Рациональное использование природных ресурсов, переработка сырья и продуктов

Для повышения плодородия почв и рекультивации нарушенных земель существуют методы биологической мелиорации, заключающийся в орошении почв удобрительной суспензией в виде микроводорослей. Как известно, Chlorella является первым и одним из основных звеньев питания многих биосистем. В настоящее время в наиболее развитой аграрной стране мира - США ведутся работы по широкому применению биомассы микроводоросли Chlorella как экологически чистого биологического удобрения. Сегодня известный во всем мире биотехнологический продукт - фактор роста хлореллы, завоевывает все новые рыночные позиции. Именно хлорелла продуцирует (производит в процессе своей жизнедеятельности - CCF (Chlorella Grow Factor). CCF может стать самым эффективным органическим удобрением во всем мире[1].

В условиях жесткой конкуренции, казахстанские производители расширяют ассортимент безалкогольных напитков, обращают большое внимание на повышение качества и улучшение дизайна оформления и наращивания изготовления напитков на натуральной основе с использованием биологически активных добавок, в связи с увеличивающимся вниманием потребителей.

Проведенные исследования показали достаточно высокий интерес населения к собственному здоровью, информированность о взаимосвязи здоровья и питания и, как следствие, заинтересованность в приобретении напитков с определенной функциональной активностью. С учётом того, что напитки являются наиболее предпочтительным продуктом в ежедневном рационе опрошенных, создание напитков с введением растительных экстрактов является социально обусловленным и полезным.

Введение БАД в наши продукты позволит получить функциональные напитки общеукрепляющего, общеоздоравливающего действия.

За пятилетний период 2009-2013 гг объём продаж алкогольных напитков в Казахстане увеличился на 9,6%: с 862 млн л до 944,4 млн л. Падение продаж относительно предыдущих лет наблюдалось в 2009 и 2011 г на 9,3% и 11,4% соответственно.

По оценкам BusinesStat, в 2013-2017 гг рост продаж алкогольных напитков в Казахстане продолжится и составит в среднем 1,7% в год. В 2017 г реализация продукции внутри страны достигнет 1 028 млн л.

3. Методы исследования

1) Описание научных методов, используемых в проекте как обоснование способов достижения поставленных целей, обоснование выбранного подхода;

На первом этапе будет исследовано культивирования одноклеточных микроводорослей культуры Chlorella vulgaris на основе модифицированной питательной среде с обогащением йода и селена в малой колбе на 250-500см³ и в большом биореакторе объемом 10 и 20 литрах соответственно в больших концентрированных средах. Затем будут изучины их морфологические свойства микроскопированием и динамики роста одноклеточных микроводорослей сравнивая с малых колб и больших биоректоров по камере Горяева через микроскопирования. Так же будут

На втором этапе будут исследованы выделение биомассы одноклеточных микроводорослей последовательно удаляя из водных суспензии клетки культуры chlorella vulgaris центрифугированием и промыванием дваждый водой последующей тепловой обработкой.

На третьем этапе будут исследованы биохимический состав одноклеточных микроводорослей культуры chlorella vulgaris а так же будут исследованы экономических эффективностей использовании одноклеточной культуры биомассы Сhlorella vulgaris в пищевой промышленности и живодноводстве в качестве БАД.

В методах исследования будут направлены к данному проекту по общепринятых биохимическим, физико-химическими, микробиологическими анализами. Результаты экспериментальных исследований будут подвргаться статистической обработке путем корреляционного анализа с помощью компьютерных программы как «Microsoft Excel», «Power Point 2007» Отбор фототрофных микроорганизмов из природных источников и получение бактериологически чистых популяций и активных форм этих культур.

Для приготовления накопительной культуры проводили посев собранного материала (несколько кубических сантиметров воды, зеленый налет, слизь и т.д.) в колбочки или пробирки со стерильной жидкой питательной средой, при этом жидкость наливают в колбы таким образом, чтобы занимаемый объем не был более 1/3 - 1/4 объема колбы. Для получение бактериологически чистых культур микроводорослей и цианобактерии использовали метод Больда [5].

При получения накопительных культур одноклеточных протококковых водорослей использовали «стандартной 0,4» среды с обогащением йода и селена .[6, 7].

3.1.Определение видового состава микроводорослей

Определение видового состава микроводорослей в пробах различных водных экосистем проводили по методике Сиренко [7] с использованием следующих определителей: Определитель пресноводных водорослей СССР. В 14-ти вып. Ред. М.М. Голлербах. Изд-во «Советская наука», «Наука»; Вып.2 Синезеленые водоросли. М., 1953.- 652 с.; Вып.5 Желтозеленые водоросли: Вольвексовые. М. -Л., 1962. - 220 с.; Вып.8 Зеленые водоросли: Вольвексовые. М., 1959. - 230 с.; Вып.10 (1) Зеленые водоросли. Класс улотриксовые (1).-Л., «Наука», 1986. -360 с.; Определитель сине-зеленых водорослей Средней Азии. - Ташкент: Фан, 1987. - Т. 1. - С.3-405.; Царенко П.М. Краткий определитель хлорококковых водорослей Укр. ССР. - Киев: Наукова думка, 1990. - 208 с.; Эргашев А.Э. Определитель протококковых водорослей Средней Азии. - Ташкент: Фан, 1979. - Ч.І. - 343с.; Краткий определитель бактерий Берги. Под ред. Дж. Хоулта. М., «Мир», 1980. - 495 с. [4 - 8].

3.2.Методы культивирования микроводорослей и цианобактерий в лабораторных условиях.

Материалы и посуды, питательные среды, оборудования для культивирования одноклеточных микроводорослей:

Химикаты

Химические реактивы, необходимые для приготовления питательных сред, должны быть самого высокого качества. Качество определяется изготовителем, и каждая фирма использует свою собственную маркировку для его обозначения. Для определения качества реактивов можно использовать каталоги компаний и информацию, размещенную на Интернет-сайтах. В последнее время установлено, что большинство солей и реагентов содержат следовые количества металлов и других загрязнителей, что может замедлять рост олиготрофных видов. К тому же, примеси тяжелых металлов в растворах солей могут приводить к увеличению номинальной концентрации солей в некоторых средах. В таких случаях необходима дополнительная очистка химикатов (Watanabe, 2005)[3].

Посуда

Разнообразная посуда (мензурки, различные колбы, бутыли, пробирки, ампулы, цилиндры, чашки Петри, лопаточки, трубочки, шприци бюретки) используется для приготовления питательных сред, включая доступную стеклянную посуду. Кроме того, многие их этих наименований посуды существуют и в виде одноразовой и многоразовой пластиковой, включая покрытый тефлоном пластик. Для подержания культур водорослей широко используются пробирки с закручивающимися крышками и колбы Эрленмейера с силиконовыми крышками. Традиционные ватные пробки тоже применимы, однако они требуют определенного времени для приготовления. Силиконовые пробки могут использоваться многократно, и они обеспечивают лучший газоо бмен по сравнению с ватными пробками. Существует огромное многообразие стеклянной посуды, однако не вся она пригодна для приготовления питательных сред и культивирования водорослей. Жаростойкая посуда из боросиликата, такая как Pyrex (Corning Co.Ltd.), DURAN (Shott Co.Ltd.) и HARIO (Hario Co.Ltd.), лучше всего подходит для приготовления растворов и питательных сред. Посуда из боросиликата не влияет на рН растворов и состав питательной среды и не подвергается быстрой коррозии. Многие исследователи подчеркивают важность использования только химически чистой стеклянной посуды. Для этих целей могут использоваться различные чистящие реагенты. После очистки посуду необходимо промыть 1н. раствором HCl или HNO3, затем водопроводной водой с последующим ополаскиванием дистиллированной водой. После этого посуда должна быть высушена. Хранят такую посуду с соблюдением правил стерильности[3].

Полиэтиленовая, поликарбонатная или покрытая тефлоном посуда может использоваться вместо стеклянной посуды для хранения ра створов отдельных следовых металлов, комбинированных растворов металлов и растворов силикатов. Однако при этом небольшие количества металлов и кремниевые кислоты могут адсорбироваться и осаждаться на стенках бутылей. В результате этих реакций концентрация раствора будет изменяться, и конечная концентрация будет неизвестной (Watanabe,2005)[2-3].

Вода

Самые первые исследователи использовали ключевую воду, потому что талая и дистиллированная вода были сильно загрязнены металлами. Э.Прингшхейм (Pringsheim, 1912) предложил использовать стеклянный аппарат для дистилляции при культивировании водорослей, так как металлический делал воду слишком токсичной. Сегодня качественная вода получается путем перегонки в аппарате однократной или двойной дистилляции с кварцевым стеклянным конденсором или конденсором Pyrex, а также с деонизацией воды с дальнейшей очисткой угольными или мембранными фильтрами (например, Milli-Q, Millipore Corp.). Уровень качества определяется чувствительностью как водорослей, так и процедуры, потому что более точные экспериментальные исследования требуют более высокого качества воды (Watanabe, 2005)[].

Агар

Обычно агар состоит из агарозы и агаропектина, которые загрязнены различными примесями (Krieg, Gerhardt, 1981). Некоторые сорта агара содержат водорастворимые литические агенты против цианоба критерий. Для большинства культивируемых водорослей основным требованием к агару является возможность его использования без дополнительной очистки. Для чувствительных водорослей требуется промывание агара для очистки от примесей (Waterbury et al., 1986). Существуют две методики промывания агара:

- нагреть и растворить двукратную концентрацию агара в деионизованной воде, затем охладить до застывания. Нарезать агар на кусочки и сполоснуть 1-2 раза в дистиллированной воде. Дистиллированная вода должна меняться ежедневно в течение 6-8 дней. Промытый агар с двукратной концентрацией и двукратный объем среды должны быть автоклавированы в разных посудах и смешаны после охлаждения до состояния геля;

- поместить порошковый агар в большую мензурку с двукратно дистиллированной водой (например, 100г в 3л воды) и перемешать в течение 30 минут (Waterbury et al,. 1986). Дать агару осесть и вылить воду, повторить процедуру до полной очистки воды. Удалить воду (при необходимости профильтровать) и промыть агар 3л этанола. Разделить этанол и агар путем фильтрации (например, с помощью фильтра Whatman 4 и колонки Бохнера). Затем сполоснуть агар аналитически проверенным ацетоном. Удалить ацетон и высушить агар при температуре 50?С в течение 2-3 дней.

Хранить агар в хорошо закрытом контейнере. Возможно, что даже промытый агар останется загрязненным следовыми количествами компонентов, токсичных как для цианобактерий (Shiraiet al., 1989), так и для других чувствительных водорослей. В этом случае можно использовать более дорогую, но более чистую агарозу для молекулярных исследований[3].

Почва

Жидкий почвенный экстракт или твердые частицы почвы используются для выращивания видов водорослей в том случае, если нет необходимости в точных знания о потребностях в питательных веществах и обязательным условием является поддерживание нормальной морфологии. Успешность использования почвенной вытяжки зависит от выбора подходящей почвы (Почвенные водоросли, 1969). Однако найти хорошую почву не очень просто. Например, из более чем 40 различных видов почв для культивирования хризофитовых водорослей пригодными оказались только две (Watanabe, 2005). В качестве хороших почв для культивирования водо- рослей можно рекомендовать почвы из садов и оранжерей, где они не обрабатывались химикатами (различными пестицидами), почвы из заповедных лесов и лугов, не подвергающихся выпасу (Starr, Zeikus, 1993; Tompkins et al., 1995). Почва должна быть суглинистого типа, почвы с большим содержанием глины не подходят. Также не подходит кислая почва, а также почва, взятая из глубоких горизонтов. Для некоторых редких или чувствительных водорослей иногда можно использовать хорошую почву около озер или водоемов, где они растут в естественных условиях. Однако почва должна быть отобрана над уровнем воды, поскольку ниже могут осаждаться различные токсиканты. Удалив весь мусор (камни, листья, корни, черви), почву необходимо высушить при комнатной температуре или в сухожаровом шкафу при температуре менее 60?C. После высушивания почва должна легко измельчаться до состояния пыли. Для измельчения почвы можно использовать чистые ступку и пестик. Далее измельченную почву необходимо просеять через сито для удаления всех крупных частиц. Хранить почву следует в сухой посуде. Для приготовления почвенной вытяжки необходимо взять 1 часть почвы и 2 части дистиллированной воды, после перемешивания смесь воды и почвы необходимо пастеризовать в течение 2 часов (Tompkins et al., 1995). Необходимо дождаться осаждения всех частиц, после чего жидкость следует профильтровать (например, с использованием фильтра Whattman). Экстракт должен быть подвергнут пастеризации или автоклавированию еще раз. Раствор должен быть тщательно укупорен и храниться при температуре 4?C. Существует еще один более сложный метод приготовления почвенной вытяжки с использованием щелочной экстракции. Подробное описание данного метода можно найти в статье Л.Провасоли с соавторами (Provasoli et al., 1957)[2].

Микроэлементы

Растворы микроэлементов обычно готовят в виде отдельных растворов или смешанных растворов. В некоторых случаях они добавляются непосредственно в раствор в концентрациях от 0,1мг до 20мг на литр. Во многих, но не во всех средах для пресноводных водорослей Na2EDTA (динатриевая этилендиаминтетрауксусная кислота) используется в качестве хелатора. Когда используется EDTA, ее следует добавлять сразу же после добавления металлов. Практические рекомендации по последовательности приготовления растворов приводятся ниже (Watanabe, 2005)[2-3].

Приготовление отдельных растворов

Отдельные (например, содержащие соли одного металла) растворы готовятся в концентрации, в 1000 раз превышающую концентрацию в конечном растворе. Рецепты маточных растворов для приготовления питательных сред приводятся в Приложении 1. Схема приготовления маточных растворов включает в себя два этапа:

- в дистиллированную или деионизированную воду (объемом примерно 800-950мл) добавляют необходимое количество микроэлементов. В случае растворения железа, кобальта, меди, марганца и цинка можно прокипятить раствор в течение 5-10 минут для ускорения процесса;

- раствор доводят до конечного объема (1л) путем добавления дистиллированной или деионизированной воды. Растворы солей хранят в холодильнике при +4?С в пластиковой, плотно закрытой емкости для предотвращения испарения. Когда необходимо приготовить раствор микроэлементов небольшой концентрации, необходимо приготовить маточный раствор, очень точно взвешивая соль. Затем нужно разбавить раствор до получения необходимой концентрации (Watanabe, 2005)[2].

Смешанный маточный раствор (рабочий маточный раствор)

При приготовлении смешанного маточного раствора следует соблюдать следующую последовательность операций:

- в мензурку наливают приблизительно 80% необходимого объема дистиллированной или деионизированной воды (например, 800мл на 1 л раствора);

- если в качестве хелатора используется Na2EDTA или другой хелатор, в первую очередь растворяют его;

- добавляют необходимый объем каждого микроэлемента из отдельного раствора, каждый раз хорошо перемешивая смешанный маточный раствор;

- доводят объем раствора до нужной величины дистиллированной или деионизированной водой и хранят его в холодильнике. Для удобства лучше перелить маточные растворы в емкости маленького объема. Например, если для приготовления конечного раствора требуется 1мл маточного раствора, 1мл раствора можно поместить в эппендорф и заморозить, или же разлить раствор в склянки по 10мл (Watanabe, 2005)[2].

Обогащенные среды

При приготовлении обогащенной среды добавляют приблизительно 80-90% от требуемого объема дистиллированной или природной воды в мензурку. Если используется природная вода, ее необходимо взять из того источника, где ранее были отобраны пробы водорослей. После чего эту воду автоклавируют или пастеризуют. В данном случае можно использовать другой способ стерилизации - фильтрацию, при этом используют фильтры с размером пор 0,22мм. Однако следует отметить то, что эта процедура не позволяет обезвредить вирусы. Далее в воде растворяют каждый компонент (из маточного раствора или взвешенное количество): макроэлементы, микроэлементы, витамины, экстракты или органические вещества (например, экстракт дрожжей,

солода, торфяного мха или почвы). Раствор с питательными веществами доводят до необходимого объема, доливая в колбу дистиллированную или природную воду соответственно. Важное значение для развития водорослей имеет рН среды. Большинство водорослей предпочитают нейтральную или слабощелочную реакцию, равную 7,0-7,6. Исключение представляют водоросли дистрофных водоемов и торфяных болот. Поэтому, по возможности, так же как и при приготовлении синтетических сред, необходимо отрегулировать рН раствора. Затем среду переливают в емкость для культивирования, которую потом автоклавируют или стерилизуют с помощью фильтра (Watanabe,2005)[2].

Почвенная вытяжка

Далеко не все водоросли могут хорошо расти на чистых минеральных и обогащенных средах. Многие из них для нормального роста требуют наличия органических веществ. Из органических сред наибольшего внимания заслуживает почвенная вытяжка. Среды, приготовленные с ее использованием, обладают хорошей буферностью по отношению к железу и содержат микроэлементы. Но эти среды не пригодны для физиологических опытов по питанию водорослей.

Приготовление почвенной вытяжки - очень важный этап в технике культивирования водорослей. При получении почвенной вытяжки необходимо соблюдать ряд правил. Слой садовой земли (высушенной и просеянной) толщиной 1-2см помещают на дно пробирки (колбы, бутылки и т.д.). Добавляют дистиллированную или деонизированную воду до заполнения ѕ сосуда, закрывают колбу ватной пробкой или крышкой. В течение 1ч в последующие 2 дня емкость со средой хорошо пропаривают. Обычно почвенная вытяжка не автоклавируется, так как в этом нет необходимости. Однако для многих водорослей (но не для всех!), стерильная почвенная вытяжка является хорошей питательной средой[]. Пропаренную вытяжку охлаждают в течение 24 часов, затем хранят в холодильнике. Почвенная вытяжка может быть модифицирована путем прибавления следующих добавочных компонентов (до того, как туда будет добавлена почва):

- щепотки измельченного до порошкообразного состояния CaCO3 для многих фототрофных пресноводных водорослей (Starr, Zeikus, 1993);

- щепотки NH4MgPO4 для Botryococcus, Synechococcus и некоторых эвгленовых (Starr, Zeikus, 1993);

- садового торфа, высушенного в течение 12ч для некоторых эвгленовых, флагеллят и других миксотрофных водорослей (Starr, Zeikus, 1993; Schlцsser, 1994);

- Ѕ чайной ложки органического торфа и ј чайной ложки почвы для большинства ацидофильных водорослей (Starr, Zeikus, 1993).

Принципы составления питательных сред

Все живые клетки нуждаются в экзогенных источниках питания, содержащихся в питательных средах. Питательная среда обеспечивает жизнедеятельность, рост и развитие биообъектов. Прежде чем начинать работы по культивированию разных типов клеток, необходимо точно знать их питательные потребности и зависимости. Постоянным компонентом питательных сред является вода, в которой нуждаются все живые клетки. Питательные вещества образуют в воде истинные (минеральные соли, сахара, аминокислоты, карбоновые кислоты, спирты, альдегиды) или коллоидные (белки, липиды, неорганические соединения) растворы. Некоторые компоненты питательных сред, находящиеся в твердом агрегатном состоянии, могут либо образовывать придонный осадок, либо равномерно распределяться по всему объему в виде взвеси, либо плавать на поверхности раствора (частицы угля). Жидкие углеводороды при внесении в воду образуют несмешивающуюся фракцию. В питательной среде должны присутствовать все элементы, необходимые для построения компонентов живых клеток в доступной для усвоения форме. В больших количествах клеткам необходимы макроэлементы: углерод, азот, кислород, водород, фосфор, сера, калий, кальций, магний. Снабжение клеток кислородом и водородом осуществляется за счет воды. Углерод является составной частью всех органических соединений и его источники многочисленны и многообразны: чаще всего сахара, многоатомные спирты и органические кислоты. В качестве азотистого субстрата для изготовления питательных сред служат в основном белки животного и растительного происхождения. Помимо макроэлементов, клетки в незначительных количествах нуждаются также и в некоторых микроэлементах: натрий, марганец, никель, кобальт, хлор, цинк, медь, кремний, молибден, бор, ванадий и некоторые другие. Кроме основных пластических и энергетических компонентов, питательные среды могут содержать и так называемые факторы роста. Это органические соединения (витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания и др.), в которых нуждаются ауксотрофные клетки и которые они синтезировать не в состоянии.

В качестве необходимых компонентов питательных сред могут выступать газы: хорошо (NH3, H2S), умеренно (CO2) или плохо (N2, O2, H2,CH4) растворимые в воде. Питательные среды могут иметь неопределенный состав, т. е. включать биогенные добавки (растительного, животного или микробного происхождения), например мясной экстракт, дрожжевой экстракт, кукурузную муку, морские водоросли и т. д. Такие питательные среды называются натуральными. Применяют также среды, приготовленные из чисто химических соединений в заранее определенных соотношениях. Это так называемые синтетические среды. Применение находят и полусинтетические питательные среды, сочетающие в своем составе компоненты как натуральных, так и синтетических сред. Среды данных типов имеют как преимущества, так и недостатки. С экономической точки зрения наиболее целесообразно использование природного, более дешевого сырья, чем веществ в чистом виде, полученных химическим путем. Однако только применение сред строго определенного состава позволяет точно регистрировать и регулировать протекающие в культуральной среде процессы, добиваясь их оптимизации. Компромиссным подходом является использование полусинтетических сред, в состав которых наряду с соединениями известной химической природы входят биогенные добавки[2-3].

Твердые питательные среды

Стандартный питательный агар

Г.Клебс (G.Klebs) и Н.Тишуткин (N.Tischutkin) были первыми исследователями, которые использовали твердые агаризованные среды для культивирования водорослей, так как питательный агар очень хорошо подходил для выращивания большинства пресноводных водорослей. Небольшое количество суспензии клеток распределяют по поверхности агара, и обычно клетки начинают медленно расти на его поверхности. Агар обычно готовят в концентрации 1-2%. На таких средах хорошо растут многие водоросли. Но на агаризованных средах водоросли растут медленнее по сравнению с жидкими средами. Обычная процедура приготовления агаризованной среды описана ниже: 2-литровую колбу Эрленмейера с 1л среды нагревают до температуры 95єC в сухожаровом шкафу или на плитке, либо с помощью водяной бани. После этого в колбу медленно добавляют необходимое количество агара при постоянном перемешивании так, чтобы весь агар растворился в среде. Летом желательно агара брать больше, зимой - меньше, так как при более низкой температуре среды хорошо затвердевают. Агаризованную среду используют в основном для выделения чистых культур, хранения музейных коллекций, а также для обрастающих форм водорослей[2-3].

В практике культивирования водорослей применяют агаризованные чашки Петри или агаризованные косяки. Приготовление агаризованных чашек Петри. Сначала агар автоклавируют при температуре 120?C в течение 20 минут, потом охлаждают его до 50-60?C, после чего разливают в стерильные чашки Петри. Нагретую среду следует держать при температуре 50-60?C, поместив на водяную баню. Если разлить по чашкам слишком горячий агар, будет образовываться конденсат. После застывания среды чашки следует перевернуть и хранить в воздухонепроницаемом контейнере (пластиковом пакете, закрытой емкости) при температуре 4?C в холодильнике. Приготовление агаровых косяков в пробирках. Агар наливают в пробирки, затем стерилизуют в автоклаве так же при температуре 120? C в течение 20 минут. После автоклавирования пробирки помещают на поверхность с уклоном и охлаждают. Разные компании изготавливают специальные стойки для застывания среды (Watanabe, 2005).

Питательные чашки с агаром

Некоторые водоросли не растут на поверхности агара, но они хорошо растут внутри него (Skinner, 1932). Для того, чтобы поместить клетки внутрь среды, готовят 1-2% агар, и когда стерильный раствор остынет до состояния геля, его перемешивают с жидкой суспензией культуры. Смесь перемешивают для равномерного распределения водорослей[2]. Потом агар разливают в чашки Петри. Для водорослей, чувствительных к высоким температурам, можно использовать агарозу, застывающую при низкой (26±2?C) или при очень низкой температуре (8-17?C) (Shirai et al., 1989; Watanabe et al., 1998). Известно большое количество рецептов питательных сред. Наиболее распространенные из них приведены в Приложении 1. Там же приводятся заметки об их приготовлении и список видов водорослей, хорошо растущих на этих средах. Дополнительную информацию можно найти в каталогах штаммов коллекций культур (Сиренко и др., 1975; Starr, Zeikus, 1993; Schlцsser, 1994; Tompkins et al., 1995; Andersen et al., 1997; Watanabe et al., 2000).

Выбирать оптимальную среду для выращивания той или иной водоросли удобно на основании использования методов математического планирования эксперимента. Этот же способ можно успешно применять и при культивирования[2].

Суспензионные культуры

Для наращивания клеточной массы удобнее использовать не монослойные, а суспензионные культуры. Как правило, клетки, отделившиеся от субстрата, на котором они росли, неспособны к росту в суспензии и быстро деградируют.

Но если некоторые клетки культивировать во вращающемся флаконе (2 об/мин), не дающем возможности прикрепления клеток к поверхности, в среде, содержащей метилцеллюлозу, предот- вращающую агрегацию клеток, можно получить жизнеспособные суспензионные клеточные штаммы. Иногда этого бывает достаточно для получения суспензионной культуры, но обычно требуются специальные сосуды для культивирования суспензий и использование среды с дефицитом ионов кальция и магния. Суспензионные культуры также можно получать путем обработки отобранной для пересева монослойной клеточной культуры 0,02 % раствором химопсина в фосфатно-солевом буфере или 0,1 % трипсином и 0,01 % ЭДТА с последующим длительным периодом адаптации, сопровождающимся различными манипуляциями, предотвращающими возврат к монослою.

Суспензионные культуры лучше растут внутри ограниченного диапазона концентраций клеток и в том случае, когда сосуд наполнен средой наполовину. Для обеспечения этих условий необходимо каждый день или (в случае медленно растущих культур) через день, удалять половину суспензии через боковое горлышко и добавлять равный объем свежей среды. Некоторые клетки (трансформированные и кроветворные клетки, асцитные опухоли) способны расти как на субстрате, так и в суспензии в зависимости от солевого состава среды культивирования.

Культуры лимфоцитов не обнаруживают тенденции к адгезии к поверхности стекла или пластика и выживают на дне культивационного сосуда под тонким слоем среды. Суспензионное культивирование первичных и перевиваемых клеточных линий проводят в роллерных установках, где создаются благоприятные для клеток условия постоянного перемешивания жидкой и газовой фаз, общий объем среды при этом снижается вдвое по сравнению со стационарными условиями.

Суспензионное культивирование клеток также можно проводить в ферментерах, предназначенных для суспензионного культивирования микроорганизмов, в которых постоянное перемешивание клеток в среде осуществляется магнитными или механическими мешалками в колбах с высокой скоростью вращения, препятствующей прикреплению клеток к стенкам сосудов. Суспензионное культивирование дает, по меньшей мере, 2?3-кратно экономию питательных сред, по сравнению с общепринятым стационарным монослойным культивированием при полном исключении дорого-стоящих протеолитических ферментов и буферных растворов. Кроме того, суспензионные культуры представляются предпочтительными с точки зрения получения больших количеств биомассы[3].

Питательные среды для суспензионных культуры Chlorella vulgaris

Среда Тамия

(г/л, применяется в различных разведениях для зеленых водорослей):

KNO3 - 5,0

MgSO4Ч7H2O - 2,50

KH2PO4 - 1,25

FeSO4Ч7H2O - 0,003

Раствор микроэлементов - 1 мл, ЭДТА - 0,037

Раствор микроэлементов (г/л): H3BO3 - 2,86; MnCl2Ч4H2O - 1,81;

ZnSO4Ч4H2O - 0,222; MoO3 - 176,4 мг/10л; NH4VO3 - 229,6 мг/10л

Помещения для работы с культурами клеток

Стерилизация питательных сред, как и все другие манипуляции при работе с клеточными культурами, проводится в боксовых помещениях или в ламинар-боксах. Боксовое помещение представляет собой изолированную комнату с несорбирующими пыль моющимися покрытиями, имеющую предбоксник и обеспеченную необходимым общим и специальным освещением, системами приточной и вытяжной вентиляции, холодным и горячим водоснабжением, а также подводами газов и сжатого воздуха. Альтернативой боксовым помещениям, требующей меньших затрат на оборудование, являются ламинар-боксы, или стерильные рабочие места. В этом случае в любом помещении может быть создан локальный стерильный объем, необходимый для работы и создающий биологическую защиту пользователей. Технически задача решается путем постоянного обдува места проведения работ ламинарным потоком[3]. При работе с заведомо непатогенными материалами поток обеспыленного воздуха из рабочей зоны выходит непосредственно в окружающее пространство. В случае работы с потенциально патогенным материалом воздух перед выходом из рабочей зоны дополнительно фильтруется, возможность обдувании. В зависимости от устройства ламинар-бокса поток обеспыленного воздуха в рабочей зоне может быть горизонтальным, вертикальным или наклонным. Ламинар-бокс с горизонтальным потоком обеспыленного воздуха типа УОБГ (установка обеспылевания биологическая с горизонтальным потоком) обеспечивает очистку воздуха, подаваемого в рабочую зону, путем фильтрации на фильтрах грубой и тонкой очистки, встроенных в прибор (по мере загрязнения грубый фильтр промывается, тонкий сменяется)[2].

УФ облучения

(для стерилизации рабочей зоны в перерывах между использованием бокса) и регулятор скорости воздушного потока. Организация ламинар-боксов с вертикальным и наклонным потоками обеспыленного воздуха типов УОБВ и УОБН аналогична организации ламинар-бокса с горизонтальным потоком, описанным выше. Ламинар-бокс для работ с потенциально патогенными культурами типа БП-4004 («Бокс-Р») имеет некоторые отличия. В приборе обеспечи-

вается рециркуляция воздушного потока, заключающаяся в том, что воздух из рабочего объема попадает на специальный фильтр тонкой очистки, откуда часть его выходит в окружающее пространство, а остальной поток повторно проходит через фильтр тонкой очистки и вновь поступает в рабочий объем. Этим достигается невозможность выноса обрабатываемого материала в помещение. Возможность попадания выходящего воздуха на оператора предотвращается созданием зоны подсоса на открытой стороне рабочего объема бокса. Прибор имеет встроенные источники света и УФ облучения, столешницу из нержавеющей стали. Передняя часть рабочего объема закрыта прозрачным стеклом, перемещаемым по высоте. Бокс снабжен системой регулирования скорости потока воздуха и индикаторами загрязнения фильтра тонкой очистки.

Перечисленные выше типы ламинар-боксов предназначены для размещения в любых производственных помещениях, имеющих приточную вентиляцию с грубой предварительной очисткой воздуха.

Оборудование лабораторий

Оборудование

Определенный минимум оборудования (стеклянная и пластиковая посуда,аналитические весы с точностью до 1мг, рН-метр и магнитная мешалка) необходим для приготовления растворов и питательных сред. Автоклав необходим для стерилизации. Оборудование для фильтрации (вакуумная установка или шприц для фильтрации, мембранные фильтры) используется для стерилизации субстанций, чувствительных к нагреванию. Ультразвуковая моечная машина полезна для очистки стеклянной и пластиковой посуды от устойчивых загрязнений. Холодильник с морозильной камерой нужен для хранения растворов и питательных сред (Watanabe,2005)[2].

Лабораторные термостаты

Лабораторные термостаты для культивирования клеток должны отвечать ряду специальных требований:

1) обеспечивать высокую стабильность поддержания заданной температуры 2) создавать минимальный градиент температуры по полезному объему; 3) обладать системой быстрого восстановления температуры после кратковременного открывания полезного объема; 4) внутренний объем должен изготавливаться из биологически пассивных материалов, т. е. не влияющих на жизнедеятельность клеток и стойких к воздействию компонентов питательных сред.

Материалы и покрытия внутренних и наружных частей конструкции термостата должны позволять деконтаминацию водными растворами спирта ректификата и стерилизацию УФ облучением. По своей конструкции лабораторные термостаты подразделяются на жидкостные и воздушные. В жидкостных термостатах полезный объем окружен емкостью, наполненной дистиллированной водой, которую собственно и нагревают. Воздушные термостаты имеют полезный объем, непосредственно контактирующий с электронагревательными элементами. Жидкостные термостаты обеспечивают малые значения температурного градиента в камере, но имеют очень большую тепловую инерцию и поэтому длительное время вхождения в рабочий режим. Усовершенствованные формы воздушных термостатов, ранее уступавших жидкостным по ряду основных параметров, теперь составляют значительную часть серийно выпускаемых моделей[2-3].

СО₂-инкубаторы

Необходимость поддержания постоянной величины рН в питательной среде и ее минимального испарения в период инкубации клеток привела к разработке специальных приборов, аналогичных описанным выше термостатам. Главным отличием является наличие систем создания и поддержания определенного состава газовой среды в полезном объеме и высокой относительной влажности в нем. Это так называемые углекислотные инкубаторы, выпускаемые фирмами «Heraues», «Hotpack», «Flow». Газовая среда в камерах СО2-инкубатора содержит повышенную концентрацию кислорода и углекислого газа, а в большинстве случаев только углекислого газа. Величина концентрации задается по условиям культивирования и поддерживается автоматически. В автоматических СО2-инкубаторах заданный состав газовой среды поддерживается дозирован-ным поступлением нужного газа в поток очищенного от пыли внешнего воздуха, подаваемого во внутренний объем прибора[2].

Другой разновидностью инкубаторов являются так называемые газо-проточные инкубаторы типа ГПИ-1, где подача нужных газов производится непрерывно, а точное процентное содержание достигается изменением скорости протока.

Аэраторы

Для обеспечения аэрации культуральной среды - снабжения кислородом ? используют воздух, а также воздух, обогащенный кислородом, реже ? чистый кислород. Процессы, протекающие без доступа кислорода (анаэробные), зависят от газообразных субстратов и требуют отвода газообразных продуктов жизнедеятельности. Аэраторы - основной пример функционирующих систем газоснабжения и газоотвода[2].

3.3.Подготовка культуры.

Перед постановкой опыта клетки микроводорослей пересевали со скошенного агара или с жидкой среды, на которых культура сохранялась, в колбы со свежеприготовленной питательной средой того же состава, который в дальнейшем использовался в опыте. В опытах по сравнению различных культур подготовительный высев проводили для всех форм в один и тот же день и с одинаковым по числу клеток или по биомассе количеством микроводорослей. Колбы с культурами ставили на четыре - шесть дней на свет для подращивания.

3.4.Методы количественного учета клеток микроводорослей и цианобактерий

Контроль над темпом роста и размножением микроводорослей в культуре осуществляли на основании учета изменений их численности и биомассы с помощью камеры Горяева [9]. Для обездвиживания клетки водорослей в течение нескольких секунд фиксировали парами йода.

Прирост клеток суспензии цианобактерий измеряли по оптической плотности при длине волны 750 нм с использованием КФК-3 [10].

Каждые сутки в одной и то же время (в 12 часов) осуществляли измерение линейных размеров клеток под световым микроскопом 10 повторностях, учет их численности в трех повторностях. Относительная ошибка определения численности клеток не превышала 10%. Удельную скорость роста микроводорослей и цианобактерий рассчитывали по приросту численности клеток в экспериментальных сосудах по уравнению [11]:

R = 1 ·ln N_t, (1)

где: R - коэффициент скорости роста; t - время в сутках; N₀ и N_t - исходная численность клеток и их количество через время t.

3.5.Методы определения и получения сухой биомассы.

Собранную в начале стационарной фазы роста биомассу центрифугировали в центрифуги для осаждения биомассы хлореллы от суспензионной среды и дваждый промывали дистиллированной водой в центрифужных пробирках и сушили при 60⁰С до воздушно-сухого состояния в сушильном шкафу. Для этого биомассу наносили тонким слоем на чашки Петри и высушивали в течении 3-4 ч, не допуская попадания прямых солнечных лучей. Вес фильтров с объектами и без объектов определяли после неоднократного высушивания в бюксах при 105^оС. Образец сушили до постоянной массы, затем измельчали в ступке до порошкообразного состояния, взвешивали в виде порошка и получали массу (m, г) для получения данных по объему (V, мл).

3.6. Методы автоселекции

Для выделения активных форм микроводорослей предварительное сравнение и отбор культур проводили по наиболее простым параметрам, таким как скорость роста в колбах с жидкой средой.

Активные (продуктивные) формы микроводорослей отбирали по скорости роста испытуемых форм при условии одинакового количества исходного посевного материала в среде. Скорость роста определяли по увеличению числа клеток.

Посевной материал готовится путем последовательных пересевов с возрастающей концентрацией питательной среды. Вначале культуры высевают в литровой колбе, содержащей 250-300 мл питательной среды. Эти колбы с посевом культуры выращивали при 25-28⁰С под люминесцентные лампы круглосуточном освещении (3000-4000 лк), их содержимое количество периодически перемешивается (взбалтывается). Первичное культивирование посева культуры в этих условиях продолжается 6-8 дней, пока количество клеток культуры в суспензии не достигнет максимального роста.

3.7. Биохимические методы

Определение содержания белка в биомассе микроводорослей и цианобактерии производилось согласно методу, предложенному Lowry [12].

Содержание общего белка в биомассе определяли методом Лоури. Содержание пигментов определяли по стандартным методикам [13, 14]. Для выделения и анализа пигментов суспензии клеток микроводорослей и цианобактерий центрифугировали в течение 15 минут при 5000 об/мин на центрифуге Eppendorf 5810R. Из осадка пигменты экстрагировали ацетоном. Полученную вытяжку пигментов фильтровали через фильтр с d = 100 нм. По полученным полосам поглощения определяют оптическую плотность раствора (D).

Метод Гансена (экстрагирования и количественное определение липидов)

Hansen A.E., Wiese H. F Semimicromethod for unsaturated fatty acids of blood serum. -Biol. Chem., 1953, 202, 1.

Holman R.T., Hayes H. Determination of Polyunsaturated Acids in Lipides of Plasma and Tissue.- Analyt. Chem., 1958, 3001, 8

Проведение анализа

0,2-0,5г сухого вещества + 3:1 алкогольным эфиром смешивая обрабатывают > первая порция смеси подкисляют по каплям НСl>алкогольно-эфирный экстракт сливают делительную воронку> обработать дополнительно петролейным эфиром до бесцветного> тщательно смешивают + 0,5% NaCl для разделения липидов на фракции > п. п. э. с липидами промывают 250мл 3-ды >высушивают безводным Na₂ SO₄ и фильтруют >в сушильном шкафу 30⁰С выпаривают до 50мл объема >экстракт переносят в железные бюксы для выпаривания >до него (выпаривания) +0,1% C₆H₄(OH)₂ для утилизации окисление липидов >подсушивают экстракт до постоянного веса в бюксах.

Приготовление реактивов

0,5% NaCl - 0,5г NaCl растворить в 100мл дистиллированной воде

0,1% гидрохинон C₆H₄(OH)₂. - 0,1г C₆H₄(OH)₂.+100 мл дистиллированной водой перемешать

Алкогольно-эфирный экстракт 3:1 - 1часть петролейного эфираи 3часть этилового чистого спирта ( 30спирт +10 петролейный эфир)

ПРИМЕЧАНИЕ: экстракция липидов будет зависеть от алкогольно-эфирного экстракта, потому что от алкогольного экстракта вся липидная часть переходит к петролейному эфиру при добавление 0,5% NaCl идёт процесс разделение липидов на фракции и также для увеличение объем экстракта будет зависеть от обработки экстракта петролейным эфиром для обесцвечивания но для этого потребуется больше объема разведение алкогольного эфира. Определение липидов на количественный подсчет также зависеть от температурного режима выпаривания, если поднять температуру то вероятность потери объема веса липидов после выпаривания и возможно будет неправильный подсчет количество липидов.

Метод Масюк и Радченко

(Извлечение пигментов из водорослей с плазматической оболочкой)

Масюк Н. П., Радченко М. И. Извлечение пигментов из водорослей с плазматической оболочкой. - Гидробиол. Журн., 1967, 3, 6.

Масюк Н. П., Радченко М. И. Сравнительное хроматографическое изучение пигментов некоторых некоторых видов и штамов Dunaliella Teod- Гидробиол. Журн.,1970, 6, 3.

Проведение анализа

20-40мл суспензия исслед. р-ра + ацетон или этанолом 1:1, перемешать, встряхнуть 1-2мин > переносят в делительную варонку с петролейным эфиром для обесцвечивания > + 50 мл дистиллированной воды перемешать для разделение пигментов петролейно-эфирный экстракт сушат на безводный Na₂ SO₄ до полной экстракции > спектрофотометрируют или элюлируют пигменты на разделение в хроматографии.

Аппаратура:

спектрофотометр для видимой части спектра или фотоэлектроколориметр, делительные воронки.

Реактивы:

ацетон, петролейный эфир, сульфат натрия (безводный)

ПРИМЕЧАНИЕ: Качество извлечение пигментов зависит от используемых различных эфирных экстрактов по соотношении концентрации также петролейный эфир используеться для экстракции количественных фракции липидов на разделительной воронки со смесью алкогольно эфирного экстракта 3:1, также в хроматографии используются смеси 0,025М фосфатный буфер с рН 6,4 для элюляции пигментов.

При выполнении проекта будут использованы различные современные методики выполнения работ в зависимости от их вида с использованием лабораторного оборудования: лаборатории ТОО «КазНИИ ППП», Казахстанско-Японский инновационный центр (КазНАУ), Испытательная региональная лаборатория инженерного профиля «Конструкционные и биохимические материалы» ЮКГУ им. М.Ауэзова, испытательная региональная лаборатория АО «КазАгроИнновация», услуги которых будут оплачены из статьи расходов «Услуги сторонних организаций».

2. Критические точки, альтернативные пути реализации проекта.

Видимых рисков для реализации проекта нет. В случае возникновения проблемы с реализацией проекта, он будет предложен областным социально-предпринимательским корпорациям (СПК).

Предлагаемый проект является достаточно устойчивым, т.к. ТОО«КазНИИ перерабатывающей и пищевой промышленности» и Казахстанско-Японский инновационный центр располагает современной научно-производственной базой для проведения научных исследований оснащенной новейшим оборудованием.

Риск по отсутствию кадров или материально-технической базы - организация-исполнитель Казахский Научно-Исследовательский Институт Перерабатывающей и Пищевой Промышлености, исполнители проекта Казахстанско-Японский ИнновационныйЦентр и КазНАУ имеют возможность привлечь для реализации проекта сотрудников квалифицированных в данной отрасли науки - докторов и кандидатов наук, докторантов, магистрантов имеющих опыт работы в аналогичных НИР. Все сотрудники подпишут контракт на период выполнения проекта.

Риск экономической эффективности предложенных решений маркетинговые исследования отечественного рынка подтверждают высокий спрос на ликероводочные и безалкогольные напитки и лечебно-профилактическим эффектом.

Получено предварительное теоретическое обоснование исследованиям по направлению темы проекта.

Риск финансовых операций, включающий в себя потери, связанные с ошибками в процессах проведения операций и расчетов по ним, их учета, отчетности и т.д., в организации исполнителе и организациях соисполнителях действует служба внутреннего и внешнего аудита для контроля финансовых операций.

4. Группа реализации и управление проектом

1) описание состава исследовательской группы, их позиций, квалификации и направлениях работы в проекте и план работ, включающий этапы проекта; руководитель проекта, д.т.н., профессор, академик НАН РК (100%):

1.Разработка технологии ликероводочных и безалкогольных напитков- 2015-2017 гг.

2.Научно-методическое руководство исследовательской части проекта-2015-2017гг.

3.Проведение мониторинга производства ликероводочных и безалкогольных нгапитков-2014г.

4. Обработка и анализ полученных результатов -2015-2017гг.

5.Подготовка заключительного отчета по проекту совместно с исполнителями проекта- 2016г.

соруководитель проекта, д.т.н., профессор (50%):

1.Разработка технологии ликероводочных и безалкогольных напитков- 2015-2017 гг.

2.Научно-методическое руководство исследовательской части проекта-2015-2017гг.

3.Проведение мониторинга производства ликероводочных и безалкогольных нгапитков-2014г.

4. Обработка и анализ полученных результатов -2015-2017гг.

5.Подготовка заключительного отчета по проекту совместно с исполнителями проекта- 2016г.

главный научный сотрудник, д.т.н. (50%):

1. Разработка технологии ликероводочных и безалкогольных напитков- 2015-2017 гг.

2. Проведение мониторинга производства ликероводочных и безалкогольных нгапитков-2014г.

3. Обработка и анализ полученных результатов -2015-2017гг.

4.Подготовка заключительного отчета по проекту совместно с исполнителями проекта- 2016г.

ведущий научный сотрудник, к.б.н., доцент (50%):

1.Подготовка методики и проведение научных исследований согласно программы исследований - 2015-2017гг.

2.Исследование влияния биологически активных веществ на качество ликероводочных и безалкогольных напитков-2015-2017гг.

3.Обработка и анализ полученных результатов - 2015-2017гг.

4.Подготовка заключительного отчета по проекту совместно с исполнителями проекта- 2016г.

ведущий научный сотрудник, к.т.н. (100%):

1.Разработка методик и проведение исследований - 2015-2017гг.

2.Проведение физико-химических исследований 2015-2017гг.

3.Исследование природных минеральных вод РК - 2014г.

4. Организация и участие в проведении патентно-информационного поиска по проекту-2015г.

5.Участие в подготовке отчета по проекту - 2016г.

ведущий научный сотрудник, к.т.н. (50%):

1.Проведение биохимических исследований 2015-2017гг.

2.Участие в проведении патентно-информационного поиска по проекту-2015г.

4.Проведения исследований согласно программе - 2015-2017гг.

5.Участие в составлении ежеквартальных отчетов-2015-2017гг.

младший научный сотрудник, магистр (100%):

1.Проведение биохимических исследований 2015-2017гг.

2.Участие в проведении патентно-информационного поиска по проекту-2014г.

3.Проведения исследований согласно программе - 2015-2017гг.

4.Участие в составлении ежеквартальных отчетов-2015-2017гг.

младший научный сотрудник, магистр (100%):

1.Проведение биохимических исследований 2015-2017гг.

2. Участие в проведении патентно-информационного поиска по проекту-2014г.

3.Проведения исследований согласно программе - 2015-2017гг.

4.Участие в составлении ежеквартальных отчетов-2015-2017гг.

младший научный сотрудник, магистрант (50%):

1.Проведение биохимических исследований 2015-2017гг.

2. Участие в проведении патентно-информационного поиска по проекту-2014г.

3.Проведения исследований согласно программе - 2015-2017гг.

4.Участие в составлении ежеквартальных отчетов-2015-2017гг.

3) Смета расходов с обязательной расшифровкой по каждой статье расходов на каждый год реализации проекта.

Бюджет Проекта распределяется научным руководителем Проекта в соответствии с планом работ, и не может быть направлен на иные статьи расходов, не связанные с данным Проектом.

Общая сумма всех статей расходов представляет собой запрашиваемую сумму для финансирования и должна быть эквивалентна заявленной в п. 1 «Общая информация», запрашиваемой сумме финансирования.

В Проект могут быть внесены изменения в распределение бюджета на основании решения Национального научного совета.

В статьи бюджета могут включаться следующие расходы:

1) Заработная плата - вознаграждение за труд научных работников, участвующих в проведении научного исследования с учетом всех налогов и вычетов;

2) научные командировки - командировки, связанные с проведением исследований, возмещение которых не должно превышать нормы возмещения командировочных расходов, установленные Правилами о служебных командировках в пределах Республики Казахстан работников государственных учреждений, содержащихся за счет средств государственного бюджета, а также депутатов Парламента Республики Казахстан, утвержденным постановлением Правительства Республики Казахстан от 22 сентября 2000 года № 1428, а также постановлением Правительства Республики Казахстан от 6 февраля 2008 года № 108 «О возмещении государственным служащим расходов на заграничные командировки за счет средств республиканского и местных бюджетов»;