Полная исследовательская публикация ___________________________ Гамаюрова В.С. и Васина К.Л.

Размещено на http://www.allbest.ru/

54 ______________ http://butlerov.com/ _______________ ©--Butlerov Communications. 2007. Vol.12. No.7. P.51-54.

Тематический раздел: Кинетика и катализ. ________________ Полная исследовательская публикация

Подраздел: Биохимия. Регистрационный код публикации: 7-12-7-51

г. Казань. Республика Татарстан. Россия. __________ ©--Бутлеровские сообщения. 2007. Т.12. №7. __________ 51

Казанский государственный технологический университет

Влияние ионов металлов на активность ферментного препарата панкреатической липазы

Гамаюрова Валентина Семеновна

и Васина Ксения Леонидовна

Аннотация

Показана принципиальная возможность повышения активности ферментного препарата панкреатической липазы за счет внесения растворов солей CaCl₂, MgCl₂, MgSO₄.

Ключевые слова: активность, ферментный препарат панкреатической липазы, ионы Ca²⁺, ионы Mg²⁺.

Введение

Наблюдающийся в последние десятилетия значительный прогресс в исследовании ферментов обусловлен, с одной стороны, глубоким фундаментальным интересом к ферментам как высокоэффективным катализаторам химических реакций, а с другой, - непре-рывно расширяющимися областями применения ферментов при решении многочисленных практических задач [1].

Липазы (триацил-глицеролгидролаза, классификационный номер КФ3.1.1.3) ферменты, гидролизующие эфиры глицерина и жирных кислот, широко встречаются у животных, растений и микроорганизмов [2]. Большой интерес к этим ферментам в первую очередь связан с их важной ролью в метаболизме липидов и регуляции липидзависимых функций в организме [3]. Кроме того, липазы уникальные биокатализаторы, имеющие распространенную субстратную специфичность и получившие достойное применение в тонком органическом синтезе, нефтехимии, производстве фармацевтических препаратов, медицине, пищевой и бумажной промышленности [2, 3]. В связи с широкими возможностями применения ферментных препаратов липаз одной из важнейших задач является повышение их ферментативной активности.

В литературе имеются данные о том, что на каталитическую активность ферментных препаратов могут оказывать влияние различные физико-химические воздействия. Показана возможность изменения ферментативной активности при воздействии на ферментный препарат магнитного изотопного эффекта, лазерной и ультразвуковой обработки, кратковременной тепловой обработки, целого ряда различных соединений [4]. ферментный панкреатический липаза препарат

В результате изучения активаторов липаз выяснилось, что для каталитического действия липазы никакого кофактора не требуется. Имеется, однако, множество агентов, которые могут оказывать влияние на скорость и ход липолиза. Наиболее важными активаторами липолиза являются хлористый натрий, ионы кальция, соли желчных кислот и альбумин [5].

Данная работа посвящена изучению влияния ионов металлов на активность ферментного препарата Lipase from porcine pancreas, Type II.

Результаты и их обсуждение

Активация липолиза хлористым кальцием уже использовалась многими исследователями и неоднократно находила подтверждение [5]. Известно, что липазы ингибируются продуктами реакции свободными жирными кислотами и обнаруженная активация ферментов в присутствии ионов кальция, возможно, обусловлена преципитацией жирных кислот в виде нерастворимых кальциевых соединений [6]. Однако предполагается, что ионы кальция могут оказывать непосредственное действие на фермент [5, 6].

В работе было рассмотрено влияние ионов кальция на активность ферментного препарата панкреатической липазы (porcine pancreas, Type II). Проведенные исследования позволили установить, что при отсутствии ионов Ca²⁺ ферментный препарат обладает пониженной активностью. В то же время внесение раствора хлористого кальция приводит к значительной его активации. Полученные данные представлены на рис. 1.

Рис. 1 Влияние хлористого кальция на активность ферментного препарата панкреатической липазы

На рис. 1 показано, что активность ферментного препарата панкреатической липазы плавно возрастает с повышением концентрации ионов Са²⁺ и достигает максимального значения при их содержании в среде 0.05 моль/л. При дальнейшем увеличении содержания ионов Са²⁺ в среде активность препарата снижается.

Внесение хлористого кальция в раствор ферментного препарата панкреатической липазы в концентрации 0.05 моль/л позволяет повысить активность почти в 2 раза относительно первоначальной.

Можно предположить, что ионы магния будут обладать подобными свойствами. Поэтому в данной работе также рассматривалось влияние ионов Mg²⁺ на активность ферментного препарата панкреатической липазы. Было показано, что ионы Mg²⁺ наряду с ионами Са²⁺ способствуют повышению липазной активности, но в меньшей степени. Полученные данные представлены на рис. 2.

Рис. 2 Влияние хлористого магния на активность ферментного препарата панкреатической липазы

Из данных представленных на рис. 2 видно, что внесение в среду хлористого магния в концентрации 0.04 моль/л способствует максимальному повышению активности ферментного препарата панкреатической липазы почти в 1.6 раз по сравнению с первоначальной активностью. Дальнейшее увеличение содержания в среде ионов Mg²⁺ приводит к снижению липазной активности.

Помимо хлористого магния в качестве источника ионов Mg²⁺ в работе был использован сульфат магния, что дает возможность оценить влияние аниона на ферментативную активность. Данные представлены на рис. 3.

Рис. 3 Влияние сульфата магния на активность ферментного препарата панкреатической липазы

Как видно из рис. 3, увеличение концентрации сульфата магния в среде первоначально приводит к активации ферментного препарата. Так внесение в среду 0.03 моль/л сульфата магния способствует повышению активности ферментного препарата в 1.3 раза по сравнению с первоначальной. Дальнейшее увеличение содержания в среде сульфата магния приводит к снижению ферментативной активности и при концентрации сульфата магния в среде свыше 0.06 моль/л он становится ингибитором ферментативной активности. Из этого следует, что на активность ферментного препарата оказывают влияние, как катионы, так и анионы.

Экспериментальная часть

В работе использовали коммерческий препарат Lipase from porcine pancreas, Type II (L3126), предоставленный компанией Sigma Chemical Co. (USA). Оливковое масло “BORGES” (Aceites Borges Pont, S.A.U.), желатин пищевой (П-ЙЙ).

Активность ферментного препарата панкреатической липазы определяли модифицированным методом Ота, Ямада.

Приготовление субстрата: 25 мл оливкового масла смешивали с 37.5 мл 3%-го раствора желатина. Полученную эмульсию тщательно перемешивали в течение 5 мин.

Приготовление ферментного раствора: 10 мг ферментного препарата панкреатической липазы растворяли в 0.0-0.09 М растворе соли (CaCl₂, MgCl₂, MgSO₄) в фосфатно-цитратном буфере с рН 7.4.

Техника определения: 2.5 мл эмульсии субстрата и 2.0 мл фосфатно-цитратного буфера с рН 7.4 помещали в колбу на 100 мл. Смесь выдерживали на водяной бане при температуре 37 °С в течение 10 мин. Затем к смеси добавляли 1 мл раствора ферментного препарата и хорошо перемешивали. Полученную смесь выдерживали при температуре 37 °С в течение 60 мин, после чего немедленно добавляли 15 мл 96% этилового спирта для прекращения реакции. Раствор титровали 0.05н водным раствором NaOH в присутствии 1% спиртового раствора фенолфталеина до устойчивой розовой окраски.

Приготовление контрольной пробы: к смеси субстрата и фосфатно-цитратного буфера с рН 7.4, выдержанной при 37 °С, добавляли 15 мл 96% этилового спирта, затем 1 мл ферментного раствора и смесь немедленно титровали.

Разность между результатами титрований контрольной и опытной проб соответствует коли-честву 0.05н водного раствора NaOH, которое пошло на нейтрализацию жирных кислот, образо-вавшихся из оливкового масла под действием фермента.

Во всех экспериментах для каждой концентрации раствора соли проводилось 6-ти кратное повторение замеров липолитической активности. Полученные данные проанализированы по критерию Стьюдента (уровень значимости 0.95). Погрешность измерений не превышает 2%.

Выводы

1. Установлено, что ионы кальция и магния в определенных оптимальных концентрациях позволяют повысить активность ферментного препарата панкреатической липазы.

2. Показано, что введение раствора хлорида кальция в оптимальной концентрации (0.05 моль/л) позволяет повысить активность ферментного препарата почти в 2 раза. В то же время введение раствора хлорида магния и сульфата магния в концентрациях 0.04 моль/л и 0.03 моль/л соответственно, способствует повышению липазной активности в 1.6 и 1.3 раза соответственно.

3. В процессе работы установлено, что на активность ферментного препарата панкреати-ческой липазы могут оказывать влияние, как катионы, так и анионы.

Литература

[1] Каталитические центры гидролаз: структура и каталитический цикл. С.Д. Варфоломеев, И.А. Гариев, И.В. Упоров. Успехи химии. 2005. Т.74. №1. С. 67-83.

[2] Биферментная система липаза/липоксигеназа в обращенных мицеллах АОТ в октане. И.М. Павленко и др. Биоорганическая химия. 2002. Т.28. №1. С. 50-55.

[3] Микробные липазы в биотехнологии. К.Д. Давранов. Прикладная биохимия и микробиология. 1994. Т.30. №4-5. С. 527-533.

[4] Активация ферментных систем и микроорганизмов. И.А. Попадич, С.Е. Траубенберг. В сб. Совершенствование пищевой технологии и техники. М.: МТИПП. 1981. ??? c.

[5] Липолитические ферменты. Х. Брокерхоф, Р. Джексен. М.: Мир. 1978. 388 с.

[6] Принципы и методы диагностической энзимологии. Д. Вилкинсон. М.: Медицина. 1981. 624 с.

Размещено на Allbest.ru