Кристаллизация биологических жидкостей – перспективы использования при диагностике

Размещено на http://www.allbest.ru/

Кристаллизация биологических жидкостей - перспективы использования при диагностике

Перспективным направлением современной функциональной и лабораторной диагностики является поиск новых неинвазивных, безболезненных и удобных для пациента экспресс-методов, позволяющих проводить исследования в короткие сроки без переоснащения существующих лабораторий и привлечения специально обученного персонала высокой квалификации.

В данной работе рассмотрены перспективы использования для диагностических целей данных по составу и микрокристаллизации биологических жидкостей, а именно слюны человека. Изучение кристаллизации биологических жидкостей возможно как в нативном состоянии, так и при воздействии различных неблагоприятных факторов. Одним из негативных факторов, действующих на организм человека, является электромагнитное излучение. Установлено, что электромагнитное излучение способствует нарушению структурных и минерализующих свойств слюны, что может привести к «компьютерному некрозу зубов». Предложен метод оценки типа микрокристаллизации слюны для определения уровня воздействия электромагнитного излучения на человека. Показана возможность проведения лабораторной диагностики уровня физической нагрузки на организм человека с целью выявления уровня адаптированности и резервных возможностей организма, что применимо для массовых исследований.

Полученные данные могут быть использованы для выявления механизмов гомеостаза в полости рта человека и прогнозирования патологии, которая может возникать при его нарушении, а также для планирования профилактических и лечебных мероприятий.

С каждым днем технологии лабораторной и функциональной диагностики дополняются альтернативными методиками, которые за короткий срок позволяют, как выявить многие заболевания на ранней стадии, так и оценить физическое состояние человека.

Так, слюна человека может использоваться в качестве биологической жидкости для анализа различных маркеров, таких как электролиты, гормоны, лекарства, антитела и т.д. Такая диагностика вполне оправдана, ведь помимо 99% воды слюна содержит растворенные в ней анионы Cl-, PO43-, CO32-, SCN-, I-, Br-, F-, SO42-; катионы Na+, К+, Ca2+, Mg2+ и микроэлементы Fe3+, Fe2+, Cu2+, Mn2+, Ni2+, Li+, Zn2+ и т.д.; органические вещества - белок и его фракции (альбумин, глобулины), аминокислоты, муцин; ферменты - амилазу, лактазу, лизоцим, калликреин, паротин, а также холестерин, глюкозу, молочную кислоту и витамины С, B1, B12, Н, К [1-4]. Кроме того, слюна по сравнению с кровью является динамичной средой, отражающей ежедневные изменения в организме.

Известно, что использование слюны позволяет проводить диагностику «микроэлементозов» - заболеваний, связанных с недостаточным или избыточным поступлением и содержанием в организме определенных макро- и микроэлементов [5-7].

Антропогенное загрязнение окружающей человека природной среды вызывает серьезную озабоченность своими негативными последствиями для здоровья различных групп населения и нации в целом. В настоящее время все большее значение приобретают техногенные микроэлементозы. Накопленные к настоящему времени научные и медицинские данные о роли минеральных элементов в функционировании отдельные органов, систем и организма человека в целом, данные о последствиях для здоровья человека дефицита биогенных, жизненно необходимых элементов и избытка токсичных могут быть обобщены и использованы в диагностической и лечебной практике [8].

Основное преимущество проведения диагностики по составу слюны состоит в том, что сбор образцов слюны - это неинвазивная, безболезненная и удобная для пациента процедура. Собрать образцы слюны можно в любое время, днем и ночью, эту процедуру можно выполнить в обстоятельствах, когда отбор крови невозможен. Таким образом, слюна может быть альтернативой широко используемой сыворотке крови. Диагностика по слюне может быть востребована в таких областях как спортивная медицина, психология, педиатрия, геронтология и других. Образцы слюны стабильны 7 дней при комнатной температуре, 4 недели при 2-8 °С, длительный период при температуре ниже -20 °С. Такая высокая стабильность дает возможной пересылку образцов слюны обычной почтой.

Наиболее перспективной является новая диагностическая технология - морфологическое исследование биологических жидкостей [9-11]. Кристаллографический (тезиграфический) метод обладает значительной чувствительностью, и поэтому нашел широкое применение, сначала в практике судебно-химического анализа, а затем и в медицине [12, 13].

Изучение кристаллизации биологических жидкостей возможно как в нативном состоянии, так и при воздействии различных неблагоприятных факторов [14, 15]. Одним из негативных факторов, действующих на организм человека, является электромагнитное излучение. Человек всегда жил в среде, где постоянно присутствует электромагнитные волны различной частоты. За последние 50 лет суточная мощность радиоизлучений суммарно возросла более чем в 50 тысяч раз, таким образом, все мы прямо или косвенно находимся под воздействием электромагнитного излучения. Это особенно актуально, так как в повседневной жизни и работе современного человека компьютер занимает важное место. Особенностью работы на персональном компьютере является то, что пользователь находится в непосредственной близости от монитора, что увеличивает интенсивность воздействия на него упомянутых излучений.

Кроме того, данные по микрокристаллизации ротовой жидкости можно использовать в качестве метода оценки общего состоянии организма человека и, в частности, для определения состояния организма до и после физической нагрузки. Диагностика «синдрома перетренированности» остается оной из проблем спортивной медицины. Систематическое наблюдение за текущим состоянием здоровья спортсменов, осуществляемое с помощью стандартных спортивно-медицинских тестов, на сегодняшний день является наиболее чувствительным методом выявления состояния перетренированности. При использовании в целях диагностики именно слюны свойства самого исследуемого материала способствуют улучшению результатов. Сбор образцов может быть произведен как в процессе тренировок, так и в периоды отдыха, без участия специального медицинского персонала. Появляется возможность заменить еженедельные или ежемесячные профили на суточные.

Таким образом, целью данной работы являлось изучение кристаллизации слюны и перспективы ее использования для диагностики влияния компьютерного излучения и повышенной физической нагрузки на организм человека.

Экспериментальная часть

Изучение влияния компьютерного излучения проводилось совместно с кафедрой терапевтической стоматологии ОмГМА [16]. Материалом исследования служила слюна кариесрезистентных лиц в возрасте 18-21 г. Сбор слюны производят в химически чистые пробирки в количестве 1-2 мл. Слюна из пробирки наносится на химически чистое стекло (3 капли), стекло помещается в термостат (температура 37 оС) на 30-40 минут. Затем образцы исследуют в стереоскопическом микроскопе МБИ-1 с увеличением 2Ч6, проводят микрофотографирование на цифровой фотоаппарат. Для определения типа микрокристаллизации слюны использовались методики Леуса П.А. [17], Пузиковой О.Ю. [18].

В эксперименте слюну делили на 5 порций. Первая порция служила для фоновых показателей слюны. Вторую порцию оставляли при комнатной температуре, чтобы исключить влияние времени и температуры на состав слюны. Третью, четвертую и пятую порции слюны помещали в закрытых пробирках в разных местах компьютера на 7 часов (табл. 1). Затем образцы высушивали и определяли тип микрокристаллизации слюны (МКС).

Таблица. 1. Характеристики компьютеров и место расположения образцов

лабораторный электромагнитный биологический

Микрофотографии кристаллограмм сохранялись в виде графических файлов. Для обработки графических изображений (поворот изображений по плоскости, изменение яркости, контрастности, нанесение размеров) использовали программы Adobe Photoshop 6.0 и PhotoDraw 2000. Полученные биометрические результаты заносили в электронную таблицу Excel 2000 из пакета Microsoft Office 2000. Данные анализировали с использованием статистического пакета STATGRAPHICS Plus 5.0.

Параллельно провели определение электролитного состава ротовой жидкости исследуемых групп пациентов. Параметры рН, рК, рNa слюны определяли методом прямой потенциометрии с помощью ионоселективных электродов на иономере ЭВ-74. В качестве электрода сравнения использовали хлорсеребряный электрод. Белок определяли фотометрически по методу Бенедикта [19]. Неорганический фосфор в слюне определяли по методу Больца и Льюк в модификации Конвая В.Д., Леонтьева В.К. [20], общую концентрацию кальция - методом комплексонометрического титрования. Математическая обработка данных проводилась с помощью статистического пакета STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc. USA).

При оценке состояния организма при физической нагрузке материалом исследования служила слюна лиц, занимающихся профессиональным спортом в возрасте 18-23 г. Исследованы образцы ротовой жидкости 32 спортсменов-бадминтонистов, разделённых на две группы: непрофессионалы - группа «А», профессионалы - группа «В». Для получения сопоставимых результатов слюну собирали натощак, в стерильную пробирку с плотно закрывающейся пробкой, предварительно ротовую полость ополаскивали дистиллированной водой. Пробы ротовой жидкости группы «А» отбирались до и после тренировки (эксперимент повторяли 2 раза с периодичностью в 1 неделю), один раз - сразу после сна (вне нагрузки); образцы ротовой жидкости группы «В» были получены дважды в течение одного дня: до и после тренировки. Спортсмены всех исследуемых групп получали одинаковую физическую нагрузку: интервальная тренировка, смешанная аэробная и анаэробная нагрузка; продолжительность тренировки 90 минут. В исследуемых образцах определяли содержание фосфора, кальция, белка, pH среды и устанавливали тип микрокристаллизации ротовой жидкости по методикам, описанным выше.

Результаты и их исследование

1. Влияние компьютерного излучения

В порциях слюны, размещенных в разных местах компьютера, происходит достоверное, по сравнению с исходной порцией слюны, разрушение кристаллических структур. В порциях слюны, оставленной при комнатной температуре на 7 часов, достоверных различий с исход-ной порцией не наблюдается. Таким образом, достоверно доказано, что компьютерное излу-чение при воздействии даже в течение 7 часов очень сильно изменяет картину микро-кристаллизации слюны и, следовательно, эту биологическую жидкость можно использовать для диагностических целей.

В ходе дальнейшего исследования были выделены две группы людей: группа 1 - люди, чья профессиональная деятельность была связана с работой на персональном компьютере. Стаж работы по специальности составлял от пяти до десяти лет, средняя продолжительность времени, проводимого у экрана монитора - восемь часов в сутки и более, при этом люди регулярно обращаются к стоматологу с диагнозом множественный кариес зубов - 80 человек (63.0%). Взятую в качестве сравнения группу лиц, резистентных к заболеваниям, составили люди с одинаковым соматическим статусом «практически здоровые», а также без заболеваний пародонта и слизистой оболочки полости рта - 47 человек (27.0%).

Рис. 1. Типы МКС (а - 5, б - 4, в - 3, г - 2, д - 1, е - 0 баллов соответственно)

лабораторный электромагнитный биологический

Для результатов микрокристаллизации ротовой жидкости кариесрезистентных лиц характерен чёткий рисунок крупных удлинённых кристаллопризматических структур, идущих от центра капли, сросшихся между собой и имеющих древовидную или папоротни-кообразную форму (картина соответствует 5 баллам). При оценке результатов микрокристаллизации ротовой жидкости лиц, работающих с электромагнитным излучением, отмечается разрушение чёткой структуры кристаллов (рис. 1). Выявляются следующие типы: рисунок крупных удлинённых кристаллопризматических структур, сросшихся между собой в произвольном порядке (4 балла); в центре капли видны отдельные кристаллы звёздчатой формы, по периферии сохранены укрупнённые древовидные кристаллы (3 балла); отдельные кристаллы в виде прута или веточки, расположенные по всему полю (2 балла); по всей площади капли большое количество изометрически расположенных кристаллических структур, звёздчатой, округлой и неправильной формы (1 балл); полное отсутствие кристаллов в поле зрения (0 баллов).

В исследуемой нами группе людей, работающих за компьютером, наблюдались типы МКС 0-4 (табл. 2), причем преобладают 0-2 типы, что свидетельствует о нарушении структурных и минерализующих свойств слюны и снижении уровня резистентности зубов к кариесу.

Таблица. 2. Результаты определения типа МКС

Существенным тормозом в широком распространении методики является высокая вариабельность получаемой картины кристаллических агрегатов. По данным литературы, общий способ роста кристаллов в биологическом объекте - это начальное образование структурного каркаса (органического матрикса), в котором кристалл впоследствии выращивают. Роль этого органического каркаса могут выполнять молекулы муцина, в большом количестве содержащегося в слюне. Существуют две главные причины вариабельности в формообразовании кристаллических агрегатов [14]. Первая - условия роста кристаллов. При кристаллизации слюны на открытой поверхности в высушенной капсуле образуются три зоны: центральная, промежуточная и периферическая. В центре капли располагаются наиболее крупные дендритные кристаллы в виде папоротника. По-видимому, эти кристаллы имеют максимальную возможность свободно расти и поэтому участок со структурами «папоротника» можно считать зоной свободного роста. Древовидная форма кристаллов слюны, очевидно, объясняется наличием в их структуре гликопротеида муцина, имеющего разветвленную структуру. Вторая причина вариабельности формообразования кристаллических агрегатов связана с гетерогенностью муцина. Установлено, что даже у практически здоровых людей кристаллизация ротовой жидкости не является строго одинаковой. Этот факт не является новым, но именно это не позволяет до настоящего времени создать «эталон (стандарт) нормы» для последующих исследований. Поэтому для систематизации полученных изображений были использованы экспертные признаки кристаллограмм слюны (длина, ширина кристаллов, углы ветвления, параметры асимметрии и т.д.) [14].

Рис. 2. Диаграмма рассеяния канонических значений

При оценке фигур кристаллизации с помощью методов математической статистики также наблюдаются достоверные различия между группами, что подтверждено данными дискриминантного анализа (рис. 2).

Сравнение количественных характеристик состава слюны контрольной группы с группой людей, работающих за компьютером, статистически значимых различий не показало (табл. 3). Содержания исследуемых компонентов от нормы практически не отличаются, однако, у всех пациентов наблюдаются различные заболевания полости рта. Вероятно, это связано именно с работой за компьютером и вредным воздействием излучения.

Таблица. 3. Электролитный состав ротовой жидкости (р = 0.95)

лабораторный электромагнитный биологический

Объяснение связи между электромагнитными полями и болезнями основано на том, что все биохимические процессы в клетках, так или иначе, зависят от электрохимических свойств участвующих в них молекул и ионов. Тем не менее, более точные механизмы этой связи не выяснены. Поражение твердых тканей зубов связывают как с непосредственных воздействием излучения, так и с нарушением минерального и белкового обмена в организме, с изменением состава слюны и функционального состояния физиологических систем. Так, даже слабое действие излучения на ткани организма приводит к ионизации отдельных молекул и атомов, образуя новые, в том числе такие реакционноспособные, как свободные радикалы, перекисные соединения и другие. Последние, реагируя между собой и с другими молекулами тканей, вызывают нарушение функций клеток, биохимических процессов в них, вплоть до гибели отдельных клеток.

Оценка уровня физической нагрузки

Анализ 48 образцов ротовой жидкости спортсменов показал, что не одна из проб не соответствует максимальному количеству баллов (5), то есть не является идеальной. Установлено, что только 2 пробы были оценены на 4 балла; 28 проб - на 3 балла; 29 проб - на 2 балла; 12 проб - на 1 балл и 5 проб - на 0 баллов (рис. 3). Таким образом, для изученных образцов ротовой жидкости можно отметить, что наиболее часто встречаются пробы, соответствующие 2-3 баллам, что характеризует уже существующее нарушение структурных свойств слюны.

Рис. 3. Диаграмма распределения результатов микрокристаллизации всех проб

Исследуя влияние физической нагрузки (тренировки) на тип МКС (рис. 4), обнаружили, что после тренировки кристаллизация ротовой жидкости в целом ухудшается. Полученные результаты можно объяснить тем, что физическое напряжение увеличивает скорость обменных процессов в организме, и это приводит к нарушению электролитного состава слюны и, прежде всего, к изменению кальций-фосфорного коэффициента. В таком случае спортсменам можно рекомендовать восполнять запасы кальция и/или фосфора непосредственно после тренировки. Результаты картины МКС после более чем суточного отсутствия физических нагрузок показали, что за это время происходит восстановление структурных свойств ротовой жидкости, что может указывать на равновесие, наступившее в организме.

Рис. 4. Диаграмма распределения результатов МКС проб группы «А» до и после тренировки

Анализ результатов группы «В» показал практически противоположную закономерность (рис. 5). В большинстве случаев тип МКС после нагрузки в целом незначительно улучшился, хотя для отдельных проб ротовой жидкости - не изменился. Отсутствие изменений картины МКС или её улучшение за время тренировки свидетельствует о приспособленности организма спортсменов группы В к физическим нагрузкам.

Рис. 5. Диаграмма распределения результатов МКС микрокристаллизации проб группы «В» до и после тренировки

Различия между показателями одной и другой тренировки могут объясняться, например, различием в интенсивности нагрузок. Можно сказать, что этот метод пригоден для диагностики не только адаптированности спортсмена к физическим нагрузкам, но и его добросовестности по отношению к тренировке.

Однако при сравнении результатов МКС двух групп спортсменов необходимо отметить, что в целом картина МКС группы у «В» до тренировки хуже, чем у группы «А».

Это может свидетельствовать о том, что продолжительные физические нагрузки оказывают отрицательное воздействие на здоровье человека. В целом картины МКС и их изменение в группе «В» практически идентичны, что, вероятно, можно объяснить схожим образом жизни и режимом питания спортсменов.

Таким образом, проведённые исследования показали, что использование метода микро-кристаллизации позволяет оценить общее состояние и определить влияние различных факторов на гомеостаз в организме человека.

Для подтверждения предположения о влиянии физической нагрузки на состав и структурные свойства ротовой жидкости было проведено исследование ее химического состава (табл. 4) до и после физической нагрузки соответственно. Показано, что происходят существенные изменения состава слюны, в частности уменьшается концентрация неорганического фосфора и ионов кальция, одновременно увеличивается содержание белка и повышается рН ротовой жидкости.

Таблица. 4. Параметры слюны спортсменов до и после физической нагрузки

При этом происходит уменьшение соотношения Ca/P, которое характеризует равновесие процессов минерализации и деминерализации в ротовой полости человека, что свидетельствует о нарушениях физиологического равновесия, вызванных высокой физической нагрузкой на организм. Следует отметить, что изменения, происходящие в ротовой жидкости спортсменов-профессионалов, менее выражены, чем в группе спортсменов-любителей, что, по-видимому, можно объяснить адаптацией организма к физическим нагрузкам. Выявленные различия (рис. 6) подтверждены результатами многомерной статистики (дискриминантный и кластерный анализы).

Рис. 6. Диаграмма рассеяния канонических значений для исследуемых групп

Заключение

В ходе работы рассмотрены перспективы использования для диагностических целей данных по кристаллизации биологических жидкостей, а именно слюны человека. Отмечено, что электромагнитное излучение способствует нарушению структурных и минерализующих свойств слюны, что может привести к «компьютерному некрозу зубов». Предложен метод оценки типа микрокристаллизации слюны для определения уровня воздействия электромагнитного излучения на человека [21]. Несмотря на негативное влияние перечисленных факторов, их невозможно полностью исключить из жизни современного человека. В настоящее время разработаны методы восстановления пораженных участков зубов, в каждом конкретном случае лечение назначается стоматологом индивидуально.

Показана возможность использования лабораторной диагностики уровня физической нагрузки на организм человека с целью выявления уровня адаптированности и резервных возможностей организма, что применимо для массовых исследований.

Полученные данные могут быть использованы для выявления механизмов гомеостаза в полости рта человека и прогнозирования патологии, которая может возникать при его нарушении, а также для планирования профилактических и лечебных мероприятий.

Литература

лабораторный электромагнитный биологический

1.Боровский Е.В., Леонтьев В.К. Биология полости рта. М.: Медицина. 1991. 271с.

2.Забросаева Л.И., Козлов Н.Б. Биохимия слюны. Омск. 1992. 44с.

3.Вавилова Т.П. Избранные лекции по стоматологической биохимии. М. 1994. 28с.

4.Денисов А.Б. Типовые формы патологии слюнных желез. М. 1993. 122с.

5.Авцин А.П., Жаворонков А.А., Риш М.А. Микроэлементозы человека. М.: Медицина. 1991. 496с.

6.Келлер А.А., Щепин О.П., Чаклин А.В. Руководство по медицинской географии. СПб.: Гиппократ. 1993. 352с.

7.Яншина Ф.Т. Глобальные проблемы биосферы. М.: Наука. 2001. 198с.

8.Дмитриев А.П., Полянский В.В., Баев М.В. Микроэлементозы: классификация и основные характеристики. Пенза. 2004. 26с.

9.Шатохина С.Н. Диагностическое значение кристаллических структур биологических жидкостей в клинике внутренних болезней: автореф. дис. … д-ра мед. наук. М. 1995. 40с.

Размещено на Allbest.ru