Карбоксилестерази гомогенатів травних залох Rapana venosa

Размещено на http://www.allbest.ru/

Фізико-хімічний інститут імені О.В. Богатського НАН України

Одеський національний університет імені І. І. Мечникова

КАРБОКСИЛЕСТЕРАЗИ ГОМОГЕНАТІВ ТРАВНИХ ЗАЛОЗ RAPANA VENOSA

І.І. Романовська, О.В. Севастьянов, Є.А. Шестеренко,

А.А. Крисько, Ю. А. Шестеренко, В.А. Топтіков

Анотація

карбоксилестераза гомогенат гепатопанкреас молюск

Мета: Вивчити біохімічні і фізико-хімічні властивості карбоксилестераз гомогенатів стравохідної залози і гепатопанкреасу молюска Rapana venosa, особливості енантіоселективного ферментативного гідролізу естеру 3-гідрокси-1,4-бенздіазепін-2-ону, потенційного анксіолітичного і снодійного засобу. Методи: травні залози Rapana venosa гомогенізували і визначали вміст білка за методом Лоурі-Хартрі, естеразну активність за 1- і 2- нафтилацетатами. Ферментативний гідроліз естеру 3-гідрокси-1,4-бенздіа- зепін-2-ону проводили впродовж 2,5 год в розчині диметилсульфоксиду: Na-фосфатний буфер, 0,0167М, рН 7,0, в об'ємних співвідношеннях 2:3, при температурі 37 °С. Визначення енантіомерного надлишку здійснювали за допомогою високоефективної рідинної хроматографії, використовуючи систему SHIMADZU, що оснащена колонкою ChiraDexHR 5ym(4mm*250mm). Результати: Показано, що естеразна активність гомогенатів гепатопанкреасу і стравохідної залози за 2-нафтилацетатом, як субстратом, в 3,6рази та в 6,7 рази більша, ніж за 1- нафтилацетатом, відповідно. Належність естераз в гомогенатах до родини карбоксилестераз підтверджена повним пригніченням їх активності селективним інгібітором карбоксилестераз ди-(п-нітрофеніл)-фосфатом (2,0 ммоль/дмЗ). Показано, що pH-оптимуми естеразної активності гомогенатів стравохідної залози і гепатопанкреасу становлять 7,5, і 5,5, відповідно. Встановлено особливості гідролізу естеру 3-гідрокси-1,4-бенздіазепін-2-ону, що каталізується карбоксилестераза- ми у складі гомогенатів травних залоз Rapana venosa. Показано переважне утворення R-енантіомеру субстрату (енантіомерний надлишок R-енантіо- меру становив 42%). Висновки: Виявлена регіоселективність відносно 1-,нафтилацетатів та енантіоселективність карбоксилестераз естеру гідрокси-1,4-бенздіазепін-2-ону.

Ключові слова: карбоксилестераза, травні залози Rapana venosa, регіосе- лективність, енантіоселективність.

Аннотация

И. И. Романовская¹, О. В. Севастьянов¹, Е. А. Шестеренко¹, А. А. Крысько¹, Ю. А. Шестеренко¹, В. А. Топтиков²

Физико-химический институт имени А. В. Богатского НАН Украины, ²Одесский национальный университет имени И. И. Мечникова

КАРБОКСИЛЭСТЕРАЗЫ ГОМОГЕНАТОВ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНИХ ЖЕЛЕЗ RAPANA VENOSA

Цель. Исследование биохимических и физико-химических свойств карбоксилэстераз гомогенатов пищеводной железы и гепатопанкреаса моллюска Rapana venosa, изучение особенностей энантиоселективного ферментативного гидролиза сложного эфира 3-гидрокси-1,4-бенздиазепин-2-она, потенциального анксиолитического и снотворного средства. Методы. Пищеварительные железы Rapana venosa гомогенизировали для дальнейших исследований и определяли содержание белка по методу Лоури-Хартри, эстеразную активность по 1- i 2- нафтилацетатам. Ферментативный гидролиз сложного эфира 3-гидрокси-1,4-бенздиазепин-2-она, проводили в течение 2,5 ч в растворе диметилсульфоксид: Na-фосфатный буфер, 0,0167 М, рН 7,0, в объемных соотношениях 2:3, при температуре 37 °С. Определение энантиомерного избытка осуществляли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, используя систему SHIMADZU, оснащенную колонкой ChiraDex HR 5ym (4mm x 250mm). Результаты. Впер-вые показано, что эстеразная активность гомогенатов гепатопанкреаса и пищеводной железы по 2-нафтилацетату, в качестве субстрата, в 3,6 раза и в 6,7раза больше, чем по 1-нафтилацетату, соответственно. Принадлежность эстераз в гомогенатах к семейству карбоксилэстераз подтверждена полным подавлением их активности селективным ингибитором карбоксилэстераз ди-(п-нитрофенил)фосфатом (2,0 ммоль/дмЗ). Показано, что рН-оптимумы эстеразной активности гомогенатов пищеводной железы и гепатопанкреаса составляют 7,5, и 5,5, соответственно. Изучены особенности гидролиза сложного эфира 3-гидрокси-1,4-бенздиазепин-2-она, катализируемого карбоксилэстеразами в составе гомогенатов пищеварительных желез Rapana venosa. Показано преимущественное образование R-энантиомера субстрата (энантиомерный избыток R-энантиомера составил 42 %). Выводы. Выявлена региоселективность относительно 1-, 2-нафтилацетатов и энантиоселективность карбоксилэстераз сложного эфира 3-гидрокси-1,4-бенздиазепин-2-она.

Ключевые слова: карбоксилэстераза, пищеварительные железы Rapana venosa, региоселективность, энантиоселективность.

Annotation

I. Romanovska¹, O. V. Sevastyanov¹, Ye. A. Shesterenko¹, A. A. Krysko¹, Yu. A. Shesterenko¹, V. A. Toptikov²

¹ A.V Bogatsky Physico-Chemical Institute, National Academy of Sciences of Ukraine

² Odesa National Mechnykov University

CARBOXYLESTERASES OF RAPANA VENOSA DIGESTIVE GLANDS HOMOGENATES

Aim. Investigation of biochemical and physico-chemical properties of carboxylesterases in homogenates gland and hepatopancreas of Rapana venosa; study of the features of enantioselective enzymatic hydrolysis of 3-hydroxy-1,4- benzodiasepine-2-one ester, potential anxiolytic and hypnotic drug. Methods. Digestive glands of Rapana venosa were homogenizedfor subsequent investigations, the protein content in them was determined by the Lowry-Hartree method and esterase activity - according to 1-, 2-naphthyl acetates. Enzymatic hydrolysis of 3-hydroxy-5-phenyl-7-bromo-1,2-dihydro-3H-1,4-benzodiasepine-2-one was conducted for 2,5 h in the solution: dimethyl sulfoxide: Na-phosphate buffer 0,0167 M, pH 7,0 in volume ratio 2:3, at 37 °C. Determination of enantiomeric excess was conducted with help of high performance liquid chromatography in SHIMATSU system, equipped with ChiraDex HR 5jum(4mm*250mm) column. Results. For the first time it was shown, that esterase activity of hepatopancreas and esophageal gland homogenates for 2-naphtyl acetate as substrate, was 3,6fold and 6,7- fold greater, than for 1-naphtyl acetate, respectively. The belonging of esterases in homogenates to the family of carboxylesterase was confirmed by the total suppression of their activity by the selective carboxylesterase inhibitor, di-(p-nitrophenyl)phosphate (2.0 mmol/dm3). It was shown, that pH-optima of esterase activity in homogenates of esophageal gland and hepatopancreas equals 7,5 and 5,5, respectively. The features of 3-hydroxy-1,4-benzodiazepine-

2-one ester hydrolysis, catalyzed by carboxylesterase of Rapana venosa digestive glands homogenates were studied. The preferential formation of the R-enantiomer of substrate was shown (enantiomeric excess of R- enantiomer was 42%). Conclusion. The regioselectivity of carboxylesterase to 1-, 2-naphtyl acetates and enantioselectivity of 3-hydroxy-1,4-benzodiazepine-2-one ester were found.

Key words: carboxylesterase, digestive glands of Rapana venosa, regioselectivity, enantioselectivity.

Виклад основного матеріалу

Відомо, що чужорідні види можуть становити серйозну загрозу для біорізноманіття, сталого розвитку та охорони довкілля. Rapana venosa є хижим черевоногим молюском і являє реальну небезпеку для водних екосистем Чорного моря, крім того, вона набула статусу виду світового розповсюдження [1,15]. Одже, перспективні біотехнологічні дослідження щодо використання даного молюска як нового економічного природного джерела сировини для отримання різноманітних біологічно активних речовин.

В літературі є дані про наявність карбоксилестеразної активності у молюсків (Mollusca) [5, 6, 9, 13], але роботи, присвячені вивченню карбоксиле- стераз молюска Rapana venosa, майже відсутні [15, 16].

Карбоксилестераза (КФ 3.1.1.1) ссавців є одним з найбільш досліджуваних ферментів, що застосовуються для отримання енантіомерів лікарських речовин. Карбоксилестераза має низку позитивних властивостей: широку субстрату специфічність і високу стереоселективність [3, 8], разом з тим недоліками застосування ферменту є висока вартість комерційного препарату. У зв'язку з цим актуальним є пошук більш доступних джерел отримання кар- боксилестерази.

Відомо, що енантіомери мають однакові хімічні властивості, але можуть мати істотні відмінності у фармакологічних властивостях [12]. Сьогодні на світовому фармацевтичному ринку представлена достатня кількість лікарських препаратів, що випускаються у вигляді окремого енантіомеру. Їх перевагами є менша токсичність, та знижене дозування порівняно з рацематами [4].

Бенздіазепіни мають широкий спектр фармакологічних властивостей: анксіолітичні, гіпноседативні, протисудомні, міорелаксантні та ін. [11]. Тому пошук, синтез і дослідження фармакологічних властивостей нових представників бенздіазепінового ряду є актуальним завданням. Оскільки деякі з них є рацематами, а хімічні методи розділення пов'язані з низкою труднощів, перспективною є розробка доступніших біотехнологічних методів отримання енантіомерів.

Тому перспективним є дослідження карбоксилестеразної активності травних залоз (стравохідної залози і гепатопанкреасу) молюска Rapana venosa та визначення можливості застосування отриманих ферментних препаратів для здійснення енантіоселективного гідролізу естерів 3-гідрокси-1,4-бенздіа- зепін-2-ону, потенційних анксіолітичних і снодійних засобів.

Метою роботи було виявити біохімічні і фізико-хімічні властивості кар- боксилестераз гомогенатів стравохідної залози і гепатопанкреасу молюска Rapana venosa та особливості енантіоселективного ферментативного гідролізу естеру 3-гідрокси-1,4-бенздіазепін-2-ону.

Матеріали та методи

В роботі використовували Rapana venosa, зібрану в весняний період 2017 р. в районі Малого Фонтану в Одеській затоці і надану співробітниками кафедри генетики та молекулярної біології ОНУ імені І. І. Мечникова. Застосовували три вибірки по 10 молюсків з однаковим відношенням статей. З молюсків було виділено 2 травні залози: гепатопанкреас та стравохідна. Гомогенати готували на Na-фосфатному 0,0167 М буферному розчині, pH 7,0, при 10 ходах поршня і 1000 обертів за хвилину. У виділених гомогенатах визначали вміст білка за методом Лоурі в модифікації Хартрі [7], естеразну активність (за стандартними субстратами: 1- та 2-нафтилацетатами) [10].

Вплив селективного інгібітору карбоксилестераз ди-(и-нітрофеніл)-фосфату на ферментативну активність карбоксилестераз гомогенатів травних залоз визначали в діапазоні концентрацій 0,20-2,0 ммоль/дм³.

Вплив рН інкубаційного середовища на карбоксилестеразну активність гомогенатів вивчали в середовищі диметилсульфоксид: буферний розчин при рН 3,5-9,5; t = 37 °С. Визначення температурного оптимуму карбоксил-е- стеразної активності гомогенатів проводили в інтервалі t 20-75 °С в умовах рН-оптимуму. Ступінь гідролізу 3-ацетокси-5-феніл-7-бром-1,2-дигідро-3#- 1,4-бенздіазепін-2-ону оцінювали за зменшенням кількості естерних груп спектрофотометрично гідроксаматним методом при X 540 нм [17]. Ферментативний гідроліз 3-ацетокси-5-феніл-7-бром-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіа- зепін-2-ону проводили протягом 2,5 годин в розчині диметилсульфоксид: Ш-фосфатний буфер, 0,0167 М, рН 7,0, в об'ємних співвідношеннях 2:3, при температурі 37 °С до 50% трансформації естеру.

Виділення нетрансформованого енантіомеру вихідної сполуки з реакційного середовища після проведення гідролізу проводили екстракцією хлороформом з подальшим розділенням методом препаративної тонкошарової хроматографії (носій кізельгель 60 GF254, «Мегск»). Визначення енантіомерного надлишку за допомогою ВЕРХ (високоефективна рідинна хроматографія), використовуючи систему SШMADZU (контроллер системи СВМ-20А; вакуумний дегазатор DGU-20 А5; насос високого тиску LC 20 AD UFLS, оснащений 4-канальним градієнтним блоком низького тиску; термостат колонок СТО-20А; діодно-матричний детектор SPDM20A), що оснащена колонкою СЫгаБех НК 5^т (4тт*250тт). Енантіомерний надлишок розраховували за формулою: (ЕН) = (частка енантіомера А - частка енантіомера В)*100%.

Дані експериментів піддавали статистичному опрацюванню та розраховували значення середньої стандартної похибки експерименту [2].

Результати та їх обговорення

З молюска Rapana venosa отримані гомогенати стравохідної залози і ге- патопанкреасу з вмістом білка 317±1,4 мг/г тканини і 292±16,1 мг/г тканини, відповідно. Дослідження естеразної активності показало, що естеразна активність гомогенатів гепатопанкреасу і стравохідної залози за 2-нафтилацетатом, як субстратом, в 3,6 рази та в 6,7 рази більша ніж за 1- нафтилацетатом, відповідно (рис. 1). Отримані дані свідчать про більшу регіоселективність карбоксилестераз травних залоз Rapana venosa до 2-нафтилацетату.

Рис. 1 Естеразна активність гомогенатів травних залоз Rapana venosa (нмоль нафтолу/мг білка за хв)

Належність естераз в гомогенатах травних залоз Rapana venosa до родини карбоксилестераз підтверджена повним пригніченням їх естеразної активності селективним інгібітором карбоксилестераз ди-(п-нітрофеніл)-фосфатом (2,0 ммоль/дм³) (рис. 2).

Було вивчено фізико-хімічні характеристики виділених гомогенатів для визначення оптимальних умов прояву максимальної активності (рис. 3 а,б). Встановлено, що рН-оптимум естеразної активності стравохідної залози становив 7,5; гепатопанкреасу - 5,5. Вивчення рН-профілю стравохідної залози виявило широкий діапазон збереження високої ферментативної активності (рН 3,5--8,0). Визначення термопрофілю активності гомогенатів показало, що термооптимум естеразної активності стравохідної залози становив 37-40 °С, а гепатопанкреасу 45 °С.

Рис. 2 Інгібування естеразної активності гомогенатів травних залоз Rapana venosa біс-(п-нітрофеніл)-фосфатом Fig. 2. Inhibition of esterase activity of the digestive glands homogenates of Rapana venosa by bis-(p-nitrophenyl)-phosphate

Рис. 3 Вплив pH (а) і температури (б) інкубаційного середовища на естеразну активність гомогенатів травних залоз Rapana venosa Fig. 3. Effect of pH (а) and temperature (б) of the incubation medium on esterase activity of Rapana venosa digestive glands homogenates

Вперше нами було здійснено енантіоселективний гідроліз естеру 3-гідрокси-1,4-бенздіазепін-2-ону за допомогою карбоксилестераз Rapana venosa. Об'єктом досліджень був 3-ацетокси-7-бром-5-феніл-1,2-дигідро- 3Н-1,4-бенздіазепін-2-он синтезований у відділі медичної хімії ФХІ імені О.В. Богатського НАН України [14]. З використанням гомогенатів стравохідної залози і гепатопанкреасу проведено енантіоселективний гідроліз 3-аце- токси-7-бром-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону з 50% ступенем трансформації (рис. 4).

Рис. 4 Схема гідролізу субстрату гомогенатами травних залоз рапани Rapana venosa (КЕ - карбоксилестерази)

Рис. 5 Хроматограма енантіомерів 3-ацетокси-5-феніл-7-бром-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону після гідролізу з використанням гомогенатів травних залоз Rapana venosa

В результаті гідролізу утворюється відповідне 3-гідроксипохідне (сполука 2), структура якого підтверджена методом мас-спектрометрії. Відомо, що сполука 2 піддається швидкій рацемізації в умовах інкубаційного середовища [14]. Методом ВЕРХ нами встановлена присутність двох енантіомерів естеру 1 (рис. 5) в співвідношенні R:S = 71:29 при використанні карбоксилестераз гомогенатів обох травних залоз. Тобто енантіомерний надлишок R-енантіомеру становив 42 %.

Переважання R-енантіомеру в суміші свідчить про більшу специфічність карбоксилестераз гомогенатів гепатопанкреасу і стравохідної залози до S-енантіомеру субстрату.

Показана більша активність естераз гомогенатів стравохідної залози Rapana venosa у кислому середовищі (рН 3,5--5,5) та за високих температур (55-70 °С), ніж така гепетопанкреасу. Доведено приналежність досліджуваних ензимів гомогенатів стравохідної залози та гепатопанкреасу до родини карбоксилестераз. Встановлено, що естеразна активність травних залоз гомогенатів Rapana venosa, визначена за 2-нафтилацетатом, перевищує таку за 1-нафтилацетатом в 3,6 та в 6,7 раз, відповідно. В гідролізі 3-ацетокси-7-бром- 5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону з використанням гомогенатів травних залоз Rapana venosa показано переважне утворення R-енантіомеру субстрату (енантіомерний надлишок R-енантіомеру становив 42 %).

Список використаної літератури

1. Топтіков В. А., Ковтун О. О., Алексєєва Т. Г Морфологія та фізіологія черевоногого молюска Rapana venosa. Навчально-методичний посібник. Одеса: Одеський національний університет імені І. І. Мечникова, 2014. 68 с.

2. Лапач С. Н., Чубенко А. В., Бабич П. Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Excel. К.: Морион, 2000. 320 с.

3. Шестеренко Е. А., Романовская И. И., Севастьянов О. В., Андрона- ти С.А. Карбоксилэстеразы в энантиоселективном синтезе органических соединений // Biotechnologia Acta. 2013. Т. 6, № 1. С. 9-21.

4. CalcaterraA., D'AcquaricaI. The market of chiral drugs: Chiral switches versus de novo enantiomerically pure compounds // J. Pharm. Biomed. Anal.2018. V 147. P. 323-340.

5. Douhri H., Sayah F. The use of enzymatic biomarkers in two marine invertebrates Nereis diversicolor and Patella vulgata for the biomonitoring of Tangier's bay (Morocco) // Ecotoxicol. Environ. Saf.2009. V 72, № 2. P. 394-399.

6. Browne M. A., Dissanayake A., Galloway T. S. Organophosphorous biocides reduce tenacity and cellular viability but not esterase activities in a nontarget prosobranch (limpet) // Env. Pollution. 2015. V 203, № 4. P. 208-213.

7. Hartree E. F. Determination of protein: a modification of the Lowry method, that gives a linear photometric response // Anal. Biochem. 1972. V 48, № 1. P 422-427.

8. Hosokawa M. Structure and catalytic properties of carboxylesterase isozymes involved in metabolic activation of prodrugs // Molecules.- 2008.V 13, № 2. P 412-431.

9. MacKenzie L. A., SelwoodA. I., Marshall C. Isolation and characterization of an enzyme from the Greenshell™ mussel Perna canaliculus that hydrolyses pectenotoxins and esters of okadaic acid // Toxicon. 2012. V 60, № 3. P. 406-419.

10. MohieM. K., E. D. Sharaf, A. M. Khalid, et al. Colorimetric determination of simvastatin and lovastatin in pure form and in pharmaceutical formulations // Spectrochim. Acta, Part A. 2010. V 76. P. 406-419.

11. Mozayani А., Raymon L. P. Handbook of Drug Interactions. A dinical and forensic guide.New York, Totowa: Humana Press Inc, 2004. 663 p.

12. Patel R. N. Biocatalysis for synthesis of pharmaceuticals // Bioorg. Med. Chem.- 2018. V 26, № 7. P. 252-1274.

13. Reguera P., Couceiro L., Fernandez N. A review of the empirical literature on the use of limpets Patella spp. (Mollusca: Gastropoda) as bioindicators of environmental quality // Ecotoxicol. Environ. Saf.2018. V 48, № 2. P. 593-600.

14. Shesterenko Ye. A., Romanovska I. I., Sevastyanov O. V., Androna- ti S. A., Pavlovsky V. I., Yurpalova T. A., Wicher B., Kravtsov V. Ch.,Krysko A. A. Enantioselective hydrolysis of 3-hydroxy-1,4-benzodiazepin-2-one esters by pig liver microsomes // J. Mol. Catal. B. Enzym. 2014. V 102. P. 27-33.

15. Toptikov V. A., Totsky V. N., Aleksieieva T. G., Kovtun O. A. Hydrolytic enzymes expressivity in different parts of the Rapana digestive system //Ukr. Biochem. J.- 2016, V 88, № 3.- P. 5-17.

16. Toptikov V. A., Alekseyeva T. G., Kovtun O. O. Hydrolytic enzymes in Rapana venosa digestive system.- Saarbruken: LAP LAMBERT Academi Publishing, 2017. 65 p.

17. Yang K., Lu X. Racemization kinetics of enantiomeric oxazepams: stereoselective hydrolysis of enantiomeric oxazepam 3-acetate in rat liver microsomes and brain homogenate // J. Pharm. Sci. 1989. V 78, № 10. P. 789-795.

Размещено на Allbest.ru