Интернет-журнал «НАУКОВЕДЕНИЕ» Том 7, №2 (март - апрель 2015) http://naukovedenie.ru publishing@naukovedenie.ru

Размещено на http://www.allbest.ru/

1

http://naukovedenie.ru 31TVN215

Размещено на http://www.allbest.ru/

Методика подбора биоцидных препаратов для борьбы с биодеструкцией, вызванной сообществом микромицетов

Биодеструкция строительных материалов и конструкций приносит значительный ущерб здоровью работающих и контактирующих лиц, экономические потери, может быть причиной техногенных аварий, а также негативно влияет на окружающую среду [1]. Наиболее агрессивными биодеструкторами технофилами являются микроскопические грибы (микромицеты) [2].

Причинами широкого распространения микромицетов биодеструкторов является их способность к активной колонизации техногенных объектов. Этому зачастую способствуют как естественные, так и искусственные причины. К естественным причинам можно отнести высокую устойчивость к колебаниям температуры, влажности, адаптивные возможности в отношении питательных субстратов, свойственные микромицетам, а также их доминирующее положения среди всех остальных биодеструкторов. Искусственные причины связаны с антропогенной деятельностью, к которым относятся протечки, нарушения в системах вентиляции, кондиционирования, минеральные и органические загрязнения, включая запыленность [3].

Чаще других среди биодеструктивных микромицетов встречаются грибы классов Deutoromycetes, Asco-mycetes, Zygomycetes, Basidiomycetes и др. Самая многочисленная группа включает грибы из класса Deutoromycetes, родов Aspergillus и Penicillium, Trichoderma, Mucor, Cladosporium, Scopulariop sis, такие как: Aspergillus fumigatus, A. terreus, A. niger, A. versicolor, A. flavus, A. luteus, Penicillium glaucum, P. chrisogenum, P. purpuro-genum, P. funiculosum, P. citronum, P. ochrochloron, P. rugulosum, Cladosporium sp., Trichoderma viride, Trichoderma sp., Mucorrace mo-sus, Mucor raminanus, Scopulariopsis breuicaulis и др. [2].

Химические методы защиты от биодеструкции занимают ведущее место среди прочих методов и отличаются наибольшей эффективностью действия при защите материалов, изделий, сооружений и других объектов. Эти методы осуществляются с использованием веществ, получаемых преимущественно методами химического синтеза и называемых биоцидами или антисептиками, а по отношению к грибам - фунгицидами [2].

Одно из преимуществ биоцидов заключается в том, что они могут использоваться разными способами в зависимости от защищаемого объекта - введением в состав материала при его изготовлении, методом пропитки, а также нанесением на поверхность материалов и изделий, подверженных микробному поражению [4]. Защита материалов с помощью биоцидов представляет собой обширную по масштабам и сложную в решении проблему.

Одной из основных причин недостаточной эффективности борьбы с биодеструкцией, вызванной микромицетами, является адаптация микромицетов к биоцидным средствам.

Приобретенная резистентность у микромицетов может быть перекрестной и множественной. В перекрестной различают два типа: положительную, при которой появляется устойчивость к двум или нескольким веществам, и отрицательную, при которой повышение устойчивости к одному веществу сопровождается повышением чувствительности к другому. Оба типа обусловлены одним генетическим фактором [2].

В настоящее время выявлено много факторов адаптации грибов к фунгицидам, но даже полной деградации ими потенциально ядовитых соединений. В качестве примера может быть деструкция грибами ртутных препаратов, хлорированных фенолов, нафталина. Возникающая при этом потеря эффективности обусловливает необходимость увеличения загрязнения среды и ставит задачу поиска новых фунгицидов [5].

Следующая причина неэффективности применяемых биоцидов заключается в том, что, как правило, в разрушении строительных материалов принимают участие сообщества микроорганизмов. Причем, одни виды могут разрушать защитный слой, а другие - основной материал конструкции. В сообщества могут входить микроорганизмы, которые не принимают непосредственное участие в разрушении строительных материалов, но играют важную роль в жизнедеятельности сообщества и способствуют накоплению общей биомассы [6].

В любых не лабораторных условиях, включая и техногенную среду обитания жизнедеятельность микроорганизмов, в том числе и микромицетов протекает именно в сообществах. В них они проявляют несколько иные свойства, нежели при культивировании их в монокультуре, в искусственных условиях, в изоляции от других членов сообщества. Поэтому зачастую препараты, протестированные в лаборатории на культурах, вызывающих биодеструкцию, не действуют на те же культуры в естественной среде.

К настоящему времени имеется достаточно много исследований, подтверждающих факты повышенной выживаемости микроорганизмов в сообществах при воздействии на них доз биоцидных средств, определенных классическими методами на изолированных культурах [7].

Существующий регламент тестирования активности биоцидов в отношении биодеструкторов микромицетов не предполагает учета разницы свойств культур в сообществах и в монокультурах. Что, в конечном итоге, может приводить к неэффективности мероприятий по предупреждению биодеструкции, вызванной микромицетами.²

Цель исследования: разработка методики подбора биоцидных препаратов для ликвидации очагов биодеструкции, вызванной сообществом микромицетов.

Объект исследования: участки биодеструкции строительных материалов и конструкций; материал, полученный при проведении обследования: смывы, соскобы с поверхностей, пораженных микромицетами, выделенные и идентифицированные культуры микромицетов.

Проведение эксперимента и анализ полученных результатов

Исследования проводились в соответствии с методиками РВСН 20-01-2006 (ТСН-20303-2006) «Защита строительных конструкций, зданий и сооружений от агрессивных химических и биологических воздействий окружающей среды», принятые и введенные в действие распоряжением Комитета по строительству Правительством Санкт-Петербурга 6 января 2006 года.

При визуальном обследовании были выявлены участки биоповреждений, проведена их фотофиксация, определена степень биоповреждения: преимущественно отмечались III-IV степень. Причинами данного биоповреждения предположительно была определена массированная глубокая биодеструкция, вызванная микромицетами.

При проведении микологического исследования проб указанных участков были получены следующие результаты:

1. По частоте встречаемости на первом месте стоят микромицеты рода Chaetomium sp. (5 из 7 участков) Peniccilium sp. (4 из 7 участков), Aspergillus sp. (3 из 7 участков). Далее следуют Phoma sp. (1 из 7 участков), Exophiala sp. (1 из 7 участков). Также в исследуемых пробах на 1-ом из 7-ми участков встречались микромицеты родов Acremonium sp., Aureobasidium sp., Verticillium sp., Rhodotorula sp.

2. Количественная оценка проводилась путем подсчета колоний микромицетов в КОЕ (колониеобразующих единицах) на единицы массы и объема исследуемых проб. В максимальной концентрации в соскобах встречались следующие микромицеты: Peniccilium sp - 12000 КОЕ/г, Chaetomium sp. - 8000 КОЕ/г, Phoma sp - 3000 КОЕ/г, Aspergillus sp. - 800 КОЕ/г.

3. В максимальной концентрации в смывах встречались следующие микромицеты:

Peniccilium sp - 1800 КОЕ/1 кв. дм., Aspergillus sp. - 600 КОЕ/1 кв. дм., Phoma sp. - 500 КОЕ/1 кв. дм., Chaetomium sp. - 500 КОЕ/1 кв. дм.

В таблице 1 представлено распределение наиболее часто встречающих микромицетов по участкам исследования.

Таблица 1. Микромицеты, встречающиеся в очагах биодеструкции (составлено авторами)

Таким образом, результаты исследования показали наличие выраженного биодеструктивного поражения микромицетами, находившимися преимущественно (в 5 из 7 случаях) - в сообществах.

Следует отметить, что при подборе биоцидных препаратов, при оценке их эффективности, а также при оценке биостойкости материалов, из которых выполнены конструкции, это обстоятельство не учитывается. Действующие нормативные документы регламентируют порядок определение выше названых характеристик биоцидного средства по отношению к отдельным выделенным штаммам микромицетов.

Целью наших дальнейших исследований было установить - имеются ли различия реакций на это средство микромицетов находящихся в монокультуре и в смешанном сообществе, а также предложить удобный, наглядный, наименее затратный, но в тоже время информативный метод определения чувствительности / устойчивости микромицетов к биоцидным препаратам.

За основу методики проведения эксперимента нами был взят широко известный метод дисков (диско-диффузионный метод) [8]. Этот метод является более простым, экономичным, чем метод серийных разведений, который является более точным. Однако для исследования чувствительности / устойчивости смеси культур метод серийных разведений менее пригоден, в том числе и с технической точки зрения. Диско-диффузионный метод используется в основном для бактериологических исследований как моно, так и смешанных культур. Мы считаем, что данный метод можно использовать и для аналогичных исследований в микологии, что является одной из задач настоящего эксперимента.

Следует отметить, что в доступных нам источниках информации, использование диско-диффузионного метода при оценке устойчивости / чувствительности микромицетов к биоцидным препаратам не приводится. Однако при бактериологических исследованиях он используется давно и в разных направлениях, наряду с методом серийных разведений. Так регламентированный подбор антибиотиков проводится именно методом дисков, который чаще всего называется методом стандартных дисков.

В то же время в микологических исследованиях описано использование метода дисков для оценки чувствительности / устойчивости микромицетов к лечебным препаратам. Описана методика приготовления дисков, приготовления культур, оценки полученных результатов.

За основу были взяты описанные исследования [9, 10] и модифицированы в соответствии с поставленными задачами.

Методика проведения опытов с использованием дисков заключалась в следующем. В чашки Петри, расположенные на строго горизонтальной поверхности, наливали 20 мл расплавленной среды, подсушивали 40-60 минут при комнатной температуре с приоткрытыми крышками, после чего на поверхность агара наносили одномиллиардную взвесь культуры микромицета, либо смесь нескольких монокультур, приготовленную на изотоническом растворе хлорида натрия смывом агаровой культуры. Чашки снова подсушивали 15-20 минут, затем на поверхность засеянной среды накладывали диски с биоцидным препаратом различной концентрации. В качестве биоцидного препарата был использован HG хлор, который широко применяется для устранения биодеструкции строительных материалов и конструкций. Чашки в перевёрнутом виде инкубировали несколько суток до появления визуального роста при температуре 25-28°С. Зоны угнетения роста культур измеряли линейкой с точностью до 1 мм, рассчитывали средние арифметические зон и их стандартные ошибки. При разработке методики определения чувствительности грибов к биоцидному препарату в различных концентрациях, диско-диффузионным методом использовали статистическую обработку экспериментальных данных по Стьюденту [11].

Для проведения эксперимента были приготовлены чашки Петри со средой Сабуро, взвеси культур микромицетов, диски с биоцидным препаратом из картона, применяемого для промышленного выпуска дисков с антибиотиками (ГОСТ 6722-75 «Картон фильтровальный технический. Технические условия» ПО «Кировбумпром»). Диски были пропитаны следующими концентрациями биоцидного препарата: 1 - рабочая концентрация; 2 - 1/2 рабочей концентрации; 3 - 1/5 рабочей концентрации; 4 - 1/10 рабочей концентрации; 5 - 1/50 рабочей концентрации; 6 - 1/100 рабочей концентрации для установления диапазона чувствительности / устойчивости исследуемых культур. Рабочая концентрация определялась по рекомендации производителя биоцидного препарата - 0,5% раствор. В качестве контроля чистоты эксперимента использовались диски с дистиллированной водой и контрольные чашки Петри со стерильным физиологическим раствором, наносимым вместо взвеси культуры микромицетов. В таблице 2 и на рисунках 1, 2 представлены результаты эксперимента.

Таблица 2. Зоны задержки роста, как показатели устойчивости микромицетов к биоцидному препарату (составлено авторами)

Рисунок 1. Зависимость устойчивости / чувствительности монокультур и сообществ микромицетов от различных концентраций биоцидного препарата (составлено авторами)

Рисунок 2. Зависимость устойчивости / чувствительности монокультур и сообществ микромицетов от различных концентраций биоцидного препарата (составлено авторами)

Количественная оценка полученных результатов проводится в соответствии с оценкой бактерицидной активности дезинфицирующих средств, заключающейся в подсчете числа выросших колоний для построения графика зависимости между зоной задержки роста бактерий и количеством выросших колоний после их взаимодействия с дезинфицирующими средствами, по графику, с использованием карты Шухарта, согласно ГОСТ 50779.42-99 «Статистические методы. Контрольные карты Шухарта».

Проведенный эксперимент подтверждает предположение о вариации чувствительности / устойчивости культур микромицетов к биоцидным препаратам, связанной с моно или совместным сосуществованием. Причем в ряде случаев микромицеты в смеси могут проявлять большую чувствительность, а в ряде случаев - большую устойчивость.

Эти данные позволяют сделать вывод о необходимости исследования воздействия биоцидных препаратов при их подборе и определении доз, не только на отдельные виды микромицетов, полученные при обследовании биодеструкции, но и на их сообщества.

Причиной распространения биодеструкции является наличие комплекса благоприятных условий для жизнедеятельности биодеструкторов технофилов. Микромицеты относятся к основным биодеструкторам, оказывающим негативное воздействие на здоровье людей, состояние конструкций, механизмов и прочего оборудования. Биоповреждения, вызываемые микромицетами, наносят значительный экономический ущерб во всех областях человеческой деятельности, оказывают негативное воздействие на окружающую среду и здоровье человека.

Для устранения и предупреждения биодеструкции, вызванной микромицетами применяются регламентированные методики, преимущественно включающие химические и физические методы, а также механическую очистку поврежденных участков. При определении чувствительности микромицетов к биоцидным препаратам не учитываются их существование в микробном сообществе в среде обитания, что может являться причиной недостаточной эффективности этих препаратов. Микромицеты, вызывающие биодеструкцию проявляют вариации чувствительности / устойчивости в зависимости от развития в монокультуре или в сообществе с другими культурами. Исследования чувствительности / устойчивости микромицетов к биоцидным препаратам можно осуществлять диско-диффузионным методом. Особенно это показано в случаях трудно устраняемых биодеструктивных процессов, вызванных множественными смешанными сообществами.

Литература

биодеструкция строительный биоцидный

1. Редько А.А., Старцев С.А., Ахметзянов И.М. Биоповреждения зданий, сооружений и других материальных объектов как причина серьезных экономических потерь и возможного социального недовольства населения // Проблемы окружающей среды и природных ресурсов. Обзорная информация. ВИНИТИ, 2005. Вып. 11.13 с. 2. Сухаревич В.И. и др. Защита от биоповреждений, вызываемых грибами/ В.И. Сухаревич, И.Л. Кузикова, Н.Г. Медведева. - СПб: ЭЛБИ-СПб, 2009. - 207 с.: ил.

3. Копытенкова О.И., Шилова Е.А., Сазонова А.М. Особенности биоповреждений подземных объектов и необходимой охраны труда // Технологии техносферной безопасности: Интернет-журнал. - Вып. 6 (58). - 2014. - http://ipb.mos.ru/ttb.

4. Ерофеев В.Т. и др. Микробиологическое разрушение материалов/ В.Т. Ерофеев, В.Ф. Смирнов, Е.А. Морозов. - М.: Высшая школа, 2008. - 124 с.

5. Власов Д.Ю. и др. Микодеструкция строительных и отделочных материалов внутри помещений / Д.Ю. Власов, Ю.И. Рябушева, Е.В. Сафронова, С.А. Старцев, В.А. Крыленков // Проблемы медицинской микологии. 2006. Т.8, №2. С. 26.

6. Старцев С.А. Проблемы обследования строительных конструкций, имеющих признаки биоповреждений // Инженерно-строительный журнал. 2010. №7. С. 41-46.

7. Клеточные сообщества / Под ред. В.В. Теца. - Спб: СПбГМУ, 1998. - 221 с.

8. Медицинская микробиология // под ред. акад. В.И. Покровского и проф. О.К. Поздеева - М.: ГЕОТАР Медицина, 1998.

9. Посоюзных О.В., Катаева Л.В., Корначев А.С. Способ количественной оценки бактерицидной активности дезинфицирующих средств: пат. №2510610 Российская Федерация. 2014. Бюл. №10.

10. Тец Г.В., Тец В.В. Способ определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным веществам: пат. №2505813 Российская Федерация. 2014. Бюл. №3.

11. Шилова Е.А., Сазонова А.М. Причины недостаточной эффективности использования биоцидных препаратов для борьбы с биодеструкцией, вызванной микромицетами /// Техносферная и экологическая безопасность на транспорте: тезисы докладов Четвертой международной научно - практической конференции «Тэбтранс-2014». - СПб: Петербургский гос. ун-т путей сообщения Императора Александра I, 2014. С. 63-65.

Размещено на Allbest.ru