Взаимодействие глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы человека с кофактором по данным молекулярного докинга

Полная исследовательская публикация ____________________ Макшакова О.Н. и Ермакова Е.А.

Размещено на http://www.allbest.ru/

22 _______________ http://butlerov.com/ ______________ ©--Butlerov Communications. 2013. Vol.35. No.7. P.19-23.

Тематический раздел: Квантово-химические исследования. Полная исследовательская публикация

Подраздел: Биохимия. Регистрационный код публикации: 13-35-7-19

г. Казань. Республика Татарстан. Россия. __________ ©--Бутлеровские сообщения. 2013. Т.35. №7. _________ 19

Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН

Взаимодействие глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы человека с кофактором по данным молекулярного докинга

Макшакова Ольга Николаевна

и Ермакова Елена Андреевна

Аннотация

глицеральдегид никотинамиддинуклеотид молекулярный докинг

Проведен анализ взаимодействия тетрамера глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы с кофактором НАД расчетными методами. Метод молекулярного докинга был применен для определения энергия взаимодействия молекул кофактора с белком, метод Gaussian network model был использован для оценки изменения подвижности основной цепи белка в результате связывания кофактора. Показано, что молекулы кофактора образуют устойчивые комплексы с тетрамером белка, при этом энергия взаимодействия одной молекулы кофактора с разными субъединицами апоформы белка различаются незначительно. В то же время присутствие других молекул НАД в комплексе систематически уменьшает энергию взаимодействия белок - кофактор, что может давать вклад в отрицательную кооперативность связывания молекул кофактора c тетрамером глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы.

Ключевые слова: глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, никотинамиддинуклеотид, молекулярный докинг.

Введение

Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД) является одним из ферментов гликолиза и катализирует превращение глицеральдегид-3-фосфата в 1,3-дифосфоглицерат при одновременном восстановлении никотинамиддинуклеотида (НАД), кроме того, этот белок вовлечен в ряд клеточных процессов, включая регуляцию экспрессии генов, репарацию ДНК и другие процессы [1, 2].

Понимание молекулярных механизмов функционирования ГАФД, в частности механизмов взаимодействия белка с кофактором, необходимо как базис для разработки новых биотехнологических и фармакологических приложений.

ГАФД является тетрамерным белком, для которого одним из характерных свойств является кооперативность.

Понятие кооперативности относится к специфическому конформационному поведению мультидоменных белков. О положительной кооперативности говорят, когда связывание лиганда одной из субъединиц приводит к увеличению связывающей способности лиганда во второй субъединице. При отрицательной кооперативности, наоборот, наблюдается понижение сродства к лиганду во второй субъединице в результате связывания лиганда первой субъединицей. Экспериментальные исследования свидетельствуют, что ГАФД демонстрирует коопе-ративность по отношению к связыванию НАД, знак которой различается для ферментов из разных источников [1].

Существуют ряд гипотез о молекулярных механизмах, ответственных за проявление кооперативности ГАФД. Были предложены модели НАД-индуцированных конформационных изменений в тетрамере, когда незаполненные субъединицы меняют свою конформацию при заполнении одной из субъединиц, и модели предсуществующей асимметрии субъединиц [1]. В данной работе на примере соматического изофермента человека мы промоделировали, как возможная неэквивалентность субъединиц холоформы тетрамера влияет на их сродство к кофактору и оценили электростатическое влияние связанных молекул кофактора на сродство соседних субъединиц.

Экспериментальная часть

Метод молекулярного докинга. Анализ взаимодействия тетрамера ГАФД с кофактором НАД проводился методом молекулярного докинга с использованием программы Autodock4.2 [3]. Расчет проводился для соматической изоформы ГАФД человека, PDB код кристаллографической структуры 1u8f [4].

Autodock рассчитывает энергию взаимодействия макромолекул на трехмерной пространственной решетке, которая окружает центр связывания кофактора, шаг решетки равен 0.35?. Расчет полной энергии взаимодействия в данном методе осуществляется с учетом электростатических, Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий, водородных связей, эффекта сольватации и торсионной энтропии.

?G = ?G _vdw + ?G _hbond + ?G _elec + ?G _tor + ?G _sol

где ?G _vdw - энергия Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий, ?G _hbond - энергия водородных связей, ?G _elec - электростатическое взаимодействие, ?G _sol - энергия сольватации,

?G _tor - вклад, оценивающий торсионную энтропию.

AutoDock использует Lamarckian genetic algorithm для поиска конфигурации протеин-лигандного комплекса с минимальной свободной энергией. Белок рассматривается как жесткая структура, в то время как в лиганде разрешено вращение вокруг ординарных связей.

Метод Gaussian network model (GNM) [5] был использован для оценки изменения подвижности основной цепи белка в результате связывания кофактора. Этот метод основан на упрощенной модели представляющей белок как сеть связанных узлов, взаимодействие между которыми описывается гармоническим потенциалом и позволяет оценить подвижность аминокислотных остатков исходя из структуры белка.

В-фактор характеризует среднеквадратичные флюктуации Сб атомов

где скобки обозначают усреднение по времени, r_i характеризует положение Сб атома каждого аминокислотного остатка.

Результаты и их обсуждение

Поскольку исходная кристаллографическая структура содержит только три кофактора в субъединицах P, Q и R, а субъединица O пустая, здесь мы приводим результаты докинга молекул кофактора к трем соответствующим субъединицам.

Докинг проводился в два этапа. На первом этапе одна молекула кофактора добавлялась к разным субъединицам апоформы белка. Апо-форма белка была получена на основе кристаллографической структуры холоформы белка путем удаления из нее молекул кофактора.

Были оценены энергии взаимодействия молекулы кофактора с белком (преимущественно с НАД-связывающим карманом данной субъединицы) и среднеквадратичное (RMSD) отклонение, которое характеризует насколько расчетное положение кофактора в кармане отличается от экспериментально определенного.

Результаты показывают, что RMSD для трех субъединиц находятся в диапазоне 0.42-0.57 Е (таблица), что говорит о довольно точном позиционировании кофактора методом молекулярного докинга по сравнению с экспериментом, что, в свою очередь, обеспечивает надежные оценки энергии связывания (в пределах систематической погрешности параметризованного метода).

Анализ энергий взаимодействия полученных на этом этапе показывает, что кофактор образует устойчивые комплексы с тетрамером, константы диссоциации находятся в пределах 10-25 nM, что согласуется с экспериментальными данными, которые варьируются в диапазоне 10^-9-10^-4М [6].

Свободные энергии взаимодействия НАД с субъединицами тетрамера различаются незначительно, это отличие может быть вызвано статистической погрешностью, но может также отражать небольшое отличие в структурах мономеров.

Таблица

Некоторые параметры взаимодействия глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы с молекулами кофактора НАД

Различие в структурах мономеров может быть охарактеризовано сравнением RMSD различных субъединиц тетрамера. RMSD субъединиц P, Q, R относительно субъединицы O находится в пределах 0.34, 0.268, 0.237, соответственно, наибольшее различие наблюдается для аминокислотных остатков, находящихся на петлях, что характеризует их повышенную подвижность по сравнению с остатками бета-слоев и альфа спиралей. Подвижность различных участков белка можно охарактеризовать с помощью В-фактора.

Экспериментальные значения B-фактора для молекулы ГАФД взято из PDB файла 1u8f. Расчет проведен с помощью метода GNM. Результаты представлены на рис. 2. Красным цветом показано экспериментальное значение B-фактора для каждого аминокислотного остатка одной субъединицы ГАФД, черным - расчетные значения.

Коэффициент корреляции расчетных и экспериментальных значений равен 0.57 для субъединиц P и R, и 0.71 для субъединиц Q и O. Расчет в целом хорошо отражает основные характеристики подвижности различных участков белка, несмотря на то, что он основан на упрощенной модели белка.

Рис. 1 Экспериментальные значения B-фактора (красным цветом) [4] и значения, рассчитанные методом GNM (черным цветом), для аминокислотных остатков субъединицы P глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Линиями внизу обозначена вторичная структура соответствующих участков: красным цветом - альфа-спиралей, синим цветом - бета-слоев

Связывание кофактора слабо влияет на изменение структуры белка, однако приводит к небольшому, но заметному изменению подвижности ряда остатков. Сравнение расчетных величин В-фактора холо- и апоформ ГАФД на основании кристаллографической структуры и кристаллографической структуры без кофакторов, соответственно, показало понижение подвижности остатков, формирующих НАД-связывающий карман, характерное для всех субъединиц при связывании кофактора.

Рис. 2 Схематическое изображение трехмерной структуры глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы с молекулами никотинамиддинуклеотида. Субъединицы O, P, Q и R выделены разными цветами. Молекулы кофактора представлены голубым цветом. Зеленым цветом выделена область кофактор-связывающего кармана субъединицы P

Для определения характера кооперативности связывания кофактора, был выполнен второй этап расчетов. Докинг кофактора осуществлялся к пустой субъединице P, Q, или R холоформы белка, в которой другие две субъединицы, имеющие кофактор в исходной кристаллографической структуре, были заняты. Результаты приведены в таблице.

Сравнение RMSD позиционирования кофактора в первой серии расчетов и во второй позволяет заключить, что докинг кофактора в кофактор-связывающий карман в холоформе осуществляется также как и в апоформе, то есть наличие кофакторов в соседних субъединицах не влияет на положение кофактора в данной субъединице при последовательном их заполнении, но влияет на энергию взаимодействия молекул.

Анализ полученных результатов свободной энергии взаимодействия кофактора с окружением позволяет сделать вывод, что присутствие молекулы кофактора в комплексе систематически уменьшает энергию взаимодействия белок - кофактор. Несмотря на то, что влияние соседних молекул кофактора небольшое, оно может давать вклад в отрицательную копе-ративность связывания кофакторов с тетрамером ГАФД.

Выводы

Таким образом, проведен анализ взаимодействия тетрамера глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы с НАД методом молекулярного докинга. Показано, что молекулы кофактора образуют устойчивые комплексы с тетрамером белка, при этом энергия взаимодействия одной молекулы кофактора с разными субъединицами апо-формы белка различаются незначительно. Присутствие других молекул НАД в комплексе систематически уменьшает энергию взаимодействия белок - кофактор, что может давать вклад в отрицательную кооперативность связывания кофакторов с тетрамером ГАФД.

Литература

[1] N.W. Seidler. GAPDH: Biological Properties and Diversity. Adv. Exp. Med. Biol. 2013. Vol.985 P.1-295.

[2] M.A. Sirover. Subcellular dynamics of multifunctional protein regulation: Mechanisms of GAPDH intracellular translocation. Journal of Cellular Biochemistry. 2012. Vol.113. P.2193-2200.

[3] G.M. Morris, R. Huey, W. Lindstrom, M.F. Sanner, R.K. Belew, D.S. Goodsell, A.J. Olson. AutoDock4 and AutoDockTools4: Automated docking with selective receptor flexibility. J. Comput. Chem. 2009. Vol.30. P.2785-2791.

[4] J.L. Jenkins, J.J. Tanner. High-resolution structure of human-D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Acta Crystallogr. Sect. D. 2006. Vol.62. P.290-301.

[5] L.-W. Yang, I. Bahar. Coupling between catalytic site and collective dynamics: A requirement for mechanochemical activity of enzymes. Structure. 2005. Vol.13. P.893-904.

[6] C.S. Furfine, S.F. Velick. The acyl-enzyme intermediate and the kinetic mechanism of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase reaction. J. Biol. Chem. 1965. Vol.240. P.844-855.

Размещено на Allbest.ru