Изучение возможностей использования 2-галоген-замещенных ацетамидов в качестве ацильных доноров в реакциях, катализируемых пенициллинацилазами

Размещено на http://www.allbest.ru/

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского,

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет

Изучение возможностей использования 2-галоген-замещенных ацетамидов в качестве ацильных доноров в реакциях, катализируемых пенициллинацилазами

Н.В. Панин, М.В. Никулин, Е.С. Тюрин,

В.В. Дробот, И.А. Морозова, В.К. Швядас

РЕФЕРАТ

каталитический кислота пенициллинацилаза реакция

Исследованы возможности использования амидов галоген-замещенных уксусных кислот в качестве ацильных доноров в реакциях, катализируемых пенициллинацилазами. Обнаружена способность соединений этой группы инактивировать ферменты в ходе каталитического превращения. Наиболее сильное инактивирующее действие проявляли йодацетамид и бромацетамид, однако негативное влияние этой побочной активности можно минимизировать при понижении температуры, когда каталитическая активность пенициллинацилаз по отношению к этим ацильным донорам остается достаточно высокой, а вклад инактивации фермента в ходе реакции становится менее значительным. Каталитическая активность пенициллинацилазы из Alcaligenes faecalis по отношению к 2-галогенацетамидам существенно (в 5-8 раз) превышала активность пенициллинацилазы из Escherichia coli.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА 2 -галогенацетамиды, инактивация в ходе реакции, пенициллинацилазы, субстратная специфичность.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; NIPAB - ж-карбокси-п- нитроанилид фенилуксусной кислоты; ФУК - фенилуксусная кислота.

ВВЕДЕНИЕ

Бета-лактамные антибиотики являются наиболее широко используемыми антибактериальными препаратами, к преимуществам которых можно отнести высокую клиническую эффективность и низкую токсичность. Важное значение имеет также доступность антибиотиков этого класса, что обусловлено, в частности, масштабным использованием биокаталитиче- ских технологий для их получения. Однако проблемы, связанные с развитием резистентности патогенов, ограничивают срок использования разработанных препаратов и делают необходимым поиск новых производных. Одно из ключевых направлений создания более эффективных, так называемых полусинтетиче- ских аналогов, - введение различных N-ацильных заместителей, ковалентно связанных с бета-лактамным ядром. Успешность этого процесса прямо связана с доступностью, эффективностью и легкостью включения нового N-ацильного радикала в структуру целевого соединения. Важную роль в решении этого вопроса сыграла способность пенициллинацилаз катализировать эффективный перенос ацильных групп, в первую очередь, остатков D-фенилглицина и п-окси- D-фенилглицина, от их амидов и сложных эфиров на ядра пенициллинов и цефалоспоринов. Детальное исследование весьма сложной кинетики реакций ферментативного ацильного переноса в водной среде на добавленные нуклеофилы позволило выявить основные факторы, от которых зависит эффективность процесса [1-3], и разработать методы биоката- литического синтеза ампициллина, амоксициллина, цефалексина, цефаклора, цефоницида, цефпрозила в водной среде без применения экологически опасных органических растворителей [4-11]. Дальнейшее развитие биокаталитических методов в значительной степени зависит от субстратной специфичности ферментов, способных катализировать перенос других ацильных групп на ядра бета-лактамных соединений. В этой связи представляет интерес сочетание возможностей биокатализа и методов клик-химии, когда на первой стадии при помощи фермента синтезируется бета-лактамное соединение с N-ацильным радикалом, содержащим активированную группу, которая затем может служить основой для получения разнообразных новых производных. В качестве примера для иллюстрации подобного подхода можно привести синтез цефатиамидина - антибиотика, популярного на китайском фармацевтическом рынке. В данном случае активированная N-ацильная группа представляет собой остаток бромуксусной кислоты, после введения которой и последующего взаимодействия с N^'-диизопропилтиомочевиной получается целевой антибиотик (рис. 1) [12, 13].

Рис. 1 Синтез антибиотика цефатиамидина через активированное N-бромацетильное производное 7-аминоцефа-лоспорановой кислоты

Варьируя структуру вводимого бокового радикала к ядру антибиотика, природу активированных групп и структуру химического соединения на завершающей стадии, можно разработать достаточно универсальный путь получения широкого спектра потенциальных антибактериальных препаратов. Весьма вероятной проблемой при разработке такого подхода могут быть следующие осложняющие факторы: модификация (инактивация) фермента при взаимодействии с активированными группами исходных субстратов и получаемых продуктов, спонтанное разрушение активированных групп в условиях проведения биокаталитической стадии, поиск подходящих ферментов, обладающих необходимой каталитической активностью в отношении синтетических неприродных субстратов.

Цель данной работы состояла в изучении возможностей использования производных галоген-заме- щенных уксусных кислот в качестве потенциальных ацильных доноров в реакциях, катализируемых пе- нициллинацилазами из Escherichia coli и Alcaligenes faecalis, характеристике их реакционной способности как субстратов в зависимости от природы активирующей группы, так и при инактивации ферментов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Определение активности фермента по отношению к 2-галогенацетамидам

Типичный эксперимент проводили следующим образом: 2-галогенацетамид (200 мкмоль) растворяли в 0.05 М фосфатном буфере, термостатировали при нужной температуре, доводили pH до 7.5 и начинали реакцию добавлением аликвоты исходного концентрированного раствора фермента, создавая концентрацию активных центров пенициллинацилазы в реакционной смеси 25 мкМ. Общий объем реакционной смеси составлял 800 мкл, концентрация субстрата 0.25 М. Реакцию проводили в термостатируемой ячейке, поддерживая постоянные значения температуры и pH. Через определенные промежутки времени отбирали пробы объемом 20 мкл и смешивали их с 980 мкл смеси ацетонитрила с дистиллированной водой (соотношение 2: 1). Пробы центрифугировали в течение 5 мин при 13000 об/мин для удаления осадка белка и анализировали с помощью обращенно- фазовой ВЭЖХ. Условия анализа: скорость потока 0.7 мл/мин, элюент - ацетонитрил/вода (25 об.% ацетонитрила, 0.005 М фосфатный буфер pH 3), детектирование 210 нм, колонка Kromasil Eternity 5-C18 4.6x250 мм, объем наносимой пробы 20 мкл. Степень разделения R_S соответствующих амида и кислоты во всех случаях превышала 1.5. Времена удержания компонентов составляли: хлорацетамид 4.16 мин, хлоруксусная кислота 4.34 мин, бромацетамид 4.27 мин, бромуксусная кислота 4.73 мин, йодацетамид 4.31 мин, йодуксусная кислота 5.92 мин.

Исследование зависимости скорости превращения хромогенного субстрата от концентрациихлорацетамида

Ингибирующее влияние хлорацетамида на каталитическую активность пенициллинацилазы изучали с использованием высокопроизводительного микро- планшетного ридера CLARIOstar (BMG LABTECH). Типичный эксперимент выглядел следующим образом: в 96-луночном планшете в ячейки по вертикальным столбцам добавляли аликвоты 1 мМ раствора хромогенного субстрата NIPAB (семь столбцов различных концентраций NIPAB в диапазоне от 0.01 до 0.3 мМ; концентрация в рядах идентична), в ячейки по горизонтальным рядам - аликвоты 700 мМ раствора ингибитора (восемь рядов различных концентраций хлорацетамида в диапазоне от 0 до 400 мМ; концентрация в столбцах идентична), объем реакционной смеси доводили до 216 мкл, добавляя необходимый объем 0.1 М калий-фосфатного буфера pH 7.5. В этом же буфере были приготовлены растворы всех реагентов. Реакцию начинали добавлением 20 мкл раствора фермента при помощи мультиканального дозатора, создавая концентрацию активных центров пенициллинацилазы в каждой ячейке 10 нМ. Значение температуры поддерживали на уровне 25 °С. Активность определяли по накоплению хромофора - п-нитро-м-карбоксианилина (X, = 400 нм) в режиме работы прибора Absorbance/PlateMode при повышенной точности (количество вспышек на ячейку 30, время цикла 6 с, количество циклов 74) с периодическим перемешиванием (500 об/мин). Во избежание случайных ошибок, вызванных образованием локальных пузырьков воздуха, измерение оптической плотности проводили в режиме статистического усреднения (функция well scan, усреднение по спирали). Потоковую регрессионную обработку данных проводили в программе MARS Data Analysis Software. Начальные скорости определяли по усредненному значению производной в пределах 10% конверсии NIPAB. Для определения константы ингибирования экспериментальные результаты анализировали в координатах Диксона.

Изучение инактивации пенициллинацилазы под действием 2-галогенацетамидов

Кинетику инактивации пенициллинацилазы изучали с использованием высокопроизводительного микропланшетного ридера CLARIOstar (BMG LABTECH). Типичный эксперимент выглядел следующим образом: в 96-луночном планшете в ячейки по горизонтальным рядам добавляли аликвоты 1 М раствора галогенацетамида (восемь рядов различных концентраций в диапазоне от 0 до 470 мМ; концентрация во всех 12 столбцах идентичная). Левую половину планшета использовали для изучения инактивации фермента под действием галогенаце- тамида, правую - для изучения влияния на процесс инактивации фенилуксусной кислоты (ФУК) - высокоспецифичного ингибитора пенициллинацилазы; концентрация ФУК во всех ячейках правой половины планшета составляла 0.1 мМ. Объем реакционной смеси в каждой ячейке доводили до 196 мкл, добавляя необходимый объем 0.1 М калий-фосфат- ного буфера pH 7.5. При этом создавали по шесть идентичных по составу столбцов слева (без ФУК) и справа (с ФУК). Реакцию инактивации начинали одновременно в первом и седьмом столбцах добавлением 20 мкл исходного раствора фермента, чтобы концентрация активных центров пенициллина- цилазы в каждой ячейке составляла 10 нМ. Порции исходного раствора фермента последовательно добавляли в каждый следующий столбец многоканальным дозатором через каждые 10 мин инкубирования. Значение температуры поддерживали на уровне 25 °С. Для определения остаточной активности фермента через 50 мин после начала первой инкубации во все ячейки одновременно добавляли 24 мкл 1 мМ раствора NIPAB, чтобы концентрация хромогенного субстрата в каждой ячейке составляла 0.1 мМ. Таким образом, время инкубации фермента с ингибитором в 1-м и 7-м столбцах составило 50 мин, в 6-м и 12-м столбцах - 1 мин. Остаточную активность сканировали как описано выше. Инактивация фермента протекала в соответствии с кинетикой реакции первого порядка, при анализе экспериментальных данных определяли константу инактивации фермента.

Кинетику инактивации пенициллинацилазы при взаимодействии с 2-галогенацетамидами изучали также с использованием другой методики при разных температурах (4, 15 и 25°С) путем инкубирования раствора фермента (концентрация 3 нМ) в присутствии 100 мМ 2-галогенацетамида в 10 мМ калий-фосфатном буфере pH 7.5, содержащем 0.1 М KCl. Аликвоты реакционной смеси отбирали в определенные моменты времени и добавляли в термо- статируемую кювету (25°С) с раствором NIPAB (концентрация хромогенного субстрата 0.1 мМ в 10 мМ калий-фосфатном буфере pH 7.5, содержащем 0.1 М KCl). Остаточную активность измеряли на спектрофотометре Shimadzu UV 1800 при 400 нм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор производных галоген-замещенных уксусных кислот в качестве потенциальных субстратов для исследования

При выборе субстрата для ферментативной реакции следует учитывать такие его свойства, как стабильность, растворимость и удобство применения, что особенно важно при препаративном использовании ацильных доноров. Решающими факторами при выборе амидов галоген-замещенных уксусных кислот для исследования в качестве потенциальных субстратов пенициллинацилаз были: более высокая растворимость и стабильность амидов по сравнению со сложными эфирами и, самое главное, лакриматор- ное действие сложных эфиров. Так, например, пары этилового эфира бромуксусной кислоты чрезвычайно раздражающе действуют на слизистую оболочку глаз; препарат необходимо хранить в герметично закрытых сосудах и применять в открытой посуде только в хорошем вытяжном шкафу [14].

Рис. 2 Зависимость начальных скоростей гидролиза NIPAB под действием пенициллинацилазы из E. coli от концентрации хромогенного субстрата в присутствии различных концентраций 2-хлорацетамида. Данные представлены в координатах Диксона. Условия проведения эксперимента: 25°С, 0.1 М калий-фосфат- ный буфер pH 7.5

Изучение способности амида 2-галогенуксусной кислоты связываться в активном центре пенициллинацилаз

Возможности потенциальных субстратов связываться в активном центре пенициллинацилазы изучали по их способности ингибировать активность фермента по отношению к удобному хромогенному субстрату. Типичный пример по влиянию 2-хлорацетамида на каталитическую активность пенициллинацилазы из E. coli показан на рис. 2. При исследовании зависимости скорости превращения хромогенного субстрата NIPAB от концентрации ингибитора (2-хлорацета- мида) было обнаружено конкурентное ингибирование и определено значение константы ингибирования 0.12±0.02 М (рис. 2). Показано, что амиды 2-галоген- замещенных уксусных кислот обладают значительно более низким (примерно на 4 порядка) сродством к активному центру пенициллинацилаз по сравнению со специфическими субстратами этого фермента. Тем не менее, благодаря хорошей растворимости этих субстратов можно использовать их высококонцентрированные растворы и рассчитывать на проведение реакции в условиях максимальной скорости ферментативной реакции.

Изучение реакционной способности потенциальных ацильных доноров

При исследовании взаимодействия амидов гало- ген-замещенных уксусных кислот с пенициллин- ацилазами было обнаружено, что гидролиз этих субстратов сопровождается инактивацией ферментов, наиболее ярко выраженной в случае йодацетамида и бромацетамида. Инактивация обоих ферментов была обусловлена связыванием галоген-замещенных ацетамидов в активном центре пенициллинацилаз и сопряжена с каталитической активностью, поскольку добавление фенилуксусной кислоты - известного конкурентного ингибитора пенициллинаци- лаз, связывающегося в активном центре, подавляло инактивацию. Подобную инактивацию пенциллин- ацилазы из E. coli в ходе реакции ранее наблюдали при препаративном ферментативном синтезе пептидов D-фенилглицина [15]. Потеря активности фермента в ходе превращения амидов галоген-замещен- ных уксусных кислот протекала согласно кинетике реакции первого порядка, значения соответствующих констант скоростей инактивации представлены в табл. 1.

Таблица 1

Значения констант скоростей инактивации пенициллинацилазы из Escherichia coli при взаимодействии с 2-галогенацетамидами