Методы определения суммарных белков в мясе и мясных продуктах

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

ОРЛОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Факультет «Биотехнологии и ветеринарной медицины»

Кафедра «Продукты питания животного происхождения»

Контрольная работа по дисциплине: « Методы исследования мяса и мясных продуктов»

Тема: «Методы определения суммарных белков в мясе и мясных продуктах»

1. Введение

Поступающие с пищей белки в организме человека выполняют важнейшие функции, многие из которых незаменимы. Белки содержатся во всех продуктах питания, но массовая доля их весьма различна. Например, в мясе их 1822%, рыбе - 17 - 20%, яйце - 20-36%.

Важность информации о количественном содержании белков связана с определением потенциальных возможностей продуктов питания в покрытии физиологических потребностей организма человека, норма которых составляет около 100 г белка в сутки.

Белки сами по себе не являются незаменимыми компонентами пищи человека. Для нормального питания и полдержания здоровья необходимы содержащиеся в них незаменимые аминокислоты, обязательность наличия которых в пищевых рационах связана с тем, что они не синтезируются животными организмами. В связи с этим весьма важно их качественное и количественное соотношение. Белки, содержащие все незаменимые аминокислоты, называют полноценными. Если в белке нет хотя бы одной незаменимой аминокислоты, то он считается неполноценным.

Большинство белков мяса относится к полноценным, что делает их обязательным компонентом пищи.

В состав мяса и мясопродуктов входят простые и сложные белки, в том числе водо-, соле-и щелочерастворимые, обеспечивающие, например, такие важные функции, как удержание воды, набухаемость и растворимость, а также сложные белки-пигменты, отвечающие за цвет продукта. Белки различаются не только химическим и пространственным строением, но и размерами частиц, а также формой молекул. Последняя включает две группы--фибриллярные и глобулярные, отличающиеся физико-химическими свойствами, прежде всего растворимостью в воде, водно-солевых растворах и водных растворах полярных растворителей, а также способностью к денатурации, гидролизу и другим превращениям.

Белки мяса и мясопродуктов принято разделять по морфологическому признаку клеток мышечных тканей животных. Саркоплазматические, миофибриллярные белки и белки стромы обеспечивают функциональность пищевой системы в получении мясопродуктов, а группа ядерных белков самостоятельного технологического значения не имеет.

В аналитической практике известно достаточно много методой определения белков. Наиболее распространены метод Кьельдаля и его известные модификации, основанные на минерализации проб и количественном определении азота.

Получившие в последнее время распространение ускоренные фотометрические методы имеют существенные преимущества (простота и быстрота выполнения) по сравнению с классическим методом Кьельдаля, что позволяет использовать эти методы для массовых анализов и проведения оперативного контроля качества сырья и готовой продукции по содержанию белка.

Фотометрические методы включают в себя:

9 метод Лоури;

9 биуретовый метод;

9 методы, основанные на связывании красителей белками;

9 методы УФ-спектроскопии.

Эти методы весьма перспективны, особенно для однородных систем, и основаны на непосредственном фотометрировании пробы.

К высокоточным методам относятся хроматографические.

Хроматография -метод разделения смесей газов, жидкостей, растворенных веществ путем сорбции в динамических условиях. В простейшем варианте разделение происходит при прохождении потока анализируемой смеси через колонку, содержащую сорбент. Вследствие различной сорбируемости компонентов смеси достигается их разделение по высоте сорбента при повторяющихся циклах сорбция -- десорбция.

Известно несколько подходов к классификации методов хроматографии с использованием различных признаков:

¦ по средам, в которых проводится разделение (жидкостная, газожидкостная, газовая);

¦ по механизму разделения (молекулярная или адсорбционная, ионообменная, осадочная, комплексообразовательная, окислительно-восстановительная);

¦ по форме проведения процесса (колоночная, капиллярная, хроматография на бумаге и в тонком слое);

¦ по способу проведения процесса (фронтальная, вытеснительная, проявительная).

1. Методы определения белков с предварительной минерализацией проб

Метод определения белков в пробах, минерализованных по Къельдалю (арбитражный метод)

Классическим методом определения массовой доли белков в мясе и мясопродуктах является метод Кьельдаля, предложенный для определения общего азота в различных материалах в 1883 г. Почти за целое столетие его применение появилось много модификаций, во многих из которых сохранились все основные стадии оригинального метода Кьельдаля - минерализация, отделение аммиака дистилляцией и титрование.

Минерализацию проводят нагреванием навески с концентрированной кислотой в присутствии катализатора (сульфатная смесь или перекись водорода). Выделившийся аммиак вступает в реакцию с избытком концентрированной серной кислоты с образованием сульфатом аммония:

NH3+ H2 SO4 > (NH)2SO4

Для выделения аммиака сульфат аммония разлагают концентрированным гидроксидом натрия:

(NH)2SO4+ 2NaOH > NH3+ 2 H2O + Na2 SO4

Выделившийся аммиак поглощается титрованными растворами серной кислоты:

NH3 + H2 SO4 > (NH)3SO4

Метод проводят на специальной установке, представленной в приложении 1.

Избыток серной кислоты оттитровывают гидроксидом натрия и по количеству связанной кислоты вычисляют количество поглощенного аммиака или соответствующее ему количество азота.

В группе методов определения суммарных белков в животных тканях на основе минерализации проб основное время занимает минерализация пробы, продолжительность которой благодаря подбору эффективных катализаторов составляет 2 - 2,5 ч.

Часто массовую долю белка в тканях и продуктах определяют по массовой доле азота, которая является характерным показателем элементарного состава белков. Массовая доля азота для многих белков близка к 16 %, поэтому массовое содержание белковых веществ вычисляют, умножая полученную массу азота на коэффициент 6,25, который получают путем деления: 100/16=6,25. Для определения массового содержания белков соединительной ткани пользуются коэффициентом 5,62, принимая во внимание, что массовая доля азота в коллагене 17,8%. При использовании метода небелковый азот продуктов не учитывается.

Подготовка проб осуществляется следующим образом. Исследуемые образцы тщательно измельчают (ножом или на мясорубке). В колбу Кьельдаля вместимостью 50 см³ вносят 0,2 см³ сыворотки крови или взвешивают на аналитических весах 0,15-0,2 г ткани (мышц, сухожилий, почек, печени и др.) при помощи кусочка стекла навеску опускают на дно колбы. Добавляют 1-2 см³ концентрированной серной кислоты, 1г смеси сульфата меди и сульфата калия в качестве катализатора. Содержимое колбы нагревают до получения коричневой окраски, колбу снимают с огня, охлаждают при комнатной температуре, добавляют 2-3 см³ раствора пероксида водорода с массовой долей 30% и продолжают нагревать до получения бесцветного минерализата. Последний используют для количественного определения белка.

Минерализат охлаждают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 см³, объем доводят до метки дистиллированной водой, содержимое перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 5 см³ полученного раствора минерализата, повторно доводят объем до метки дистиллированной водой. Для проведения цветной реакции 1см³ вторично разбавленного минерализата вносят в пробирку, добавляют последовательно 5 см³ реактива 1 и 5см³ реактива 2, содержимое пробирки перемешивают. Одновременно готовят контрольный раствор, используя при этом контрольный минерализат (проба с использованием дистиллированной воды). Через 30 мин определяют оптическую плотность растворов на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром. Измерение проводят в сравнении с контрольным раствором.

Для построения калибровочного графика используют стандартный раствор сульфата аммония, для приготовления которого берут 0,236г сульфата аммония. Предварительно высушенного до постоянной массы при температуре 60⁰ С, вносят в мерную колбу вместимостью 500 см³, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до метки. Этот раствор является стандартным и содержит 0,1 мг азота в 1 см³.

В мерные колбы вместимостью по 100 см³ вносят следующие объемы стандартного раствора (см³) 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0. После доведения объемов растворов в колбах дистиллированной водой до метки получают серию рабочих растворов концентрацией 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0 мкг азота в 1 см³.

Для проведения цветной реакции в пробирки помещают по 1 см³ рабочего раствора, добавляют 5 см³ реактива 1 и 5 см³ реактива 2, перемешивают и через 30 мин измеряют величину оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 625 нм или на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром с толщиной поглощающего свет слоя 1 см по отношению к контрольному опыту. Опыт повторяют 3 раза. Для каждого определения готовят стандартный раствор.

По полученным средним данным из трех стандартных растворов строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс концентрацию азота (С, мкг/см³), а на оси ординат соответствующую ей оптическую плотность (Д) при длине волны 750 нм. Калибровочный график должен проходить через начало координат.

По полученной величине оптической плотности с помощью калибровочного графика определяют концентрацию азота.

Массовая доля белка рассчитывается по формуле

Х = [С * 250 * 100 / (m * 5 * 1 * 10)] * (100 * 6,25),

где С -концентрация азота, найденная по калибровочному графику, мкг/см³; 250 - объем минерализата после первого разведения, см³; 100 - объем минерализата после вторичного разведения, см³; m -масса навески, г; 5 -объем разбавленного минерализата для вторичного разведения, см³; 1 - объем раствора, взятого для проведения цветной реакции, см³; 10 -множитель для перевода в проценты; 6,25 - коэффициент для пересчета на белок.

2. Метод определения массовой доли белка по Джаромилло (экспресс-метод)

Метод основан на минерализации органических соединений с последующим определением азота по количеству образовавшегося аммиака. Навеску сырого продукта минерализуют в специальной металлической гильзе при нагревании со смесью уксуснокислого натрия и едкого натра. Выделившийся при этом аммиак количественно поглощается 0,1н раствором серной кислоты. Оставшееся количество ее оттитровывают 0,1 н раствором едкого натра. Навеску мяса 0,1г помещают в гильзу из алюминиевой фольги. Используют обычную оберточную бумагу, придав ей форму пробирки или пишущей ручки. На навеску в гильзу насыпают 3г уксусно-кислого натрия и 1,5г порошкообразного едкого натра. Фольговую гильзу закрывают и опускают в специальную сухую латунную гильзу, завинчивающуюся герметически крышкой с двойной резьбой. Гильза имеет отводную трубку, к которой присоединяется стеклянная трубка с расширением, заполненная фильтром из стеклянной ваты. Конец стеклянной трубки, в виде шарика с отверстием, погружают в химический стакан, в котором предварительно налито 15 мл 0,1н раствора серной кислоты и добавляют 4-5 капли смешанного индикатора Таширо (содержимое приобретает фиолетовую окраску).

После герметизации собранной системы латунную гильзу помещают на электрическую плитку, оборудованную металлическим кожухом-держателем, чтобы гильза не теряла вертикального положения. Процесс минерализации продолжается 30-45 мин. Поглотительный раствор серной кислоты несколько мутнеет, т.к. в него выделяются газы в результате минерализации белка. Сжигание считается законченным, когда пузырьки газа перестанут выделяться из трубки. Систему разъединяют, стеклянную трубку промывают дистиллированной водой, собирая промывные воды в тот же приемник. Содержимое стакана титруют 0,1 н раствором едкого натра до момента перехода фиолетового цвета в зеленый. Расчет производится по формуле

Х = [(А-а) * 1,4 * к / (Д * 1000)] * 100,

где Х -количество белка в мясе, г; А - объем 0,1 н раствора серной кислоты, взятой для поглощения аммиака, мл; а - количество 0,1н раствора едкого натра, израсходованного на титрование оставшейся 0,1н серной кислоты, в мл (должны быть учтены коэффициенты поправки на титр); 1,4 - коэффициент пересчета на азот;

к - коэффициент пересчета азота на белок: 6,25- при превалировании в рационе животного белка, 6,0 -при превалировании растительного белка;

Д - масса, взятая для анализа, г (навеска 0,1 г - мясо и колбасные изделия, 0,05 г - яичный порошок и кормовая мука).

3. Методы определения белков без предварительной минерализацией проб

При определении массовой доли белков в образцах мышечной ткани методом Лоури, биуретовым методом или методом, основанном на связывании красителей белками, осуществляют подготовку проб.

Подготовка проб: предварительно исследуемый образец тщательно измельчают сначала ножом на часовом стекле или на мясорубке, а затем на гомогенизаторе.

После этого для приготовления щелочного экстракта 15г гомогенизированного образца взвешивают в колбе вместимостью 100 мл, прибавляют 20 мл дистиллированной воды и 10 мл раствора гидроксида натрия молярной концентрацией 1 моль/л. С помощью воды суспензию переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят до метки дистиллированной водой и хранят 12 ч в холодильнике. После этого 75 мл экстракта (из верхней части колбы) фильтруют через смоченный дистиллированной водой бумажный фильтр диаметром 15 см, удаляя первые 15 мл фильтрата.

4. Метод определения массовой доли белка по Лоури (экспресс-метод)

Метод Лоури основан на реакции взаимодействия фенольного реактива Фолина--Чокалтеу с щелочными растворами белков, приводящей к образованию продуктов реакции синего цвета. Интенсивность окраски зависит от содержания в исследуемом белке тирозина и триптофана. Оптическую плотность окрашенных растворов измеряют при длине волны 750 нм. Метод рекомендуется для определения массовой доли белка в сильно разбавленных растворах, при наблюдении за ходом ферментативных процессов, для определения белков сыворотки крови, яичного альбумина, белков молока, фракционированных растительных белков, белков митохондриальных фракций и мембран.

* Метод Лоури в модификации Дэвини и Гергей

К 0,2 мл исследуемого раствора, содержащего 5-100 мкг белка, прибавляют 1 мл реактива С, смешивают и через 10 мин быстро вносят 0,1 мл реактива Д, встряхивают и оставляют при температуре 20±5 ⁰С на 30 мин. А затем снимают показания на спектрофотометре при л=750 нм.

Построение калибровочного графика. Содержание белка в растворе определяют по калибровочному графику, который строят с использованием раствора тирозина известной концентрации. Для приготовления стандартного раствора 20 мг кристаллического тирозина растворяют в 200 мл раствора соляной кислоты молярной концентрации 0,2 моль/л. Калибровочный график строят, используя растворы тирозина с рекомендуемой массовой концентрацией, представленные в таблице 2.

По результатам определения строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс концентрацию стандартных растворов (мкг/мл) тирозина, а на оси ординат - значения оптической плотности при 750 нм. По графику находят концентрацию тирозина, которая соответствует найденной оптической плотности.

Таблица 2

Растворы тирозина с рекомендуемой массовой концентрацией

* Метод Лоури в модификации Ластыть

В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 2-5 мл щелочного экстракта белков образца, приготовленного в соответствии с прописью подготовки проб, прибавляют 15 мл раствора тартрата калия - натрия молярной концентрацией 1 моль/л и доводят объем дистиллированной водой до метки. В зависимости от массового содержания азота для фотометрического определения используют 0,2 мл приготовленного раствора. Объем доводят до 10 мл с помощью реактива А. по истечении 30 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при л=750 нм. Для определения содержания азота строят калибровочный график.

5. Определение массовой доли белка биуретовым методом (экспресс-метод)

Биуретовый метод основан на образовании синефиолетовой окраски при воздействии на белки сульфата меди в присутствии щелочи. Природа белка почти не влияет на формирование окрашенного биуретового комплекса, который возникает за счет присоединения ионов меди к пептидным связям белка. Оптическую плотность окрашенных растворов измеряют при длине волны 540 нм. Преимущества метода -- возможность применения стандартного белка для построения калибровочною графика, воспроизводимость и точность.

Щелочной экстракт белков объемом 2 мл смешивают с 15 мл биуретового реактива. После 30 мин инкубирования смеси при 37 ⁰С, проводят спектрофотометрирование при л=550нм.

Контрольный опыт готовят аналогично, используя вместо образца 1 мл дистиллированной воды.

Построение калибровочного графика. Для построения графика готовят ряд последовательных разведений стандартного раствора белка, в качестве которого используют кристаллический сывороточный альбумин: 0,01г белка растворяют в 100 мл дистиллированной воды, отбирают 1 мл и доводят объем до 10мл и т.д.

С пробами из каждого разведения белка проводят биуретовую реакцию в условиях, соответствующих описанию метода, и измеряют оптическую плотность окрашенных растворов. Затем строят график D=f(с).

6. Определение массовой доли белка методами, основанными на связывании красителей (экспресс-метод)

Методы определения массовой доли белка по связыванию красителей основаны на способности белков при рН ниже изоэлектрической точки (рН 2--4) присоединять кислые красители с образованием нерастворимых комплексов, после удаления которых, измеряют оптическую плотность исходного раствора красителя относительно полученного раствора (фильтрата). Оптическая плотность фильтрата уменьшается сувеличением массовой доли белка.

Методы рекомендуются для количественного определения белка в образцах сырого мяса, а также в продуктах кулинарной степени готовности после различных видов тепловой обработки (варки, запекания, копчения и т. д).

* Метод с использованием амидочерного 10В

Для проведения анализа смешивают 2 мл щелочного экстракта, содержащего мясные белки, с 25 мл раствора красителя амидочерного 10В.

После проведения цветной реакции в течение 1 ч раствор центрифугируют в течение 10 мин при 100 с^-1. Абсорбцию прозрачного супернатанта определяют на спектрофотометре при л=615 нм. Массовую долю белка определяют по калибровочному графику.

* Метод с использованием оранжевого кислого 12

К навеске пробы, содержащей около 4г белка, добавляют из мерной колбы 250 см³ раствора лимонной кислоты концентрацией 0,1 моль/дм³ и гомогенизируют в течение 2--3 мин. Лимонная кислота, употребляемая для эмульгирования белков мяса, облегчает связывание кислого красителя белками.

Взвешивают 2-4г разбавленного образца с точностью до 0,01гв 50 -миллилитровые поликарбонатные центрифужные пробирки, добавляют воду до 5г, применяя градуированную пипетку, а затем 25 см³ раствора красителя, закрывают пробкой и энергично встряхивают. Оставляют на 30 мин или дольше для взаимодействия красителя с белком и агрегации образовавшихся комплексов. Если смесь мутная, то ее центрифугируют и фильтруют. Определяют концентрацию свободного не связаного красителя, измеряя абсорбцию при л= 475 нм.

Анализ удобно проводить в специальной проточной кювете с толщиной светопоглощающего слоя 0,75 мм. Для расчета используют стандартный график, который строят на основе анализа мяса методом Кьельдаля того же состава, что и анализируемый образец. Это связано с тем, что содержание ионогенных групп аминокислот в разных белках различно.

7. Определение массовой доли белка методами, УФ-спектрофотометрии (экспресс-метод)

Методы УФ-спектроскопии основаны на способности белковых растворов поглощать свет при длине волны около 280 нм благодаря присутствию в структуре белков аминокислот триптофана, тирозина и фенилаланина. Результаты определения прямо пропорциональны содержанию этих аминокислот в белках. Преимущества метода -малая трудоемкость, несложная подготовка проб, быстрота и простота анализа; предел чувствительности 10-20 мкг/см³. Методы рекомендуются для количественной опенки содержания белков в элюатах после разделения белковых смесей методом электрофореза или хроматографии, определения белков в мясных, яичных и бобовых продуктах.

* Метод определения массовой доли белка в говядине

Порядок проведения анализа. Образец массой 15г гомогенизируют с 250 см³ раствора лимонной кислоты молярной концентрацией 0,1 моль/дм³ в гомогенизаторе в течение 2-3 мин.

К гомогенизированной порции (в пробирке) прибавляют 9,5 см³ раствора мочевины молярной концентрацией 8 моль/дм³ в растворе гидроксида натрия молярной концентрацией 2 моль/дм³, встряхивают, центрифугируют при частоте вращения 83 с^-1 в течение 7 мин для отделения жира и измеряют оптическую плотность при л = 243 нм. Массовую долю белка определяют, используя калибровочный график или уравнение регрессии, для чего предварительно определяют массовую долю белка по методу Кьельдаля. Уравнение регрессии, например, для соленой говядины имеет вид у= 17,32*х+1,025, гдеу -массовая доля белка, %; х -оптическая плотность (х = D при л = 243 нм).

массовый белок хроматография говядина

Список литературы

1. Антипова Л.В., Глотова И.А., Рогов И.А. /Методы исследования мяса и мясных продуктов. М. Изд-во «Колос». 2001.

2. Забалуева Ю.Ю., Павлова С.Н., Лескова С.Ю./ Методы исследования мяса и мясных продуктов/ Лабораторный практикум. Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2005.

3. Рогов И.А., Забашта А.Г., Казюлин Г.П. Общая технология мяса и мясопродуктов. Книга-1. М.: Колос, 2009.

Размещено на Allbest.ru