Комплекс рутина с фосфатидилхолином

Размещено на http://www.allbest.ru/

Комплекс рутина с фосфатидилхолином

Представлены результаты исследований взаимодействия молекулы рутина (5,7,3?,4?-тетраокси-флавон-3-рутинозид) и клеточного фосфатидилхолина (лецитин). Полуэмпирическим методом квантовой химии AM1, методом функционала плотности (DFT) и ЯМР спектроскопией на ядрах 31Р и 13С исследованы основные структурные параметры и электронное строение рутина и лецитина, их комплекса, а также энергии комплексообразования.

Флавоноиды представляют широкий класс фенольных соединений растительного происхождения. В настоящее время выделено и идентифицировано свыше 6000 молекул этого класса и это количество непрерывно увеличивается [1, 2, 3]. Флавоноиды обладают широким спектром биологической активности. Они проявляют противомикробную, противоаллергическую, противовирусную и другие виды активности [4, 5]. При проведении опытов с животными отмечены противораковые свойства флавоноидов [6]. Отмечается положительное влияние этой группы молекул на здоровье человека при эпидемиях. В качестве антиоксидантов флавоноиды предлагаются для защиты от окислительного воздействия на клеточные мембраны. Они также способны нейтрализовать гидроксильные радикалы [7].

Исследователи отметили свыше 40 видов биологической активности флавоноидов. Однако в литературе содержится мало сведений о молекулярном механизме действия этой группы соединений, а локализация флавоноидов в клеточной мембране является предметом дискуссии. В предыдущих работах было показано, что сопряженные системы, какими являя-ются флавоноиды, образуют комплексы с клеточными фосфолипидами через систему р-электронов [8, 9]. Данная работа посвящена исследованию взаимодействия клеточного фосфатидилхолина с рутином - типичным представителем группы флавоноидов, сохраняющих основную структуру при изменении некоторых заместителей.

В 1961 г. окончил физический факультет КГУ им. Ленина (г. Казань), работал в Башкирском филиале АН. В 1972 г. защита кандидатской диссертации в КГУ, в 1991 г. защита докторской диссертации в МГУ. С 1982 г. по настоящее время заведующий кафедрой медицинской физики Башкирского государственного медицинского университета.

Область научных интересов: молекулярный механизм взаимодействия биоактивных соединений с фосфолипидами клеточных мембран, квантовая химия, радиоспектроскопия.

Рисунок. Строение комплекса молекулы рутина и фосфатидилхолина

молекула рутин клеточный

Предварительные расчеты проводились методами молекулярной механики [10] и полуэмпирическим методом AM1 с использованием градиента Polak-Ribiere [11]. Для поиска геометрического строения устойчивых форм комплекса проводились расчеты с начальными конфигурациями расположения центров молекул, составляющих комплекс по сетке с последующей оптимизацией геометрии (рисунок). Полученная структура и энергия комплексообразования уточнялись с использованием программы «Природа» [12], функционалом PBE [13], включающий градиент электронной плотности и трехэкспонентный набор базисных функций гауссова типа.

В эксперименте использовался фосфатидилхолин, выделенный из куриных яиц [14]. Очистку лецитина проводили методом колоночной хроматографии. Чистота его контролировалась по ЯМР спектрам и методами тонкослойной хроматографии. Для работы был использован стандартный образец 3,5,7,3?,4?-тетраоксифлавон-3-рутинозид (SIGMA (R5142)). Исследовались растворы в дейтерированном хлороформе с концентрацией лецитина 0.001М. Необходимо отметить, что растворимость рутина в хлороформе достаточно мала. Значение рD среды поддерживалось равным 7.1, эта величина контролировалась прибором ОР-156/3 (МОМ, Венгрия), при указанном значении зависимость химических сдвигов спектров ЯМР от рD является наиболее слабой [15]. Точность измерений равна 0.01.

Спектры ЯМР 31Р фосфатидилхолина и его смеси с рутином записывались на модернизированном спектрометре TESLA BS-567A с рабочей частотой на ядрах 31Р ? 40.4 МГц [16]. Спектры ЯМР 13С флавоноидов, фосфатидилхолина и их смесей записывались на спектрометре АМ-300 ("Bruker" ФРГ) с рабочей частотой на ядрах 13С - 75 МГц при температуре 30 °С, которая поддерживалась с точностью 0.2 °С и относительно низких концентрациях лецитина и рутина. Хотя малые концентрации приводят к возрастанию времени накопления сигналов, увеличение концентрации вызывает уширение линии поглощения из-за образования мицелл, что приводит к снижению точности измерения химических сдвигов. Одновременно при увеличении концентрации уменьшается число точек связывания флавоноидов, так как они оказываются внутри мицелл, что приводит к уменьшению интенсивности спектральных линий. Концентрация флавоноидов также должна быть низкой. При увеличении концентрации они образуют цепочечные структуры через водородные связи, усложняющие анализ спектров.

Таблица. 1. Конформационные изменения при комплексообразовании по DFT методу

Многократно проведенные расчеты из различных исходных точек локализации показали, что указанная молекула образует с клеточным фосфатидилхолином многочисленные комплексы. Согласно данным методов AM1, DFT наиболее устойчивый комплекс образуется когда кольцо С рутина взаимодействует с холиновой группой лецитина, и при этом, одновременно кольцо А связывается с фосфатной группой.

Анализ структурных данных расчета методом DFT показал, что при образовании комплекса происходит

Таблица. 2. Изменения положительного заряда при комплексообразовании, а.е

значительное изменение конформации в кольцах А и С рутина, в холиновой, фосфатной и карбонильной группах лецитина, двойные связи растягиваются, а одинарные сжимаются (табл. 1). Кольцо В теряет свою первоначальную плоскую структуру, кольцо С вращается по связи С[14]-C[18] на 30°. Расстояние от центра кольца С до атома азота лецитина составляет 5.38 Е, от центра кольца А до атома фосфора 5.27 Е, O[86]-H[12] 4.6 Е, О[97]-Н[11] 1.77 Е. Энергия комплексообразования -10.6 ккал/моль. Необходимо заметить, что энергия комплексообразования получается как малая разность больших величин и определяется со значительной погрешностью.

Таблица. 3. Электронное строение и заряд в а.е. в приближении метода AM1

При образовании комплекса происходит перераспределение заряда во взаимодействующих молекулах. Наиболее значительные изменения представ-лены в табл. 2. Уменьшение суммарного положительного заряда рутина на 0.237 а.е. привзаимодействии соответствует увеличению суммарного заряда осфатидилхолина на ту же величину. Результаты квантовохимических расчетов изменения электронного строения атома фосфора и азота лецитина в свободном состоянии и при взаимодействии с рутином представлены в табл. 3.

Использованные методы передают качественную картину и в нашем случае показали, что данный комплекс формируется за счет кулоновского взаимодействия, которое характеризуется перераспределением части заряда между компонентами комплекса. Структурные данные исследованного комплекса близки к результатам, полученным в работе с другими молекулами группы флавоноидов [17].

2. Спектроскопическое исследование комплекса рутина с фосфатидилхолином

Фосфатидилхолин при взаимодействии с флавоноидами связывается с различными кольцами. Они, в свою очередь, локализуются на разных точках лецитина посредством водородных связей [18]. Эти взаимодействия подтверждаются данными ЯМР спектроскопии.

Формирование комплекса сопровождается изменением химического сдвига от 31Р фосфатной группы лецитина на 0.6 м.д. в слабое поле. Количество накоплений обеспечивало соотношение сигнал/шум более 20. В этих условиях и разрешающей способности измерения частоты 0.1 Гц спектрометра, значение химического сдвига определялось с точностью 0.005 м.д. Усреднение полученных химических сдвигов нескольких измерений, показывают, что погрешность линии от 31Р в данных препаратах составляет 0.05 м.д.

Химический сдвиг от С[75], С[76], С[77] равный 53.23 м.д. у свободного лецитина смещается в слабое поле при формировании комплекса на 1.585 м.д. Эти изменения химического сдвига близки к значениям, полученным при комплексообразовании лецитина с кверцитином - другой молекулой из группы флавоноидов [9]. Одновременно наблюдается изменение химического сдвига от С[80], примыкающего к фосфатной группе лецитина, в сторону сильного поля на ~2.0 м.д. в комплексе. Во взаимодействующей системе “флавоноид - лецитин” возникает значительное число комплексов, между которыми происходит быстрый обмен в шкале времени ЯМР. Поэтому, метод ЯМР, при исследованной температуре регистрирует усредненные величины химических сдвигов.

Заключение

молекула рутин клеточный

Результаты квантово-химических расчетов взаимодействия рутина с фосфатидилхолином, а также спектры ЯМР на ядрах 31Р и 13С позволяют предположить, что наиболее вероятными являются комплексы с системой р-электронов цикла С с одновременным формированием водородной связи ?ОН группы кольца А с фосфатной группой фосфатидилхолина и карбонильной группой гидрофильной части молекулы, содержащей двойную связь. Исследованный комплекс является достаточно прочным и блокирует активные центры фосфатидилхолина.

Такой механизм комплексообразования дает возможность объяснить сохранение биологической активности при значительных изменениях заместителей, когда возникают стерические препятствия для сближения активных центров на расстояние, необходимое для возникновения взаимодействия.

Литература

1.R. Kahl. Protective and Adverse Biological Actions of Phenolic Antioxidants H.Sies. London. 1991. Р.245-273.

2.[2] S.A. van Acker, D.J. van der Berg, M.N. Tromp, D.H. Griffioen, W.P. van Bennekom, W.J. van der Vijgh, A. Bast. Free Radic. Biol.Med. 1996. Vol.20. Р.331.

3.C.A. Rice-Evans, N.J. Miller, G. Paganga. Free Radic. Biol.Med. 1996. No.20. Р.933.

4.R.T. Davies, I. Moodley. Pharmacol.Them. 1982. No.17. Р.279.

5.E.Jr. Middelton, and C. Kandaswami. The Impact of Plant Flavonoids on Mammalian Biology: Implications for Immunity, Inflammation and Cancer. (J.B. Harbone). London. 1993. Р.619-652.

6.F.V. So. N. Guthrie, A.F. Chambers, M. Moussa, and K.K. Caroll. Nutr.Cancer. 1996. Vol.26. Р.167.

7.P.G. Pietta, J.Nat.Prod. 2000. Vol.63. Р.1035.

8.Насибуллин Р.С., Спирихин Л.В., Пономарева В.А. Биофизика. 1991. Т.36. №4. С.594-598.

9.Насибуллин Р.С., Никитина Т.И., Афанасьева Ю.Г., Насибуллин Т.Р., Спирихин Л.В. Комплекс 3,5,7,3',4'-пентаоксифлавонола с фосфатидилхолином. Хим-фарм. журн. 2002. Т.36. №9. С.33.

10.M.P. Allen, D.J. Tidesley. Computer simulation of liquids. Clarendon Press, Oxford. 1987. Р.89-94.

11.R. Fletcher. Methods of optimization. N.Y. John Wiley & Sons. 1980. P.45.

Размещено на Allbest.ru