Характеристика некоторых представителей углеводородокисляющей микрофлоры Усинского нефтяного месторождения

Характеристика некоторых представителей углеводородокисляющей микрофлоры Усинского нефтяного месторождения

При разложении органических загрязнений, попадающих в окружающую среду, ведущая роль принадлежит микроорганизмам. Основными объектами наших исследований были нефтезагрязненные почвы и микрофлора Усиниского нефтяного месторождения. В течение ряда лет мы проводили сравнительный анализ состава и численности микрофлоры нефте-загрязненных почв на разных сроках загрязнения. Для свежезагрязненных почв характерна высокая численность почвенных микроорганизмов (общий титр КОИ в почве 3-8-10^6-7), преобладание группы аммонификаторов над другими трофическими группами, представленной мелкими однообразными бесцветными колониями бактерий родов Pseudomonas и Arthrobacter (табл. 1). Пигментированные колонии рода Rhodococcus, характеризующиеся, как правило, высокой степенью ферментативной активности [1, 2], - единичны. В отличие от свежезагрязненной почвы на более поздних срезках после загрязнения нефтью в почвах увеличивается численность групп олиготрофной микрофлоры, олигонитрофилов и целлюлозоразрушающих микроорганизмов. Общая численность остается по-прежнему высокой (10 ^6-7), Преобладающими видами среди бактерий являются представители родов Rhodococcus и Pseudomonas, относительно высока численность родов Arthrobacter, Flavobacterium, Agrobacterium. Отмечено присутствие грибов родов Mucor, Penicillium и Trichoderma (встречающихся также и в незагрязненной почве).

Таблица 1

Представители доминирующих родов микроорганизмов в нефтезагрязненных и незагрязненных почвах Усинского района

* преобладающие по численности представители почвенной микрофлоры

Фоновые почвы отличаются от загрязненных нефтью не только более богатым видовым составом (табл. 1), но и меньшей численностью. Преобладающими по численности в них были виды родов Criptococcus, Bacillus, Arthrobacter, Chrisosporium, Rhodotorula (численность более 10⁵ клеток/1 г в.с.п.). Многочисленны (численность около 10⁴ клеток в 1 г в.с.п.) представители родов Mycobaclerium, Penicillium, Candida, Mucor, Clostridium. Также в фоновых почвах представлены и углеводородокисляющие виды родов Pseudomonas и Rhodococcus, но они не являются доминирующими, по сравнению с загрязненными нефтью почвами (численность не превышает 1000 клеток на 1 г в.с.п.).

Таким образом, при нефтяном загрязнении в почвах происходит резкое увеличение численности микрофлоры узкоспециализированных групп бактерий, подавление большинства аборигенных видов, в том числе и микроскопических грибов. Высокая численность почвенных бактерий и бедный их видовой состав сохраняются в условиях Севера на протяжении трех-пяти лет после нефтяного загрязнения, что совпадает с периодом очищения почвы от подвижных (растворимых и летучих) углеводородов. Последующее очищение почв от нефти происходит с участием различных видов, таких, которые обладают либо выраженной углеводородокисляющей активностью или выделяют в окружающую среду биологически активные вещества (виды с высокой степенью ферментативной активности), либо участвуют в процессах трансформации промежуточных соединений или резистентны к присутствию остаточных углеводородов.

Дальнейшее исследование было сосредоточено на нескольких направлениях. Одним из них стало изучение физиолого-биохимических свойств углеводородокисляющей бактериальной микрофлоры нефтезагрязненных почв Усинского района, с целью составления коллекции культур алканотрофной психрофильной микрофлоры. Выделенные в чистую культуру виды (табл. 2) стали основой для создания препарата МУС-1, предназначенного для активизации разложения нефти в почвах Усинского района. Ими являются Ahrtrobacter sp., Pseudomonas alcaligenes, Rhodococcus erythropolis, Flavobactenuin barbe и Agrobuctenum sp.

Таблица 2

Основные физиолого-биохимические характеристики изучаемых культур

Примечание. Знаки (+++) обозначают обильный рост; (++) -- средний рост; (+) -- слабый рост ; (--) --отсутствие роста; на МПБ: "К" -- кольцо; "М" -- муть; "МСЛ" -- слабое помутнение; "О" -- осадок.

Все изучаемые виды (табл. 2) способны активно развиваться в присутствии как аммонийного (КАА), так и нитратного азота на среде Чапека. Денитрифицирующей способностью обладают все перечисленные виды, кроме флавобактерий. Характерной особенностью выделенных бактерий рода Pseudomonas является способность восстанавливать нитраты (NО₃) до газообразного азота (N₂).Bce это свидетельствуют о том, что типичные для нефтезагрязненных почв Усинского месторождения микроорганизмы способны развиваться как в аэробных, так и в частично анаэробных условиях, в последнем случае переходить на нитратное дыхание. Это важно с точки зрения условий, в которых развиваются процессы самоочищения почв после воздействия нефтяных загрязнений. Речь идет об одном из следствий нефтяного загрязнения - ухудшении воздушных условий в почве, что является важной причиной ингибирования жизнедеятельности микроорганизмов. Способность к нитратному дыханию в этом случае является одним из способов приспособления к неблагоприятным условиям. На МПБ активность культур менее высокая, чем на КАА и среде Чапека. Существенно она снижается на МПБ в присутствии NaCI. Рост на средах с глюкозой и сахарозой существенно не различается. Все это позволяет отнести данные виды к группе аммонификаторов-гетеротрофов.

Известно, что многие углеводородокисляющие микроорганизмы могут стимулировать уреазную активность почвы. Этот показатель используется часто для оценки экологического состояния нефте-загрязненных почв, для которых характерно увеличение уреазы на 15-25% по сравнению с незагрязненными почвами. Среди изучаемых культур оксидазную активность проявляли только представитель рода Pseudomonas. Уреазную активность проявляли все культуры, кроме псевдомонад, наиболее заметно эти показатели были выражены у Rhodococcus.

Изучение роста чистых культур и комплекса видов из этих культур на сырой нефти показало, что каждый из представленных видов способен изменять качественные характеристики сырой нефти за счет деструкции отдельных ее составляющих. Деструкция углеводородной фракции отдельными культурами была незначительна и составила от 7 (Rhodococcus erythropolis) до 16 (Agrobactenum radiobacter) процентов по сравнению с контролем (табл. 3).

Деструкция н-алканов отдельными культурами также отличается. В культуре Rhodococcus erythropolis произошло уменьшение массовой доли соединений с длиной цепи С_16-18, С_22-24, С_26-31. (рис. 1), с образованием промежуточных соединений с длиной цепи С_11-14. Под воздействием Pseudomonas alcaligenes н-алканы подверглись заметному разложению в диапазоне от С₁₄ до С₃₀, (рис. 1). При этом масса углеводородов с длиной цепи менее 10 атомов углерода заметно увеличилась, что свидетельствовало о возрастании в составе остаточной нефти доли углеводородов с низким молекулярным весом (табл. 3). В варианте с культурой Flavobacterium barbe наблюдалось более заметное, чем в предыдущих культурах, изменение хроматографического рисунка н-алканов, характеризующееся снижением массовой доли соединений с длиной цепи С_14-21 и увеличением доли соединений в диапазоне С₂₅ и С₃₀ (рис. 2), по-видимому, за счет разложения более сложных углеводородов и длиной цепи С_17-30 происходило заметное увеличение доли соединений от С₁₃ до С₁₅ (рис. 2). При этом увеличился и вес легких углеводородов (табл. 3). Agrobacterium radiobacter способствовал относительно резкому, по сравнению с рассмотренными выше культурами снижению доли тяжелых парафинов с длиной цепи более С₂₂. (рис. 3).

Таблица 3

Изменение массы отдельных фракций нефти под влиянием изучаемых культур

Эффективность разложения нефти в комплексе превышала суммарный эффект монокультур и составляла 73-75%, при этом доля в составе нефти гетероциклических соединений снижалась на 60%, углеводородов - на 75-76% (табл. 3). Разложение алканов произошло по всему спектру соединений, в том числе и высокомолекулярных. Очевидно, что такое резкое отличие углеводородокисляющей активности комплекса по сравнению с монокультурами связано с трофическим взаимовлиянием культур, т.е. способностью каждой из них разлагать промежуточные соединения, новообразованные при деструкции углеводородов другими культурами. Отличия в качественном разложении н-алкановой фракции чистыми культурами в какой-то степени свидетельствуют в пользу сказанного.

К настоящему времени в чистую культуру из нефтезагрязненных почв Усинского района выделено более 50 штаммов различных углеводородокисляющих бактерий. Как известно из литературы, природных штаммов, способных разлагать сразу все виды соединений, входящие в состав сырых нефтей, не существует. Изучение отдельных представителей углеводородокисляющей микрофлоры, специфики роста их на углеводородах нефти позволяет моделировать составы препаратов для конкретного состава нефти. Данные, приведенные в настоящей статье являются начальными в цепочке исследований для создания рабочей коллекции культур алканотрофных бактерий почв Севера.

ЛИТЕРАТУРА

1. Коронелли Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде (Обзоры/Прикладная биохимия и микробиология. 1996. Т. 32. №6. С.579-585

2. Ившина И.Б. Ассимиляция-углеводородов бактериями рода Rhodococcus // Экология и популяционная генетика микроорганизмов: труды УрО РАН. Ин-т Экологии и генетики микроорганизмов. Свердловск. УНЦ АН СССР, 1987. С. 41-46.

3. Хазиев Ф.Х., Тишкина ЕИ., Киреева Н.А., Кузахметов Г.Г. Влияние нефтяного загрязнения на некоторые компоненты агросистемы Агрохимия. 1988 № 2. С. 56-61.

4. Усачева Г.М., Самосова С.М. Мартынов А.А., Фильченков В.И., Петрова Л.М. Оценка эффективности некоторых приемов воздействия на разложение нефти в почве // Усп. газовой хромотографии. Казань. 1982. Вып. 6. С. 105-114.