Метод ИК-спектроскопии и его применение

Размещено на http://www.allbest.ru

Содержание

Введение
1. Сущность ИК-спектроскопии как метода анализа
2. Метод ИК-спектроскопии и его применение
2.1 Теоретические основы ИК-спектроскопии 2.2 Способы изображения ИК-спектров 2.3 Качественный и количественный анализ по ИК-спектрам
3. Аппаратура, используемая в методе
4. Методика проведения анализа с полученными спектрами образцов
4.1. Качественный анализ
4.2. Количественный анализ
5. Перспективы развития метода
Заключение
Список литературы

Введение

На современном этапе развития фармацевтической химии существует большое количество методов качественного и количественного анализа.

Помимо чисто химических, большой популярностью пользуются физические и физико-химические методики.

Среди физических методик выделяют: электрохимические, - оптические и спектральные; хроматографические.

Бурное развитие физико-химических методов анализа было вызвано тем, что классические методы химического анализа (гравиметрия, титриметрия) уже не могли удовлетворять многочисленные запросы химической, фармацевтической, металлургической, полупроводниковой, атомной и других отраслей промышленности, требовавших повышения чувствительности методов до 10-8 - 10-9 %, их селективности и экспрессности, что позволило бы управлять технологическими процессами по данным химического анализа, а также выполнять их в автоматическом режиме и дистанционно.

Ряд современных физико-химических методов анализа позволяют одновременно в одной и той же пробе выполнять как качественный, так и количественный анализ компонентов. Точность анализа современных физико-химических методов сопоставима с точностью классических методов, а в некоторых, например, в кулонометрии, она существенно выше.

Целью работы является ознакомление с различными физико-химическими методами анализа во внутриаптечном контроле лекарственных средств.

Задачи работы:

- рассмотреть классификацию физико-химических методов;

- указать кратко сущность каждой методики, привести примеры;

- выбрать один из методов и рассмотреть более подробно.

1. Классификация физико-химических методов анализа

В основу классификации физико-химических методов анализа положена природа измеряемого физического параметра анализируемой системы, величина которого является функцией количества вещества. В соответствии с этим все физико-химические методы делятся на три большие группы:

- электрохимические;

- хроматографические.

- оптические и спектральные;

Электрохимические методы анализа основаны на измерении электрических параметров: силы тока, напряжения, равновесных электродных потенциалов, электрической проводимости, количества электричества, величины которых пропорциональны содержанию вещества в анализируемом объекте.

Хроматографические методы - это методы разделения однородных многокомпонентных смесей на отдельные компоненты сорбционными методами в динамических условиях. В этих условиях компоненты распределяются между двумя несмешивающимися фазами: подвижной и неподвижной. Распределение компонентов основано на различии их коэффициентов распределения между подвижной и неподвижной фазами, что приводит к различным скоростям переноса этих компонентов из неподвижной в подвижную фазу. После разделения количественное содержание каждого из компонентов может быть определено различными методами анализа: классическими или инструментальными.

Оптические и спектральные методы анализа основаны на измерении параметров, характеризующих эффекты взаимодействия электромагнитного излучения с веществами: интенсивности излучения возбужденных атомов, поглощения монохроматического излучения, показателя преломления света, угла вращения плоскости поляризованного луча света и др.

2. Краткий обзор физико-химических методов

2.1 Электрохимические методы анализа

2.1.1 Сущность методик

К электрохимическим методам анализа относят: потенциометрию, ионометрию, полярографию, вольтамперометрию. В качестве примера рассмотрим потенциометрию, кулонометрия.

Потенциометрия - метод, основанный на измерении равновесных потенциалов, возникающих на границе между испытуемым раствором и погруженным в него электродом. В фармацевтическом анализе наиболее широко используется потенциометрическое титрование.

Оно основано на определении точки эквивалентности по изменению потенциала индикаторного электрода при проведении химической реакции между титрантом и определяемым веществом. Вблизи точки эквивалентности происходит резкое изменение (скачок) потенциала индикаторного электрода, если хотя бы один из участников реакции титрования является участником электродного процесса.

Виды кривых титрования приведены на рис. 1.

Рис. 1. Кривые потенциометрического титрования.

а) интегральная кривая; б) дифференциальная кривая;

2.1.2 Применение методики

Метод потенциометрии используют для определения рН (рН-метрия) и установления концентрации отдельных ионов.

В потенциометрическом титровании могут быть использованы любые известные типы химических реакций, протекающие быстро и количественно.

Широкие возможности анализа многокомпонентных смесей без разделения открывает применение неводных растворителей. Например, раздельное определение соляной и монохлоруксусной кислот невозможно в водном растворе из-за отсутствия двух скачков титрования, но его удается провести в ацетоне.

Комплексонометрическое потенциометрическое титрование используется для определения катионов металлов при титровании их комплексоном (III) (ЭДТА) с применением в качестве индикаторного соответствующего металлического электрода: титрование солей меди с медным электродом, солей цинка _ с цинковым электродом и т.д., а также ртутного электрода.

В осадительном потенциометрическом титровании индикаторными электродами служат металлические или мембранные электроды, чувствительные к определяемому иону или иону - осадителю.

Например, можно определять галогенид-ионы (Сl?, Вr?, I?) на серебряном электроде титрованием нитратом серебра. До точки эквивалентности потенциал электрода зависит от активности галогенид-ионов и серебряный электрод является электродом II рода. За точкой эквивалентности при избытке ионов серебра потенциал электрода зависит от активности собственных ионов (электрод I рода). Величина скачка зависит от растворимости осадка. Можно провести дифференцированное титрование смеси хлорид-, бромид- и иодид-ионов.

По методу осаждения могут быть также определены катионы серебра, ртути, цинка, свинца и т. д.

Метод потенциометрического титрования имеет ряд преимуществ перед прямой потенциометрией и титрованием с визуальными индикаторами: отсутствие искажения результатов за счет диффузионного потенциала; нет необходимости знать коэффициент активности определяемого иона; исключение субъективных ошибок за счет инструментального фиксирования конечной точки; возможность анализа мутных и окрашенных растворов; сравнительно легкая автоматизация; возможность дифференцированного титрования компонентов смеси, в том числе с использованием неводных растворителей. Результаты определений методом потенциометрического титрования более точны, чем при использовании прямой потенциометрии, так как вблизи точки эквивалентности небольшому изменению концентрации соответствует большое изменение потенциала индикаторного электрода.

К недостаткам потенциометрического титрования можно отнести не всегда быстрое установление потенциала после добавления титранта.

2.2 Хроматографические методы

2.2.1 Суть методики

Хроматографические методы разделения веществ основаны на их распределении между двумя фазами: подвижной и неподвижной. Подвижная фаза - жидкость и газ; неподвижная - твёрдое вещество или жидкость, адсорбированная на твёрдом носителе. Относительная скорость перемещения частиц вдоль пути разделения зависит от их взаимодействия с неподвижной фазой. Поэтому каждое вещество проходит на носителе определенный путь. Отношение пути перемещения вещества к пути перемещения растворителя есть величина постоянная, обозначаемая Rf. Она является константой для данных условий разделения и используется для идентификации ЛВ.

Различают несколько разновидностей хроматографических методов: бумажная, в тонком слое сорбента (ТСХ), газожидкостная (ГЖХ), высокоэффективная жидкостная (ВЭЖХ).

Рассмотрим более подробно один из методов - например, тонкослойную хроматографию (ТСХ).

В тонкослойной хроматографии неподвижная фаза (силикагель, оксид алюминия, целлюлоза и др.) наносится в виде тонкого слоя на стеклянную, алюминиевую или пластмассовую подложку [1].

Проведение хроматографии на тонком слое слагается из следующих операций [2]:

1) подготовки образца; 2) нанесения образца; 3) проведения хроматографического разделения; 4) обнаружения пятен (зон) хроматографируемых веществ.

Хроматография осуществляется в прямоугольных и цилиндрических сосудах, закрытых герметически пришлифованной крышкой. На дно камеры наливают систему растворителей, в которую погружают хроматографическую пластинку с нанесенными образцами.

Выявление пятен исследуемых веществ на хроматограммах происходит с помощью УФ-света или специальных реактивов.

Рис. 2 Хроматография в тонком слое

Универсальность и доступность метода тонкослойной хроматографии сделали последний одним из ведущих методов фармацевтического анализа.

Среди других хроматографических методов тонкослойную хроматографию отличают следующие достоинства и особенности [3]:

- это единственный хроматографический метод, позволяющий проводить полный анализ неизвестной смеси, поскольку исследователь имеет возможность проверить, не остались ли на старте неэлюированные компоненты;

- по производительности превосходит газовую и высокоэффективную жидкостную хроматографию, по крайней мере, на порядок; использует более простое и дешевое оборудование;

- обладает высокой селективностью, которую легко варьировать, подбирая состав подвижной фазы; в отличие от ВЭЖХ нет ограничений в выборе растворителей;

- дает возможность одновременного разделения нескольких образцов; использования однократного или многократного элюирования (при различных условиях), а также одновременного разделения компонентов одного и того же образца с помощью различных элюентов;

- возможна оптимизация разрешающей способности хроматографической системы при разделении сложной смеси только для интересующих компонентов, что позволяет экономить время;

- возможно детектирование соединений с высокой чувствительностью и селективностью, которые легко варьировать подбором проявляющего реагента; полученные результаты разделения легко оценить визуально;

- можно сохранять хроматограммы для последующего детектирования и осуществлять спектральную идентификацию хроматографических зон после разделения в любом диапазоне длин волн, включая ИК.

У ТСХ есть и некоторые недостатки [3]:

- ограниченная разделяющая способность из-за сравнительно небольшой длины разделяющей зоны (3-10 см);

- чувствительность ниже, чем в случае ВЭЖХ;

- зависимость результатов анализа от окружающей среды: относительной влажности, температуры, а также наличия загрязняющих веществ в воздухе;

- трудности в работе с образцами, имеющими высокую летучесть, а также с веществами, чувствительными к действию кислорода воздуха или света.

Особенно удобен этот метод для анализа малых количеств ядовитых и сильнодействующих веществ в прописи, когда определение их химическими методами затруднено. Этот метод применяется и для обнаружения примесей в веществе, что особенно важно в промышленном производстве постадийного контроля качества промежуточных продуктов синтеза.

В качестве сорбентов в ТСХ применяют материалы, которые отвечают следующим требованиям: образуют химически и физически стабильные слои; не образуют ковалентных связей с разделяемыми веществами; не растворяются в подвижной фазе или перемещаются вместе с ней по пластинке; не содержат компонентов, мешающих разделению или детектированию; не имеют собственной окраски; не набухают и не сжимаются под действием подвижной фазы.

В качестве подложки для сорбента используется стекло, алюминиевая фольга, полимерные пленки (полиэтилентерефталат). Для придания стабильности слоя сорбента на подложке используются различные связующие вещества: гипс (5-10%), силиказоль, силикаты щелочных металлов, полиакриламид, полиакриловый эфир, крахмал. К адсорбенту часто добавляют флуоресцентный индикатор для детектирования веществ, поглощающих в УФ-области спектра. С этой целью используют: смесь силикатов цинка и магния; смесь сульфидов цинка и кадмия; вольфраматы щелочноземельных элементов.

Большое значение, особенно для эффективности разделения, имеют такие характеристики сорбентов, как диаметр частиц, среднее распределение частиц по размерам и размер пор.

Основные типы сорбентов.

Силикагель - полярный адсорбент, содержит активные силанольные и силоксановые группы, его применяют для разделения соединений различной полярности.

Оксид алюминия - полярный адсорбент с гетерогенной поверхностью, содержит активные ОН - группы, обладает заметно выраженными протоноакцепторными свойствами; его применяют для разделения ароматических углеводородов, алкалоидов, хлоруглеводородов, стероидов.

Флоросил - основной силикат магния, занимает промежуточное положение между оксидом алюминия и силикагелем; удобен для разделения флавоноидов, стероидов и ацетилированных углеводородов.

Полиамиды - группа полярных сорбентов со смешанным механизмом разделения: карбоксамидная группа ответственна за адсорбционный механизм, метиленовые звенья - за распределительный механизм.

Эти сорбенты применяют для разделения флаваноидов, танинов, нитрофенолов, спиртов, кислот.

Модифицированные силикагели с привитыми группами (амино-, циано-, диол-), отличными по полярности.

Важной характеристикой сорбента является его активность, она зависит от содержания воды и понижается при увеличении содержания воды в сорбенте.

Для успешного разделения смесей веществ большое значение имеет выбор сорбента. В первую очередь нужно исходить из свойств разделяемых соединений: их растворимости (гидрофильности, гидрофобности), содержания и характера функциональных групп.

Насыщенные углеводороды адсорбируются слабо или совсем не адсорбируются на силикагелях и оксиде алюминия.

Введение двойных связей, особенно сопряженных, увеличивает адсорбционную способность соединений.

Функциональные группы в еще большей степени усиливают способность веществ к адсорбции.

Адсорбционная способность функциональных групп возрастает в следующем порядке [3]:

CH=CH<OCH3<COOR<C=O<CHO<SH<NH2<OH<COOH.

Растворители, применяемые в тонкослойной хроматографии, должны быть чистыми и осушенными. Смеси веществ могут разделяться с помощью одного растворителя, однако обычно применяют системы, состоящие из двух, трех и даже четырех растворителей.

Выбор растворителей определяется их элюирующей способностью, которая зависит от полярности растворителя, а также его протонодонорных и протоноакцепторных свойств.

Характеристика элюирующей способности наиболее важных для ТСХ растворителей приведена в таблицах 1 и 2 [3].

Для каждой новой пластинки систему растворителей следует готовить заново, так как в ней соотношение компонентов после хроматографирования изменяется.

Таблица 2 Значения силы растворителя для неполярных фаз

Группа (по Снайдеру)	Растворитель	Si
II III IV	Вода Метанол 2-пропанол Тетрагидрофуран Ацетонитрил	0 2,6 3,9 4,5 3,2

Существенную роль при разделении веществ с помощью тонкослойной хроматографии играет количество наносимой смеси, оно влияет и на величину Rf и на разрешение пятен.

Пробы испытуемых веществ массой от 0,1 до 50 мкг, наносят на пластинку в виде растворов в эфире, хлороформе или другом летучем растворителе.

Таблица 3 Значения силы растворителя для полярных фаз

Группа (по Снайдеру)	Растворитель	Si
I II III IV V VI VII VIII	н-Гексан н-бутиловый эфир Изопропиловый эфир 1-Бутанол 2-Пропанол 1-Пропанол Этанол Метанол Тетрагидрофуран Пиридин Метоксиэтанол Диметилформамид Ледяная уксусная кислота Формамид Дихлорметан 1,2-дихлорэтан Этилацетат Диоксан Толуол Нитробензол Хлороформ Нитрометан Вода	0 2,1 2,4 3,9 3,9 4,0 4,3 5,1 4,0 5,3 5,5 6,4 6,0 9,6 3,1 3,5 4,4 4,8 2,4 4,4 4,1 6,0 10,2

Природа растворителя может влиять на размер пятна наносимой пробы.

При нанесении пробы необходимо, чтобы: растворитель легко удалялся со стартовой зоны, и растворимость анализируемых веществ была бы не менее 0,01г/мл. Пробы наносят в виде точки или полоски длиной 5-7 мм при помощи капилляра, пипетки на 0,1 мл или микрошприца, предварительно отметив стартовую линию на расстоянии 1,5 см от края пластинки. Расстояние между отдельными пробами должно быть не менее 1 см.

После этого ждут, когда растворитель испарится, затем пластинку опускают в разделительную камеру с выбранной подвижной фазой.

В зависимости от того, в каком направлении поступает растворитель на пластинку, различают методы восходящей, нисходящей и горизонтальной хроматографии.

После разделения веществ необходимо обнаружить их на хроматограмме.

Для обнаружения бесцветных веществ, в первую очередь, следует воспользоваться физическими методами, основанными на поглощении света и флуоресценции.

Для обнаружения веществ, поглощающих в УФ-области спектра, часто применяют пластинки со слоем сорбента, содержащим флуоресцирующее вещество или опрыскивают хроматограмму после разделения смеси раствором флуоресцирующего вещества.

При облучении пластинки УФ-излучением вещества, поглощающие в этой области спектра, обнаруживаются в виде тёмных зон (пятен).

Флуоресцировать в УФ-свете способно значительное количество веществ, полученные пятна имеют при этом различный оттенок.

Для обнаружения флуоресцирующих веществ или веществ, поглощающих в УФ-области спектра, используют источники света с максимумами излучения в области 254 и 365 мкм.

Помимо оптических методов обнаружения веществ, применяют химические методы проявления хроматограмм.

К химическим методам относится использование «универсальных реагентов» и реагентов, избирательно реагирующих с определенными функциональными группами определяемых соединений.

Для количественной оценки содержания веществ в хроматографических зонах используют различные методы [2, 3]:

1. Определение с удалением хроматографической зоны с пластинки можно проводить двояким образом: переносом хроматографической зоны вместе с сорбентом либо экстрагированием хроматографической зоны со слоя сорбента.

2. Определение соединений непосредственно на пластинке методом визуального сравнения размеров площадей пятен и их окраски с соответствующими параметрами пятен стандартных образцов.

3. Метод денситометрии, повышающий точность результатов определения, основан на сканировании хроматограмм в видимом и УФ-свете с помощью «хроматографических спектрофотометров» - денситометров. Денситометры позволяют измерять поглощение света веществом на хроматограмме в режиме пропускания или отражения, а также флуоресценцию и её тушение. Режим пропускания доступен, если только исследуемое вещество имеет полосу поглощения в видимой области спектра.

В УФ-области регистрацию в режиме пропускания осуществить нельзя из-за собственного поглощения силикагеля и подложки хроматограммы.

4. Метод видеоденситометрии - сравнительно новый метод для количественной обработки хроматограмм.

Принцип метода заключается во введении изображения хроматограммы в компьютер с помощью видеокамеры или цифровой камеры с последующим сравнением интенсивностей пятен стандартных и определяемых соединений. Видеоденситометр включает осветительный блок, видеокамеру с платой видеоввода или сканер, персональный компьютер с установленной операционной системой Windows и соответствующим программным обеспечением.

Программа обработки хроматографических данных позволяет выполнять следующие функции: вводить изображения хроматограмм и сохранять их с высоким качеством и разрешением; выделять на введённом изображении хроматограммы рабочий участок, на котором будет производиться дальнейшая обработка изображения; производить автоматический или ручной поиск пятен; проводить обработку пятен, переводить их в форму хроматографических пиков, рассчитывать значения Rf и площади пиков; измерять содержание вещества в анализируемых пятнах (в относительных единицах); вводить значения концентраций для построения градуировочных зависимостей: линейной интерполяцией; линейной аппроксимацией более чем, через две точки; квадратичной интерполяцией; автоматически вычислять содержание вещества в анализируемых пятнах по введенным калибровочным значениям; представлять результаты в виде печатных документов.

5. Денситометрия с планшетным сканером с программным обеспечением для обработки хроматограмм практически не отличающимся от стандартных программ, применяемых для видеоденситометров, но существенно меньшей стоимости. При этом сканирование дает более четкое изображение хроматографических зон, что можно объяснить пониженным влиянием неравномерности освещения анализируемых объектов, чем в случае видеоденситометра.

2.2.2 Применение метода

Универсальность и доступность метода тонкослойной хроматографии сделали последний одним из ведущих методов фармацевтического анализа.

Определение подлинности пармидина в таблетках [4]. Методика. Навеску порошка растертых таблеток, эквивалентную 0,1 г пармидина, встряхивают в течение 3 минут с 20 мл спирта метилового и фильтруют.

0,002 мл полученного фильтрата (10 мкг пармидина) наносят на пластинку со слоем силикагеля F254. Рядом в качестве свидетеля наносят 0,002 мл (10 мкг) 0,5% раствора пармидина стандарта в спирте метиловом. Пластинку подсушивают на воздухе, помещают в камеру со смесью растворителей хлороформ - спирт метиловый (15 : 2) и хроматографируют восходящим методом. Когда фронт подвижной фазы дойдет до конца пластинки, ее вынимают из камеры, подсушивают на воздухе и просматривают в УФ свете при 254 нм.

Определение подлинности компонентов таблеток «Пенталгин ICN» [5](состав на одну таблетку: анальгина - 0,3 г; парацетамола - 0,3 г; кофеина - 0,05 г; кодеина фосфата 0,008 г; фенобарбитала - 0,01 г).

Методика. 0,2 г порошка растертых таблеток помещают в коническую колбу с притертой пробкой, прибавляют 0,1 мл спирта и 4 мл хлороформа и встряхивают в течение 3 минут, фильтруют через бумажный фильтр. 0,005 мл полученного раствора наносят на линию старта пластинки Kieselgel 60 F254 «Merck» размером 5 ??15 см. Рядом наносят 0,005 мл раствора свидетелей (~ 20 мкг парацетамола, ~ 15 мкг анальгина, ~ 12,5 мкг кофеина, ~ 2,5 мкг фенобарбитала, ~ 2 мкг кодеина фосфата).

Пластинку подсушивают на воздухе в течение 10 минут и помещают в предварительно насыщенную камеру со смесью растворителей: ацетон - толуол - диэтиламин (19,5 : 5 : 0,5). Когда фронт подвижной фазы дойдет до линии финиша, ее вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 10 минут и просматривают в УФ- свете при 254 нм. Пятна на хроматограмме вытяжки из препарата по интенсивности окраски и положению должны соответствовать пятнам на хроматограмме раствора свидетелей.

Метод тонкослойной хроматографии незаменим также при анализе чистоты лекарственных веществ и препаратов.

Мицеллярная ТСХ анализе веществ. В работе [7] предлагают использовать такую разновидность ТСХ как мицеллярная ТСХ для определения 4-аминобутановой кислоты в таблетках алендроната натрия.

Для определения 4-аминобутановой кислоты в данной смеси необходимо было выбрать растворитель для приготовления пробы, в котором растворимость лактозы, входящей в состав таблеток, минимальна, и скорректировать состав подвижной фазы для лучшего разделения веществ и получения приемлемой формы хроматографического пятна [7].

Лактоза практически нерастворима в 96 % этаноле и метаноле, в то время как и алендронат натрия, и 4-аминобутановая кислота в этаноле достаточно хорошо растворимы. Это и определило выбор растворителя для приготовления стандартных и испытуемых растворов.

Кроме того, использование спиртов ускоряет процесс нанесения веществ на пластинку (быстро испаряется в токе воздуха), и пятна в точке нанесения получаются компактными.

В дальнейшем при хроматографировании это уменьшает размывание хроматографических зон [7].

Оптимальный состав подвижной фазы с точки зрения величины Rf 4-аминобутановой кислоты, формы хроматографических пятен и времени хроматографирования является водный раствор Бридж-35 с молярной концентрацией 0.005 моль/л, доведенный до рН 2.0 хлористоводородной кислотой. Такой состав подвижной фазы использовался в дальнейших исследованиях и при валидации методики количественного определения 4-аминобутановой кислоты в таблетках «Алендронат натрия».

На рис. 3 представлены хроматограммы определения 4-аминобутановой кислоты в таблетках «Алендроната» с использованием разных подвижных фаз.

Рис. 3. Хроматограмма определения 4-амино-бутановой кислоты в таблетках «Алендроната натрия» с использованием: А) подвижной фазы 1-бутанол: уксусная кислота:вода (6:2:2) и (Б) 0.02 М ЦПХ, 0.05 М Бридж 35, 5.0% (об) этанол, рН=2 (HCl). 1 - 4-аминобутановая кислота; 2 - таблетки «Алендронат натрия» с добавкой 4-аминобутановой кислоты

2.3 Спектральные методы

К спектральным методам относят методы, связанные с особенностями поглощения веществом электромагнитного излучения.

К этим методам относятся: визуальная колориметрия, фотоэлектроколориметрия, ИК-спектроскопия, УФ-спектроскопия и др.

Спектрофотометрический анализ основан на определении спектра поглощения или измерении светопоглощения при строго определенной длине волны, которая соответствует максимуму кривой поглощения исследуемого вещества.

Фотоколориметрический анализ базируется на сравнении интенсивности окрасок исследуемого окрашенного и стандартного окрашенного растворов определенной концентрации.

В качестве примера рассмотрим ИК-спектроскопию.

Сущность ИК-спектрометрии как метода анализа

ИК-спектроскопия - это разновидность спектрофотометрических методов анализа. Метод основан на анализе ИК-спектров веществ. Природа полос поглощения в ИК области связана с колебательными переходами и изменением колебательных состояний ядер, входящих в молекулу поглощающего вещества [1]. Поэтому поглощением в ИК-области обладают молекулы, дипольные моменты которых изменяются при возбуждении колебательных движений ядер. Область применения ИК-спектроскопии очень широка и во всяком случае шире, чем для УФ-спектроскопии. Всё это делает данный метод очень популярным. ИК-спектр однозначно характеризует всю структуру молекулы, включая незначительные ее изменения. Важные преимущества ИК-спектроскопии - высокая специфичность, объективность полученных результатов, возможность анализа веществ в кристаллическом состоянии.

Каждый ИК-спектр представляет собой серию полос поглощения, максимумы которых определяются волновым числом, измеряемым в см-1, и определенной интенсивностью. Для анализа ЛВ обычно используют спектральную область от 4000 до 400 см-1.

ГФ XI рекомендует два способа установления подлинности по ИК-спектрам. Один из них основан на сравнении зарегистрированных в идентичных условиях ИК-спектров испытуемого ЛВ и его стандартного образца. Второй способ заключается в сравнении ИК-спектра испытуемого ЛВ с его стандартным спектром, прилагаемым к ФС и зарегистрированным в соответствии с указанными в ней требованиями.

2. Метод ИК-спектроскопии и его применение

2.1 Теоретические основы ИК-спектроскопии

Совокупность всевозможных энергетических переходов в молекуле, сопровождаемых поглощением (излучением) электромагнитного излучения образует спектр.

Электромагнитное излучение может быть охарактеризовано либо волновыми, либо энергетическими параметрами. Волновой параметр выражается длиной волны или частотой колебания, которые связаны между собой уравнением:

(с-1) = (1)

где с - скорость света, - длина волны.

Рис. 1. Длина волны соответствует расстоянию АВ; волновое число - число волн, приходящееся на 1 см, CD; частота - число волн, проходящих через фиксированную точку С в единицу времени [3]

Наглядно связь использующихся в ИК-спектроскопии величин представлена на рис. 1.

Инфракрасная область спектра подразделяется на несколько диапазонов согласно применяемым оптическим материалам, которые должны быть прозрачны в данной области спектра: область 1) 0,8-2 мкм - ближняя инфракрасная область, материал оптики кварц и стекло 2) область 2-40 мкм - средняя (фундаментальная) инфракрасная область, используется солевая оптика (LiF, NaCl, KBr,CsI), область имеет чрезвычайно большое значение при исследовании органических соединений (в современных приборах солевая оптика заменена дифракционными решетками); 3) область до 200 мкм - далекая инфракрасная область, область имеет значение при исследовании неорганических соединений. Исследуется при помощи дифракционных решеток.

При исследовании химических соединений обычно используют поглощение инфракрасного излучения в области 2-50 мкм (5000-200 см-1) [3].

В двухатомной молекуле АВ атомы А и В удерживаются в определенном положении весьма прочно, однако не совсем жестко. В молекуле могут происходить следующие типы движений 1) поступательное движение молекулы как целого, которое может рассматриваться как движение центра масс; 2) вращение молекулы вокруг центра масс; 3) колебание отдельных атомов, происходящие таким образом, что положение центра масс не изменяется и молекула не вращается; 4) движение электронов в молекуле; 5) вращение электронов и ядер атомов вокруг своих осей (спины электронов и ядер).

Таким образом, полная энергия молекулы является суммой поступательной, вращательной, колебательной и электронной энергий:

Е = Eпост + Еэл + Екол + Евр

Поступательная энергия мало влияет на молекулярные спектры. Относительные энергии трех различных молекулярных состояний для двухатомной молекулы дают существенный вклад.

Амплитуда колебаний увеличивается при поглощении молекулой энергии. ИК-излучение, вследствие малой энергоемкости, не затрагивает электроны в молекуле, поэтому с ИК-спектроскопией напрямую связаны случаи вращательного и колебательного движения. Причем чисто колебательных спектров не существует, так как молекулы в основном и возбужденном колебательном состояниях распределены по ряду вращательных состояний, и при переходе молекулы из одного колебательного состояния в другое одновременно происходит изменение их вращательных состояний. Поэтому при рассмотрении колебательных переходов необходимо учитывать вращательные состояния.

Способность вещества поглощать энергию ИК-излучения зависит от суммарного изменения дипольного момента молекулы при вращении и колебании, т.е. поглощать ИК-излучение может лишь молекула, обладающая электрическим дипольным моментом, величина или направление которого изменяется в процессе колебания и вращения. Дипольный момент означает несовпадение центров тяжести положительных и отрицательных зарядов в молекуле, т. е. электрическую асимметрию молекулы.

Таким образом, не все молекулы способны поглощать инфракрасное излучение. Молекулы, имеющие центр симметрии, например молекулы типа H2, Cl2, O2 и им подобные, лишены дипольного момента и не приобретают его в процессе колебания и, следовательно, в инфракрасном спектре не активны.

Колебательно-вращательный спектр определяется строением молекулы и состоит из отдельных полос. Число и частоты полос в спектре зависят: а) от числа образующих молекулу атомов; б) масс атомных ядер; в) геометрии и симметрии равновесной ядерной конфигурации; г) потенциального поля внутри молекулярных сил. Интенсивность полос в спектре определяется электрическими свойствами молекулы: электрическим дипольным моментом и поляризуемостью, а также их изменением в процессе колебаний.

Экспериментальные исследования большого числа молекул, обладающих одними и теми же химическими группами, показали, что, независимо от изменений в остальной части молекулы, эти одинаковые группы поглощают в узком интервале частот. Такие частоты получили название характеристических или групповых.

Существование характеристических частот можно объяснить следующим образом. Колебания определенной группы атомов или связей могут быть слабо связаны с колебаниями атомов остальной части молекулы. В этом случае частота колебаний этой группы или связи зависит только от их строения и мало зависит от окружающих атомов и связей. Вследствие этого различные молекулы, содержащие данную группу атомов или связей, будут характеризоваться различными колебательными спектрами, однако в каждом из них будет присутствовать одна или несколько одинаковых или почти одинаковых частот.

Установление характеристических частот позволяет, не производя никаких расчетов, определять по спектру присутствие в молекуле различных групп и связей и тем самым установить строение молекулы.

Важной характеристикой поглощения, является также его интенсивность. Поглощение ИК излучения наблюдается только тогда, когда колебание приводит к изменению распределения заряда внутри молекул, чем больше это изменение, тем сильнее поглощение, т.е. тем выше интенсивность полосы поглощения. Следовательно, чем более полярна группа или связь, тем больше интенсивность соответствующей полосы поглощения, и наоборот - интенсивность неполярной связи равна нулю, т.е. данное колебание в ИК области неактивно и не проявляется. Кроме этого, интенсивность полосы поглощения зависит от других факторов: от концентрации данного вещества; инструментальных причин (ширина щели прибора) и др.

В настоящее время еще не найдено универсальной постоянной для выражения интенсивности ИК поглощения. В качестве определения она обозначается: о.с. - очень сильная, с. - сильная, ср. - средняя, сл. - слабая, о. сл. - очень слабая.

2.2 Способы изображения ИК-спектров

Спектральные данные записываются как зависимость коэффициента поглощения от длины волны, т.е. выражаются с помощью двух переменных величин - фактора интенсивности и фактора длины волны. Выбор наиболее подходящих выражений для этих двух факторов зависит от условий работы, области исследования, а также от дальнейшего применения полученных величин.

Фактор интенсивности может быть выражен следующим образом: I/I0 - пропускание, доля пропущенного излучения; I/I0100 - пропускание, %; [I0-I/I0]100 - поглощение, %; D=lgI0/I - оптическая плотность.

При указанных способах выражения фактор интенсивности, толщина слоя и концентрация могут быть измерены в любых единицах: толщина - в мм, см; концентрация - в весовых и объемных процентах, в г/л, мг/л, г/мл, мг/мл, моль/л и т.д.

В инфракрасной области спектра запись производится обычно в процентах пропускания или поглощения. Спектр поглощения может быть охарактеризован следующими величинами: 1) длинами волн максимумов поглощения и интенсивностью в этих максимумах; 2) длинами волн в минимумах кривой поглощения и интенсивностью в этих точках; 3) длинами волн, отвечающих перегибам кривой поглощения, и интенсивностью для этих точек.

Типичный вид спектров поглощения некоторых органических веществ представлен на рис .2.



рис. 2

2.3 Качественный и количественный анализ по ИК спектрам

Определение состава смесей органических и неорганических соединений (качественный анализ) и установление концентраций компонентов смеси (количественный анализ) являются одними из важных задач ИК-спектроскопии.

Для проведения как качественного, так и количественного анализа по ИК-спектрам необходимо иметь спектры чистых компонентов. При сравнении спектра со спектром вещества, присутствие которого предполагается, находят в спектре смеси все полосы поглощения эталонного вещества. Если спектр анализируемого образца содержит все полосы поглощения эталонного вещества, можно полагать, что вещество действительно содержится в образце.

В случае ИК-спектров соотношение между пропусканием света системой и концентрацией поглощающих веществ выражается законом Ламберта-Бугера-Бера [1]:

D=lg1/T=lg I0/I=сd (1)

где D - оптическая плотность; I0 - интенсивность падающего света; I -интенсивность прошедшего света; с - молярная концентрация; d - толщина поглощающего слоя; - молярный коэффициент поглощения для данного волнового числа и температуры.

Если закон Бугера - Ламберта - Бера выполняется, что бывает далеко не всегда, то при фиксированной толщине слоя оптическая плотность линейно зависит от концентрации вещества, что и позволяет легко проводить количественный анализ. Отклонения от линейной зависимости бывают связаны или с межмолекулярными взаимодействиями компонентов смеси (раствор), включая специфические (ассоциация, водородная связь) и химические взаимодействия или с инструментальными причинами. Играют роль также эффекты отражения, рассеяния излучения и т.д. Поэтому всегда проводится проверка выполнения закона светопоглощения и чаще всего для проведения количественного анализа строятся градуировочные графики по эталонам.

Для снижения ошибок количественных измерений рекомендуется работать с пропусканием в пределах 20 … 60% (оптическая плотность в пределах 0,1 … 1,0) или, по крайней мере, не выходить за пределы 10 … 80% пропускания, когда ошибки резко возрастают. При большом поглощении необходимо уменьшать либо толщину слоя, либо концентрацию.

Имеются таблицы характеристических частот, по которым многие полосы ИК-спектра могут быть связаны с определенными функциональными группами, входящими в состав молекулы (таблица). Характеристическими будут колебания групп, содержащих легкий атом водорода (С-Н, О-Н, N-Н), колебания групп с кратными связями (С=С, С=N, С=O, СN) и т. д. Такие функциональные группы проявляются в диапазоне спектра от 4000 до 1600 см-1 [5,6,7].

Таблица. Характеристические частоты поглощения некоторых групп атомов

Структурная единица	частота, см-1
О-Н (спирты)	3600-3200
О-Н (карбоновые кислоты)	3600-2500
	3500-3350
sp C-H	3320-3310
sp2 C-H	3100-3000
sp3 C-H	2950-2850
sp2 C-О	1200
sp3 C-О	1200-1025
	1680-1620
	1750-1710
карбоновые кислоты	1725-1700
ангидриды кислот	1850-1800 и 1790-1740
	1815-1770
	2200-2100
	2280-2240
	1750-1730

В ряде случаев можно выделить такие колебания, при которых изменяются преимущественно длины связей или углы между связями. Тогда первое колебание называют валентным, а второе - деформационным (рис. 3) [7].

Рис. 3. Валентные и деформационные колебания метиленовой группы [7]

Типичный ИК-спектр, такой, как спектр н-гексана CH3(CH2)4CH3 (рис. 4), проявляется в виде серии полос поглощения различной формы и интенсивности [7]. Почти все органические соединения обнаруживают пик или группу пиков близ 3000 см-1. Поглощение в этой области обусловлено валентными колебаниями С-Н. Поглощение в области 1460, 1380 и 725 см-1 обусловлено различными деформационными колебаниями С-Н-связей.

рис. 4. ИК-спектр н-гексана [7]

Для иллюстрации влияния строения молекулы на ИК-спектр сравним спектры н-гексана и гексена-1 (рис. 5) [7]. Они весьма отличаются один от другого.

рис. 5 ИК-спектр гексена-1 [7]

Карбонильная группа принадлежит к наиболее легко различимым структурным фрагментам молекул, обнаруживаемым методом ИК-cпектроскопии. Валентные колебания двойной связи C=O проявляются интенсивным сигналом в интервале 1800-1650 см-1. Этот пик ярко выражен в спектре гексанона-2, приведенном на рис. 6.

рис. 6. ИК-спектр гексанона-2 СН3(CH2)3С(О)СН3 [7]

Положение карбонильной полосы поглощения в спектре зависит от природы заместителей при карбонильной группе C=O. Характеристические частоты, свойственные альдегидам и кетонам, амидам, сложным эфирам и т. д., приведены в таблице.

Ароматическое кольцо проявляется в ИК-спектре умеренным пиком валентных колебаний С-Н в районе 3030см-1. Другая характерная особенность - валентные колебания ароматических углерод-углеродных связей наблюдаются обычно при 1600 и 1475 см-1. Наконец, ароматическое кольцо обнаруживает интенсивное поглощение в диапазоне 800-690 см-1, обусловленное деформационными колебаниями С-Н. Все эти особенности ароматического кольца наблюдаются в ИК-спектре толуола.

рис. 7. ИК-спектр толуола [7]

Чем более сложно устроено вещество, тем разнообразнее и сложнее устроен его ИК-спектр. В качестве примера приведём спектр изовиолантрона и продукта его восстановления - изовиолантрена [8]:

Рис. 8. ИК спектры изовиолантрона и продукта его восстановления - изовиолантрена [8]

3. Аппаратура, используемая в методе

Для получения ИК-спектров пользуются ИК-спектрометрами.

Спектрометры, предназначенные для измерения поглощения электромагнитного излучения образцом, содержат источник излучения, кювету с веществом, через которую пропускают излучение, и детектор. Частоту излучения непрерывно меняют, а интенсивность света, попадающего на детектор, сравнивают с интенсивностью источника. Когда частота падающего света достигает определенного значения, происходит поглощение излучения веществом. Детектор отмечает снижение интенсивности прошедшего через образец (кювету) света. Зависимость между частотой света и поглощением, записанная на бумаге в виде линии, называется спектром.

Благодаря успехам в развитии спектрального приборостроения, в настоящее время имеются приборы различных конструкций, которые охватывают весь диапазон инфракрасного излучения [8].

При исследовании органических соединений обычно используют поглощение ИК-излучения в области l=2-50 мкм, что соответствует волновым числам n=5000-200 cм-1.

По принципу получения спектра приборы для ИК-области можно разделить на две основные группы: диспергирующие и недиспергирующие [9].

В качестве диспергирующего устройства используются призмы из материала с соответствующей ИК-диапазону дисперсией и дифракционные решетки. Обычно для средней ИК-области (400-5000 см-1) применяют призмы из монокристаллов KBr, NaCl и LiF. В настоящее время призмы находят незначительное применение и практически вытеснены дифракционными решетками, дающими большой выигрыш в энергии излучения и высокое разрешение. Но, несмотря на высокое качество этих приборов, они все больше заменяются на фурье-спектрометры, относящиеся к группе недиспергирующих приборов.

Термин "ИК-Фурье спектроскопия" возник с появлением нового поколения приборов, в основе оптической схемы которых используются различного типа интерферометры. ИК-Фурье спектроскопия представляет собой один из вариантов метода ИК - спектроскопии и по существу не является отдельным спектральным методом. Спектры веществ, полученные на ИК-Фурье спектрометрах, не отличаются от спектров, полученных на диспергирующих ИК-спектрометрах [3].

В основе действия Фурье-спектрометров лежит явление интерференции электромагнитного излучения. Для изготовления этих приборов используют интерферометры нескольких типов. Наибольшее распространение получил интерферометр Майкельсона (принципиальная схема изображена на рис. 9).

Рис. 9. Принципиальная оптическая схема интерферометра Майкельсона [9]

Поток ИК-излучения от источника 1, модулированный прерывателем 2, делится светоделителем 4 на два пучка. Один из них направляется на зеркало 3, которое связано микрометрической передачей с двигателем и может поступательно перемещаться с определенной длиной пробега и возвращаться в исходное положение. Отраженный от этого зеркала пучок интерферирует, имея заданную зеркалом 3 разность хода, с пучком, отраженным от закрепленного зеркала 5. Дальше излучение фокусируется линзами 6 на приемнике 8, проходя через исследуемый образец, помещенный в кюветное отделение 7. При движении зеркала 3 и интерференции пучков с изменяющейся разностью хода происходит сканирование в определенном спектральном диапазоне.

В результате интерференции получается сложная интерференционная картина, являющаяся наложением интерферограмм, которые отвечают определенной разности хода и длине волны излучения. Объединенный световой поток проходит через образец и попадает на приемник излучения. Усиленный сигнал поступает на вход компьютера, который осуществляет Фурье-преобразование интерферограммы и получение спектра поглощения исследуемого образца.

4. Методика проведения анализа с полученными спектрами образцов

4.1 Качественный анализ

Для проведения качественного анализа проб по инфракрасным спектрам необходимо провести интерпретацию инфракрасного спектра. При этом необходимо сочетание экспериментальных данных с теоретическим расчетом. Изучение инфракрасных спектров веществ в настоящее время проводится двумя методами: выявлением характеристических частот и сравнением спектров сложных веществ со спектрами индивидуальных соединений.

Метод характеристических частот. Молекулы, имеющие одни и те же химические группы, часто имеют одинаковые частоты в спектре. Эти частоты называют характеристическими.

Расшифровка инфракрасного спектра производится следующим образом: идентификацию полос поглощения начинают с наиболее сильных и высокочастотных полос в области валентных колебаний различных химических связей. По таблицам характеристических частот полосу поглощения относят к колебанию конкретной связи. Наличие той или иной связи подтверждают деформационной полосой поглощения, относящейся к данной связи.

Метод сравнения. Идентификация неизвестного соединения по инфракрасному спектру осуществляется сравнением его спектра с эталонными спектрами. Для этого необходима обширная картотека эталонных спектров; при этом важнейшим фактором является стандартность условий их регистрации. В настоящее время имеются многочисленные атласы органических и неорганических соединений.

Идентификация веществ по инфракрасному спектру является полностью достоверной только при точном совпадении изучаемого спектра со спектром эталона по положению (частоте), форме и относительной интенсивности всех полос, то есть всей спектральной кривой.

4.2 Количественный анализ

Для проведения количественного анализа на любую атомную группировку, благодаря своей высокой точности, чувствительности, быстроте, малому количеству требующегося вещества и возможности проведения измерений в потоке, метод инфракрасной спектроскопии оказывается очень удобным. В основе всех количественных измерений, проводимых по спектрам поглощения, лежит закон Бугера-Ламберта-Бера (1).

Если известны толщина образца и молярное поглощение исследуемой группировки на какой-либо частоте, то, рассчитав на этой же частоте оптическую плотность анализируемого образца, мы легко найдем концентрацию этой группировки, по градировочному графику.

Точность определения концентрации любых функциональных групп таким способом будет зависеть от точности измерения следующих величин. Во-первых, это интенсивность световых потоков падающего - I0 и прошедшего - I через анализируемый образец. Во-вторых, молярное поглощение искомой атомной группировки на той частоте, на которой проводится анализ. Эта величина всегда вычисляется из оптических плотностей эталонных образцов с известной концентрацией искомых группировок и поэтому тоже определяется точностью измерения световых потоков или, иначе, коэффициента пропускания образца.

Таким образом, любые количественные измерения тех или иных функциональных группировок, проводимые по их полосам поглощения, всегда сводятся к измерению пропускания образца, поэтому точность спектральных количественных измерений оказывается непосредственно связанной с точностью регистрации пропускания образца на определенной заданной частоте. Эффект рассеивания на неровностях поверхности образца и отражение на окнах кюветы могут оказаться достаточно значительными, вследствие чего при количественных измерениях их следует учитывать.

Для нахождения оптической плотности образца, которая обусловлена присутствием в нем определяемых группировок, берется некоторая так называемая базовая линия, которая плавно соединяет области наибольшей прозрачности, находящиеся в непосредственной близости от измеряемой полосы поглощения, и производится отсчет I0 и I.

Существует несколько методов определения содержания одного компонента в среде постоянного состава. Наиболее распространенным является метод градуировочной кривой. Он заключается в построении графика зависимости оптической плотности образца заданной толщины от концентрации в нем анализируемых центров поглощения. Этот график строится на основании измерений спектров поглощения эталонных смесей известного состава и поэтому автоматически учитывает все отступления закона Бугера - Ламберта - Бера, которые имеют место при анализе сильно ассоциирующих веществ.

Другим, тоже часто используемым методом количественного анализа, является метод внутренних стандартов. Он заключается в сопоставлении оптических плотностей образца на двух частотах, на первой из которых поглощение обусловлено анализируемыми атомными группировками, а на другой - средой, состав которой остается постоянным. Этот метод менее удобен тем, что требует близкого расположения аналитической полосы и полосы сравнения, а также малого отличия в их интенсивностях.

3. Перспективы развития метода

Метод ИК-спектроскопии, как уже было указано, является популярным и доступным методом для анализа подлинности, чистоты и количественного определения веществ. Об этом свидетельствуют множество публикаций по результатам экспериментов исследований в научных журналах.

Методом ИК-спектроскопии пользуются для определения качества в твёрдых формах: таблетках и порошках [11-17], различных жидких лекарственных формах [18,19]. Метод ИК-спектроскопии позволяет анализировать образцы на предмет чистоты, что широко применяется в медицине, например, при анализе крови человека. Можно определить наличие тех или иных веществ и даже поставить диагноз [20]. Работы ведутся как в направлении совершенствования техники и методов расчёта [21], так и в совершенствовании и расширении лекарственных препаратов, которые можно определять методом ИК-спектроскопии [22, 23].

В целом, можно сделать вывод о том, что метод ИК-спектроскопии, несмотря на исторически раннее появление, продолжает использоваться в анализе лекарственных форм и развивается параллельно с развитием технологий.

Заключение

Принцип спектроскопии основан на поглощении энергии электромагнитного излучения молекулами вещества.

ИК-спектроскопия - это разновидность спектрофотометрических методов анализа. Метод основан на анализе ИК-спектров веществ, получаемых при поглощении веществами монохроматического электромагнитного излучения определённой частоты.

В методе ИК-спектроскопии наиболее широкое распространение получило исследование ИК-спектров поглощения, возникающих при прохождении ИК-излучения через вещество. При этом выборочно поглощается энергия на тех частотах, которые совпадают с частотами колебаний атомов в молекулах вещества, с частотами вращения молекулы или с частотами колебаний кристаллической решетки. Каждое вещество имеет свой колебательный спектр. Число полос поглощения в спектре, ширина, форма, интенсивность определяются структурой и химическим составом вещества. Это дает возможность по ИК-спектрам проводить качественный и количественный анализы вещества во всех агрегатных состояниях.

Основными преимуществами ИК-спектроскопии является высокая специфичность, объективность полученных результатов, возможность анализа веществ в кристаллическом состоянии.