Определение флавоноидов в видах Scabiosa l. из Забайкалья

Полная исследовательская публикация __________________________ Ендонова Г.Б. и Анцупова Т.П.

Размещено на http://www.allbest.ru/

52 ______________ http://butlerov.com/ ______________ ©--Butlerov Communications. 2009. Vol.18. No.7. P.51-59.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Определение флавоноидов в видах Scabiosa l. из Забайкалья

Скабиоза венечная (Scabiosa comosa) и скабиоза бледно-желтая (Scabiosa ochroleuca L) широко известные в народной и традиционной тибетской медицине растения.

скабиоза флавоноид лютеолин scabiosa

Scabiosa ochroleuca L. Scabiosa comosa

Скабиоза венечная применяется в тибетской медицине под названием «уд-бал-он-бо». Надземная часть скабиозы венечной в тибетской медицине используется как рвотное, жаропонижающее [1], при болезнях мочевого пузыря [2], в составе сложных рецептов - при болезнях сердца, сепсисе [3], при болезнях желудка, гастроэнтеритах, гастроэнтероколитах, пневмонии; наружно - при ангине [1].

В монгольской медицине скабиоза применяется при болезнях почек, мочевого пузыря и мочевыводящих путей, как диуретическое и потогонное [4].

В народной медицине отвар из надземной части применяют при диарее, туберкулезе легких, респираторных инфекциях, болезнях горла, ревматизме и лихорадке [5], как жаропо-нижающее, как спазмолитическое [6]; наружно - при геморрое, выпадении прямой кишки, чесотке, нарывах, для выведения бородавок [5]. Полифенольный комплекс в эксперименте проявляет антиоксидантные и лечебные свойства при гепатите.

Настой надземной части скабиозы бледно-желтой использовался при болезнях желудка и женских заболеваниях, остеоалгии, лихорадке [7], туберкулезе легких, сифилисе; наружно - при глазных болезнях, для выведения бородавок, как ранозаживляющее, при чесотке, кожных сыпях, геморроидальных шишках, мозолях и укусах змей [8]. Тритерпеноиды в эксперименте вызывают лизис злокачественных опухолей [9].

7-глюкозид лютеолина, выделенный из цветков Scabiosa ochroleuca, в эксперименте обладает противовоспалительными свойствами [10]. Водно-спиртовая настойка из семян проявляет антиамебную активность.

Таким образом, оба вида скабиозы обладают широким спектром терапевтического действия, обусловленного присутствием различных биологически активных веществ, в связи с чем представляют несомненный интерес для более углубленного исследования.

Для качественного анализа флавоноидов и фенолкарбоновых кислот и для доказательства химической природы флавоноидов нами проведено хроматографирование спиртовых извлечений из надземной части скабиозы венечной до и после гидролиза. Кислотный гидролиз проводили с целью установления природы флавоноидных гликозидов (5% серная кислота, 5 часов на кипящей водяной бане). Флавоноиды анализировали методом двухмерной хроматографии восходящим способом в системах растворителей: 15% уксусная кислота (I направление) и н-бутиловый спирт - уксусная кислота - вода (БУВ) (4:1:2) (II направление). В работе использовали хроматографическую бумагу марки FN-12 «быстрая». Соотношение растворителей брали в объемных частях. Все величины R_f обнаруженных соединений являются средними из четырех измерений. Идентификация флавоновых агликонов скабиозы венечной проводилась в сравнении с аутентичными образцами.

Высушенные хроматограммы этанольных экстрактов из надземной части скабиозы венечной до и после гидролиза просматривали в УФ-свете и отметили зоны с коричневым окрашиванием. Коричневому свечению соответствуют предположительно флавоны (лютеолин, апегинин, диосметин). Затем хроматограммы обрабатывали 5%-м спиртовым раствором алюминия хлорида и отмечали зоны с желтой флюоресценцией в УФ-свете. На основании характерного свечения в УФ-свете и величин R_f заключили, что флавоноиды скабиозы венечной относятся к флавонам: апигенин, лютеолин, диосметин (рис. 1-2) Наиболее интенсивное свечение в УФ-свете и большая плошадь пятна принадлежит лютеолину (выделено пунктиром). На основании этого сделали вывод, что основным флавоном скабиозы венечной является лютеолин. Следует отметить, что флавоны в исследованном растении находятся в гликозидированной форме [11].

Рис. 1. Строение флавонов

На рис. 2 представлена хроматограмма этанольных экстрактов из надземной части ска-биозы венечной.

Исходя из результатов качественного анализа биологически активных веществ, устано-вили, что скабиоза венечная характеризуется бульшим содержанием флавоноидов по сравне-нию с другими биологически активными веществами. Поэтому мы определили их количест-венное содержание. Для этого растительное сырье собирали в фазу цветения из разных местообитаний.

Колебания в содержании флавоноидов за 2001-2002 г приведены в табл. 1.

Для определения количественного содержания флавоноидов не существует единой методики, так как расчет содержания суммы флавоноидов проводится относительно какого-то определенного их (флавоноидов) представителя, наиболее характерного для конкретного растения.

Рис. 2. Схема двухмерной хроматограммы этанольных экстрактов из надземной части Scabiosa comosa до гидролиза

Табл. 1. Среднее содержание флавоноидов в скабиозе,% от массы абсолютно сухого сырья

Проведенное хроматографическое исследование флавоноидного состава скабиозы позволило установить, что основным представителем класса флавоноидов является флавонлютеолин. Поэтому нами разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в надземной части скабиозы в пересчете на лютеолин.

Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в надземной части скабиозы.

Для определения количественного содержания суммы флавоноидов в надземной части скабиозы нами разработана соответствующая методика. Для этого сначала провели изучение УФ-спектров извлечения из надземной части скабиозы (рис. 3). Для получения извлечения экстракцию проводили 96%-м этанолом на кипящей водяной бане в течение 70 минут. На основании спектров обнаружили, что максимум поглощения извлечения в 96% этаноле составляет 370 нм. При проведении опытов с комплексообразующими добавками, в частности, с 2% спиртовым раствором AlCl₃ установили, что максимумы поглощения дифференциального спектра (раствор сравнения - водно-спиртовое извлечение травы скабиозы венечной) составляет 405 нм. В связи с этим в качестве аналитической выбрана длина волны - 400 нм. В качестве стандартного образца, по которому проводилось определение, был взят лютеолин-стандарт (рис. 4). Максимум поглощения комплексов лютеолин-стандарта и суммы флавоноидов с алюминия хлоридом лежит в одной области при длине волны 400 нм (рис. 5). Эта область спектра достаточно удалена от максимумов поглощения сопутствующих фенольных и других соединений, содержащихся в экстрактах сырья.

Рис. 3. Спектры извлечения надземной части скабиозы венечной

Рис. 4. Спектры поглощения СО лютеолина

Рис. 5. Спектры поглощения ГСО лютеолина и извлечения из надземной части скабиозы

Результаты опытов с использованием различных концентраций экстрагентов приведены в табл. 2. Данные таблицы показывают, что оптимальным экстрагентом является 70% спирт этиловый.

Табл. 2. Выход суммы флавоноидов в зависимости от концентрации экстрагента

Существенное влияние на скорость процесса экстракции оказывает температурный режим экстрагирования. В этой связи изучено влияние температуры на выход суммы флавоноидов при соотношении 1:50, экстрагент -70% этиловый спирт. Результаты анализа приведены в табл. 3.

Табл. 3. Выход суммы флавоноидов в зависимости от температуры экстракции

Как видно из табл. 3, при однократном заливе сырья максимальный выход достигается при кипении водяной бани.

Далее было изучено влияние степени измельчения сырья на выход суммы флавоноидов. Сырье измельчали и просеивали через сита с отверстиями диаметром 1, 2, 3 мм. Результаты представлены в табл. 4.

Табл. 4. Выход суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин в зависимости от степени измельчения сырья

Из данных табл. 4 следует, что оптимальной степенью измельчения растительного сырья является 1 мм.

При выборе времени экстракции полученные данные приведены в табл. 5.

Табл. 5. Выход суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин в зависимости от времени экстракции

Результаты таблицы свидетельствуют, что наилучшим временем экстрагирования является 60 минут, дальнейшее увеличение времени нецелесообразно ввиду незначительного выхода флавоноидов.

Немаловажным параметром при разработке методики является зависимость соотношения сырья и экстрагента, поэтому нами проанализирован выход суммы флавоноидов при различных соотношениях, а именно, 1: 30; 1: 50; 1: 100 (табл. 6).

На основании полученных данных можно заключить, что оптимальным соотношением между сырьем и экстрагентом является соотношение 1: 50.

Для определения оптимального времени комплексообразования суммы флавоноидов скабиозы с алюминием хлористым определяли оптическую плотность полученного комплекса на фоне чистого извлечения через равные промежутки времени. Полученные результаты представлены в табл. 7.

Табл. 6. Выход суммы флавоноидов в зависимости от соотношения сырье-экстрагент

Табл. 7. Зависимость величины оптической плотности от времени реакции комплексообразования суммы флавоноидов скабиозы венечной с алюминием хлорида

Данные таблицы свидетельствуют о том, что через 40 минут величина оптической плотности исследуемого комплекса достигает максимального значения и остается постоянной в течение 90 минут.

Для определения зависимости величины поглощения от концентрации раствора определяли область подчинения раствора закону Бугера-Ламберта-Бера. Для этого были приготовлены 10 разведений первоначального раствора. Для каждого раствора измеряли величину оптической плотности при длине волны 400 нм. Полученные данные приведены на рис. 6.

Рис. 6. Зависимость величины поглощения растворов от концентрации

Табл. 8. Выход суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин в зависимости от контакта фаз

Из рисунка видно, что в диапазоне оптических плотностей 0.1-0.6 наблюдается линейная зависимость между концентрацией растворов и величиной поглощения.

Последним этапом было определение выхода суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин в зависимости от контакта. Полученные данные приведены в табл. 8.

В течение 1-го контакта фаз экстрагируется около 83% суммы флавоноидов. Второй контакт обеспечивает выход около 12%, третий - около 1.7%, то есть, для полноты истощения достаточно трехкратной экстракции.

Таким образом, результаты наших исследований показывают, что оптимальными пара-метрами получения извлечений из надземной части скабиозы венечной являются: экстрагент - 70% этиловый спирт, степень измельчения сырья - 1.0 мм, температура экстракции - на кипящей водяной бане, соотношение сырье-экстрагент - 1: 50, кратность экстракции - 2, продолжительность I и II экстракции - 60 минут.

Выбор оптимальных параметров. Условия экстрагирования отрабатывались на сырье - надземной части скабиозы венечной, собранной в экспедиционный период в 2001 г. в фазу массового цветения.

При разработке методики было исследовано влияние различных технологических факторов на выход флавоноидов. Прежде всего, это - концентрация экстракта, степень измельчения сырья, время экстракции, температурный режим, соотношение сырья и экстрагента, а также были изучены условия комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом.

Для определения оптимальных условий экстракции флавоноидные извлечения готовили нижеследующим способом, варьируя исследуемый параметр экстракции.

В колбу помещали 1 г (точная навеска) сырья, измельченного до размера частиц 1 мм, добавляли 50 мл экстрагента и выдерживали в течение 1 часа при температуре кипения на водяной бане.

Все значения получены из 3 параллельных определений.

Описание методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин в надземной части скабиозы венечной.

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц 1 мм.

Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 50мл 70% этилового спирта. Колбу присоединяют к обратному холодильнику, нагревают до кипения на водяной бане и выдерживают в течение 60 минут, периодически встряхивая. Извлечение охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Аналогичным образом проводят вторую экстракцию. Извлечение фильтруют в ту же мерную колбу, объем доводят до метки 70% этиловым спиртом и перемешивают (раствор А). В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 3 мл раствора А и 2 мл раствора алюминия хлорида, доводят объем раствора 70% этиловым спиртом до метки (раствор Б). Через 40 минут измеряют оптическую плотность раствора Б в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 400 нм. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 3 мл раствора А, доведенного 70% этиловым спиртом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора комплекса государственного стандартного образца (ГСО) лютеолина с алюминия хлоридом.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин в абсолютно сухом сырье в% Х вычисляют по формуле:

D · m₀ · 4 · 100 · 100

Х = -------------------------------,

D₀ · m · 3 · (100 - w)

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

D₀ - оптическая плотность ГСО лютеолина;

m - масса сырья в г;

m₀ - масса ГСО лютеолина в г;

w - потеря в массе при высушивании сырья, в%.

Приготовление раствора ГСО лютеолина. Около 0.05 г (точная навеска) лютеолина, предварительно высушенного при температуре 100-105 єС в течение 1 часа, растворяют в 96% спирте в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят объем раствора до метки и перемешивают.

Приготовление 2% раствора алюминия хлорида. 3.6 г алюминия хлорида (в пересчете на шесть молекул воды) помещают в колбу вместимостью 100 мл, растворяют в небольшом количестве 70% спирта этилового, доводят до метки и перемешивают.

Проверка воспроизводимости методики. Для проверки воспроизводимости методики проведено определение содержания суммы флавоноидов в 10 повторностях. Метрологические характеристики методики представлены в табл. 9.

Табл. 9. Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин в траве скабиозы венечной

Из данных таблицы следует, что относительная ошибка единичного определения суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин в траве скабиозы венечной - 2.99%. В связи с этим, по предлагаемой методике достаточно проводить анализ в 3 повторностях.

Разработана методика определения количественного состава суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин для Scabiosa. В результате определены параметры - концентрация экстракта, степень измельчения сырья, время экстракции, температурный режим, соотношение сырья и экстрагента, влияющие на выход флавоноидов. Содержание суммы флавоноидов варьирует в пределах: у Scabiosa comosa - от 0.04% в корнях до 1.04% в соцветиях, у Scabiosa ochroleuca L - от 0.09% в корнях до 1.76% в соцветиях.

Литература

скабиоза флавоноид лютеолин scabiosa

[1] Варлаков М.Н. Избранные труды. Под ред. А.Д. Туровой. М. 1963. 172с.

[2] «Дзэйцхар Мигчжан» памятник тибетской медицины. Отв. ред. Б.Б. Бадараев. Новосибирск. 1985. 88с.

[3] Гусева А.П. Применение в тибетской медицине забайкальских растений. Вопросы фармакогнозии. Л. 1961. Вып.1. С.363-366.

[4] Хайдав Ц. Лекарственные растения, применяемые в монгольской народной медицине. Тез.докл. 41-й итоговой науч. конф. Черновиц.мед.ин-та. 1965. С.41-45.

[5] Николаева Г.Г., Даргаева Т.Д. К фитохимическому исследованию скабиозы венечной. Экспериментальные исследования биологически активных веществ лекарственных препаратов растительного и минерального происхождения. Улан-Удэ. 1979. С.9-11.

[6] Муравьева Д.А. Фармакогнозия (с основами биохимии лекарственных веществ). М.: Медицина. 1991. 656с.

[7] Уткин Л.А. Народные лекарственные растения Сибири. Тр. н.-и. хим.-фармац. ин-та. 1931. Вып.24. С.1-133.

[8] Анненков Н.И. Ботанический словарь. 2-е изд. СПб. 1878. 645с.

[9] Mьller K. O saponinodбrnych roslinach. Ziva. 1955. T.3. No1.P.8-10

[10] Земцова Г.Н., Бандюкова В.А., Джумырко С.Ф. Флавоны и фенолокислоты Scabiosa olgae. Химия природ. соедин. 1972. No.5. С.625.

[11] Mabry T.J., Markham K.R., Thomas K.B. The Systematic identification Flavonoids. Berlin: Heidelberg; N-Y.: Springer-Verlag. 1970. 354p

Размещено на Allbest.ru