лабильное взаимодействие врожденных и приобретенных элементарных реакций, необходимое для быстрой и эффективной адаптации к условиям среды. Изучение поведения сложно и требует тщательных наблюдений в природе, подкрепленных лабораторными экспериментами.

Таким образом, поведение является эволюционно обусловленным показателем физиологического состояния животного. На основании изменений в поведенческих феноменах одного вида животных можно прогнозировать нарушения поведения и других видов. Выбор форм поведения для биотестирования определяется их чувствительностью к изменениям, происходящим в окружающей среде.

3.10.7 Хемотаксический метод

Хемотаксический метод - применен для количественного определения степени токсичности. Для исследований используется хемотаксическая методика с использованием инфузорий Paramecium Сaudatum. В основу метода положена реакция хемотаксиса тест-объекта против градиента концентрации загрязняющих веществ (см. Приложение 2). Хемотаксическая реакция является наиболее перспективной из быстрых тест-реакций. Приведем некоторые из многочисленных преимуществ её использования.

· Взаимодействие химического вещества с рецепторами происходит на уровне отдельных молекул, двигательные функции организма меняются тогда, когда ещё не затронуты внутриклеточные процессы, поэтому чувствительность этой реакции на несколько порядков выше, чем тех реакций, которые связаны с изменением жизненно важных функций клетки;

· Скорость реакции биосистема + химикат, равна нескольким минутам, а некоторых случаях секундам;

· Хемотаксис имеет как положительное так и отрицательное направление, а не просто уменьшение или увеличение реакции4

· В отличие от других тест-реакций, которые связаны с изменением параметров окружающей среды хемотаксис появляется только в присутствии химиката не присущего данной среде обитания микроорганизма;

· Изменение величины хемотаксиса легко регистрируется приборными методами;

· Факторы влияющие на хемотаксическую реакцию.

На величину ответной реакции биообъекта могут влиять многие внешние условия. К таким общим факторам, меняющим характер взаимодействия биосистемы и химиката, можно отнести:

1. плотность популяции микроорганизмов;

2. адаптацию;

3. температуру;

4. рН;

5. форму введения токсиканта;

6. окислительно-восстановительный потенциал среды;

7. жесткость воды;

8. фазу развития культуры;

9. освещенность и др.

3.11 Практическое применение методов биотестирования

Среди возможностей применения методов биотестирования следует отметить их пригодность в мониторинге районов с интенсивным развитием промышленности и сельского хозяйства. Кроме того, биотестирование позволяет:

· констатировать факт наличия токсичности воды (т.е. опасности ее для жизни водоема);

· оценить, до какой степени необходимо снизить содержание загрязняющих веществ, чтобы полностью предотвратить или уменьшить пагубные последствия загрязнения;

· оказать помощь в открытии многих токсических веществ в сточных водах, состав которых известен еще не полностью;

· обнаружить возможный источник определенного вещества в сточных водах, подаваемых на очистные сооружения с различных предприятий (после проведения селективного контроля).

Перечисленные возможности биотестирования позволяют определить следующие области его применения:

· токсикологическая оценка качества природных вод;

· мониторинг питьевой воды, водоемов, почв и донных осадков на содержание токсических веществ;

· плановый контроль выпусков сточных вод, а также оценка их влияния на качество воды в контрольных створах;

· корректировка расчетов ПДС загрязняющих веществ с учетом выявленной токсичности сточных вод, сбрасываемых в водоем;

· объективная оценка соответствия условно-чистых вод данной категории;

· оперативный контроль сточных вод, поступающих на биологическую очистку с целью обеспечения нормального функционирования активного ила и своевременного выполнения профилактических мероприятий при аварийных сбросах сточных вод промышленных предприятий;

· контроль сточных вод в точках поступления их в канализацию от предприятий;

· сравнительная оценка токсичности отдельных ингредиентов, входящих в состав сточных вод, с целью выявления максимально опасных токсикантов;

· селективная оценка токсичности сточных вод в зонах их образования (от каждой установки, цеха, технологического цикла и т.д.) для обоснования необходимости локальной очистки;

· проведение экологической экспертизы новых технологий и материалов, проектов очистных сооружений, реконструкции и технического перевооружения промышленных предприятий;

· экспресс-контроль за промышленными отходами предприятий;

· контроль за использованием токсичных материалов и лекарственных веществ;

· контроль качества продуктов питания.

Во многих странах биотестирование стало обязательным элементом определения качества среды. Биотестовые методы и аппаратура для их реализации разрабатываются и применяются в Англии, Франции, Швеции, Германии, США.

контроль экология вода качество биоиндикация

4.Анализ результатов исследований качества воды за 2005-2008гг

В данной работе, для определения токсичности водных объектов использовались методы биотестирования:

Метод с использованием морфофизиологических реакций тест-объекта инфузории туфельки Paramecium Caudatum (Капельный метод).

· Хемотаксический метод c использованием тест-объекта инфузории-туфельки Paramecium Сaudatum.

· Метод определения по изменению оптической плотности культуры- водоросли хлорелла (Сhlorella vulgaris beijer).

· Метод определения токсичности по смертности тест-объекта (Daphnia magna straus).