Исследование оптимальных условий получения дубильных веществ из полифенолсодержащего растительного сырья

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Исследовательская работа

Исследование оптимальных условий получения дубильных веществ из полифенолсодержащего растительного сырья

Введение

фенольный дубильный экстракция

Актуальность. В последние годы возрос спрос на препараты растительного происхождения. Растения являются источниками получения лекарственных препаратов, содержащих биологически активные вещества (БАВ), такие как алкалоиды, флавоноиды, эфирные масла, дубильные вещества и др.

Дубильные вещества обладают широким спектром действия:

- влияют на системы нейрогуморальной и нейроэндокринной регуляции;

- обладают противовоспалительной активностью;

- обладают антиоксидантным, вяжущим, антимикробным свойством;

- укрепляет капилляры, усиливают свертываемость крови;

- способствуют выводу солей тяжелых металлов из организма.

Благодаря вышеперечисленным свойствам, дубильные вещества нашли широкое применение в медико-биологическом назначении.

Перспективным источником дубильных и других биологически активных веществ служит кора деревьев, которая является неиспользуемой частью биомассы дерева при переработке древесины и скапливается на деревообрабатывающих предприятиях.

Практическая значимость. В сочетании с другими растительными экстрактами, дубильные вещества используются для изготовления различных косметических препаратов и лечебно-профилактических паст.

Цель работы - оптимизировать процесс получения дубильных веществ.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Выделить дубильные вещества из различных источников полифенол содержащего растительного сырья;

2. определить количественные выход полученных дубильных веществ;

3. Определить оптимальные условия выделения дубильных веществ.

Объекты исследования - кора дуба обыкновенного (Quйrcus rуbur), календула лекарственная (Calendula oficinalis), ромашка аптечная (Matricaria perforatae), тысячелистник обыкновенный (Achillea millefolium).

1. Обзор литературы

1.1 Физико-химические свойства фенольных соединений

Фенольные соединения представляют собой один из наиболее распространенных и многочисленных классов природных соединений, обладающих биологической активностью, отличительная особенность которых состоит в наличии свободного или связанного фенольного гидроксила.

Фенольные соединения классифицируются следующим образом:

· - фенольные соединения с одним ароматическим кольцом (простые фенолы, фенолспирты, фенолкислоты, кумарины, хромоны).

· - фенольные соединения с двумя ароматическими кольцами - флавоноиды, изофлавоноиды, флавононы, флавоны;

· - полимерные фенольные соединения: конденсируемые и гидролизуемые дубильные вещества.

Полимерные фенольные соединения (полифенолы):дубильные вещества, таниды, катехины, эпикатехингаллаты.

Дубильными веществами называют растительные полифенольные соединения различной молекулярной массы (от 500-20000). Это аморфные вещества, образующие при растворении в воде коллоидные растворы, вяжущего вкуса, без запаха. Накапливаются дубильные вещества в различных органах растений, главным образом в коре, древесине деревьев и кустарников, зеленые части большинства растений беднее дубильными веществами.

Из растительного сырья дубильные вещества экстрагируют водой. Очистку экстракта от сопутствующих веществ проводят обработкой органическими растворителями с увеличивающейся полярностью: для удаления терпеноидов, восков, хлорофиллов используют хлороформ; этилацетатом очищают от катехинов и других фенольных соединений. Для выделения индивидуальных компонентов используют методы хроматографии, УФ, ИК спектроскопии.

1.2 Классификация дубильных веществ

Наиболее ранняя классификация была предложена в 1894 г. (Проктер Б.), который разделил дубильные вещества на две группы в зависимости от природы продуктов их пиролиза - разложения при нагревании до 180-200⁰С без воздуха:

1. Пирогалловые дубильные вещества при разложении образуют пирогаллол.

Пирогаллол

2. Пирокатехиновые дубильные вещества при пиролизе образуют пирокатехин.

Пирокатехин

При гидролизе танина промежуточным продуктом является дигаловая кислота, которая далее гидролизуется до галловой кислоты, имеющее следующее строение:



галловая кислота

Растворимость в воде природных танинов не ограниченна. При увеличении концентрации водный раствор танинов становится более вязким и при охлаждении застывает в твердую массу. В водном растворе они обладают кислой реакцией и вяжущим вкусом. Также танины растворяются во многих органических растворителях, например в этиловом спирте, глицерине.

При взаимодействии с органическими основаниями, желатином, клеем танины образуют осадки. Например, 1% раствор желатина, добавленный к раствору, вызывает выпадение осадка, что служит характерной реакцией на присутствие танинов при выявлении их содержания в растениях. В результате исследования конденсированных дубильных веществ Фрейденрберг К. предложил следующую классификацию:

- производные флавонолов-3;

- производные флавандиолов - 3,4;

- производные оксистильбенов.

Конденсированные дубильные вещества хорошо растворимы в воде и органических растворителях. При действии минеральных кислот они образуют красно-коричневые продукты конденсации, называемые флобафенами. С солями тяжелых металлов эта группа дубильных веществ образует окрашенные комплексы.

Катехины - наиболее важные вещества в группе конденсированных дубильных веществ. Это бесцветные кристаллические вещества, легко окисляющиеся при нагревании и на свету. Окисление катехинов протекает при действии на них окислительных ферментов, а также в щелочной среде. Катехины хорошо растворяются в воде, спирте, ацетоне и др. органических растворителях. Характерные представители - катехин и эпикатехин.

катехин эпикатехин

При полимеризации катехина образуются дубильные вещества. Катехины обнаружены во многих съедобных плодах (яблоки, персики, абрикосы, айва, сливы, вишни) и ягодах (земляника, смородина, малина, крыжовник, брусника). Большое их количество содержится в молодых побегах чайного растения (до 20-25% от сухой массы) и акации катеху (отсюда название), в винограде (главным образом в косточках и кожице), бобах какао.

1.3 Пути использования сырья, содержащего дубильные вещества

Лекарственное растительное сырьё, содержащее дубильные вещества используют для приготовления лекарственных средств, обладающих вяжущими и противовоспалительными свойствами. Вяжущее действие связано со способностью дубильных веществ вызывать связывание белков с образованием плотных альбуминатов. При нанесении на слизистые оболочки или раневую поверхность они вызывают частичное свертывание белков слизи или раневого экссудата и приводят к образованию пленки, защищающей от раздражения чувствительные нервные окончания подлежащих тканей. Уменьшение болевых ощущений, ограничение секреторной функции, уплотнение клеточных мембран приводит к уменьшению воспалительной реакции.

Молекулы конденсированных дубильных веществ, представляющие собой линейные полимеры, имеют улиткоподобную конформацию, на поверхности которой также размещены фенольные гидроксилы. Расположение этих групп именно на поверхности молекул танинов считается (Ловкова М.Я и др. 1990) важным для объяснения взаимодействия молекул дубильных веществ с молекулами белков за счёт образования прочных многочисленных водородных связей.

Молекула белка Молекула танина

В связи с тем, что дубильные вещества образуют нерастворимые в воде осадки с солями алкалоидов и тяжелых металлов, очищенные суммы их или водные извлечения из сырья используют в качестве антидотов (противоядий). Дубильные вещества в составе отвара блокируют протоплазму патогенных микроорганизмов, предотвращают воспаления в ЖКТ, инактивируют токсичные белки и другие токсины. Препараты из ЛРС, содержащего дубильные вещества, при наружном применении используются для лечения экзем, острых дерматитов, как кровоостанавливающие средства.

2. Методическая часть

2.1 Структура исследования

Работа выполнялась в ГБОУ школе №1387, лаборатории химии.

2.2 Принципы определения дубильных веществ

Дубильные вещества имеют сложную структуру. Они хорошо извлекаются водой (особенно горячей). Наиболее полное извлечение достигается тем, что образец помещают в тигель с сетчатым дном над кипящей водой в колбе с обратным холодильником.

При выделении из растительного материала получают фракцию дубильных веществ. Для этого используют экстракцию растительного материала органическими растворителями, обрабатывают сырье петролейным эфиром, бензолом, для удаления основной массы хлорофилла, липидов, затем экстрагируют этиловым эфиром, который извлекает некоторые фенольные соединения, в том числе катехины. В завершении сырье экстрагируют этиловым спиртом, при этом в раствор переходят многие дубильные вещества.

Для получения суммы дубильных веществ используются и другие способы: растительное сырье вначале экстрагируют горячей водой, а затем охлажденный водный экстракт обрабатывается последовательно растворителями. Очистка от примесей достигается путем разделения фаз, перегонкой, сублимацией, хроматографией. Чаще всего для обнаружения катехинов и их производных на хроматограммах используют 1% раствор ванилина в концентрированной соляной кислоте.

В литературе описано множество различных способов количественного определения дубильных веществ, самыми распространенными из которых являются:

1. Гравиметрический анализ - основан на количественном осаждении дубильных веществ желатином, ионами тяжелых металлов;

2. Титриметрический анализ - основан на окислительных реакциях;

В растительном сырье дубильные вещества также можно определить качественными реакциями, которые подразделяются на две группы: реакции осаждения и цветные реакции. Для проведения качественных реакций используют водное извлечение из сырья.

а) Желатиновый метод - основан на способности дубильных веществ образовывать нерастворимые комплексы с белками. Водные извлечения из сырья титруют 1% раствором желатина, в точке эквивалентности комплексы желатинотаннаты растворяются в избытке реактива. Титр устанавливают по чистому таннину. Точку эквивалентности определяют путем отбора наименьшего объема титрованного раствора, вызывающего полное осаждение дубильных веществ.

Метод наиболее точный, т.к. позволяет определить количество истинных дубильных веществ. Недостатки: длительность определения и трудность установления точки эквивалентности.

б) Перманганатометрический метод (метод Левенталя-Нейбауера в модификации А.Л. Курсанова). Это фармакопейный метод, основан на легкой окисляемости дубильных веществ калия перманганатом в кислой среде в присутствии индикатора и катализатора индигосульфокислоты, которая в точке эквивалентности переходит в изатин, и цвет раствора меняется от синего до золотисто-желтого.

Особенности определения, позволяющие оттитровать только макромолекулы дубильных веществ: титрование проводится в сильно разбавленных растворах (извлечение разбавляется в 20 раз) при комнатной температуре в кислой среде, калия перманганат добавляется медленно, по каплям, при интенсивном перемешивании.

Метод экономичный, быстрый, прост в исполнении, но недостаточно точный, т.к. калия перманганат окисляет частично и низкомолекулярные фенольные соединения.

3. Физико-химические методы.

а) Фотоэлектроколориметрические методы основаны на способности дубильных веществ образовывать окрашенные соединения с солями трехвалентного железа, кислотой фосфорно-вольфрамовой, реактивом Фолина-Дениса и др.

б) Хроматоспектрофотометрические и нефелометрические методы используют в научных исследованиях.

2.3 Количественное определение дубильных веществ

Количественно дубильные вещества определяли методом перманганатометрии.

Дубильные вещества определяли титрованием в присутствии индикатора индигокармина и рассчитывали по формуле:

3. Экспериментальная часть

3.1 Качественные реакции на дубильные вещества

Для проведения качественных реакций приготовили водное извлечение дубильных веществ из ЛРС.

Экстракт получали следующим образом: 1,0 г. сырья измельчали. Точную навеску материала помещали в плоскодонную колбу вместимостью 200-250 мл, приливали 100 мл экстрагента. Экстракцию проводили в течение 30 мин., на водяной бане. Жидкость охлаждали до комнатной температуры, и около 50 мл процеживали через вату в коническую колбу вместимостью 100 мл.

Дубильные вещества обнаруживали, используя следующие реакции:

* соединяя с 1% раствором желатина в 10% растворе NaCl. Появляется муть, исчезающая при добавлении избытка желатина;

* соединяя с 5% раствором дихромата калия (К₂С₂О₇). Образуется коричневый осадок или муть. Эта же реакция используется и как гистохимическая для обнаружения локализации дубильных веществ в ЛРС;

* соединяя с раствором основного ацетата свинца: образуется белый осадок;

* соединяя с ванилином (в присутствии 70% серной или концентрированной хлористо-водородной кислоты) дубильные вещества, содержащие мономеры катехинового типа, развивают красное окрашивание.

3.2 Определение дубильных веществ

Основным методом определения дубильных веществ является метод перманганат метрии (на все виды сырья).

Метод перманганат метрии

Экстракт получали следующим аналогичным образом. Затем отбирали 5 мл извлечения, помещали в коническую колбу вместимостью 250 мл. Прибавляли 100 мл воды и 5 мл индиго сульфокислоты.

Контрольный опыт: К 105 мл воды добавляем 5 мл индиго сульфокислоты и титровали раствором калия перманганата до золотисто-желтого цвета. Содержание дубильных веществ Х, рассчитывали по формуле:

V-объем раствора калия перманганата, израсходованного на титрование, мл;

V₁-объем раствора калия перманганата, израсходованного на титрование в контрольном опыте;

k-количество дубильных веществ, соответствующее 1 мл раствора калия перманганата, г: для гидролизуемых дубильных веществ равно 0,004154, для конденсированных -0,00582;

m - масса сырья, г;

W - потеря в массе при высушивании сырья, %;

100 - общий объем извлечения, мл;

5 - объем извлечения, взятого для титрования, мл.

В качестве экстрагента использовали водно-спиртовую смесь.

В результате титрования определили, что содержание дубильных веществ в коре дуба составляет 15,6%.

Так как этот метод имеет ряд недостатков: способность KMnO₄ окислять многие природные соединения, относящиеся к различным классам по химическому строению, различный перерасчетный коэффициент, растянутость перехода окраски раствора при титровании, Также этот метод не позволяет объективно оценить содержание дубильных веществ в коре, особенно при их содержании менее 10%.

3.3 Оптимизация условий экстракции дубильных веществ

Проводилось выделение дубильных веществ из различных источников полифенол содержащего растительного сырья (календула, тысячелистник, ромашка и дуб). Максимальный выход был отмечен при использовании коры дуба. Выход дубильных веществ их календулы составил 23,85%, из тысячелистника 10,85%, из ромашки 7,96%, из коры дуба 25,02% (при объединении вытяжек после двукратной экстракции).

Поэтому дальнейшие исследования по оптимизации выделения дубильных веществ проводились именно по коре дуба обыкновенного.

При подборе оптимальных условий экстракции дубильных веществ из коры дуба учитывались следующие факторы: тип экстрагента, температурный режим, время, кратность. Для осуществления данного исследования экстракт получали несколькими способами, изменяя некоторые параметры.

Установлении наилучшего типа экстрагента

При установлении наилучшего типа экстрагента использовали воду, водно-спиртовую смесь, этилацетат, бутанол и ацетон.

По полученным данным наиболее полное извлечение дубильных веществ из сырья происходит при использовании в качестве экстрагента водно-спиртовой смеси.

Определение температурного режима

При изучении оптимальной температуры экстракции использовали следующие режимы извлечения: 20-25⁰С; 70-80⁰С, 100-110⁰С.

Из данных, представленных в таблице видно, что оптимальное извлечение дубильных веществ достигается при 100-110⁰С.

Определение времени экстракции

При изучении оптимального времени экстракции проводили извлечение из сырья в течение 20, 40, 60,80 минут.

Для наиболее максимального извлечения дубильных веществ из экстракта целесообразно использовать экстракцию в течение 80-100 мин.

Выводы

фенольный дубильный экстракция

1. Были выделены дубильные вещества из различных источников полифенол содержащего растительного сырья (календула, тысячелистник, ромашка и дуб). Максимальный выход был отмечен при использовании коры дуба.

2. Определены количественные выходы полученных дубильных веществ;

3. Проведена оптимизация условий выделения дубильных веществ с учетом следующих факторов: тип экстрагента, температурный режим, время, кратность.

4. Установлено, что наиболее полное извлечение дубильных веществ из сырья происходит при использовании:

· в качестве экстрагента водно-спиртовой смеси,

· температурный режим 100-110⁰С,

· время экстракции 80-100 мин,

Литература

1. Бабич С.Р., Медведева Р.А. Факторы, влияющие на процесс извлечения дубильных веществ из растительного сырья. М., «Фармация», 1946, №4, с. 26-29.

2. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. В 2 ч. Ч. 1 - М. Высш. Шк., 1993-88-94 с.

3. Белоусова Н.И. Выделение и анализ природных биологически активных веществ. Томск, 1987.

4. Вахрушев В.И. Производство дубильных экстрактов М., 1990.

5. Георгиевский В.П. Биологически активные вещества лекарственных растений. Новосибирск, «Наука», 1990.

6. Гусева Л.Н., Кулишова М.И., Сивицкая О.К. Пособие по качественному анализу лекарств. - М, Медицина. 1980-208 с.

7. Ермаков А.И. Методы биохимического исследования растений. Ленинград, 1987.

8. Запрометов М.Н. Фенольные соединения, под. ред. Дж. Харборна, пер. с англ., М., Наука, 1993.с. 78-85

9. Иванова С.Д. Дубильные вещества, сапонины, флавоноиды в лекарственных растений. М., 1983.

10. Муравьева Д.А. Фармакогнозия. М., 2002.

11. Практикум по фармакогнозии. Под ред. Ковалева А.А. Попова Е.Н., Харьков, с. 125-191,2004.

12. Соколов С.Л., Замотаев И.П. Справочник по лекарственным растениям. М., «Медицина», с. 182-184, 1990.

13. Химический анализ лекарственных растений. Учеб. пособие \ Под ред. Гринкевич Н.И., Сафронич Л.Н., М.,» Высшая школа», 1983

Размещено на Allbest.ru