Определение ряда нестероидных противовоспалительных средств в крови в скрининге методами твердофазной экстракции и газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием

Размещено на http://www.allbest.ru/

Определение ряда нестероидных противовоспалительных средств в крови в скрининге методами твердофазной экстракции и газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием

Изучена возможность определения ряда нестероидных противовоспалительных средств в процедуре скрининга крови на наркотические и лекарственные вещества с применением методов твердофазной экстракции и газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Ибупрофен, диклофенак, кеторолак, индометацин, напроксен и кетопрофен могут быть идентифицированы в крови непосредственно в процедуре скрининга.

Арсенал нестероидных противовоспалительных средств (НПВС) насчитывает несколько десятков лекарственных средств и значительное количество созданных на их основе моно- и комбинированных препаратов. Несмотря на то, что такие препараты должны отпускаться из аптечных учреждений по назначению и рецепту врача [1], в аптечных учреждениях РФ их легко можно приобрести без рецепта. Таким образом, возрастает число случаев самолечения данными препаратами, бесконтрольного их применения, что может способствовать развитию неблагоприятных побочных реакций (НПР) и возрастанию числа случаев передозировок.

Широкая доступность препаратов для населения, большое количество торговых наименований, обилие рекламы в СМИ, бесконтрольное применение при самолечении создают предпосылки для употребления завышенных доз и приводит к возникновению острых отравлений противовоспалительными препаратами, вплоть до летальных исходов. Токсикологическое значение НПВС придает еще и тот факт, что они часто встречаются в биологических объектах наряду с наркотическими и другими психоактивными веществами.

Цель работы - изучение возможности выявления и идентификации ряда НПВС в процедуре скрининга крови на наркотические и лекарственные вещества с применением методов твердофазной экстракции и газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.

Экспериментальная часть

Оборудование. Газовый хроматограф Agilent 7820 с моноквадрупольным масс-спектральным детектором Agilent 5975 (Agilent, США), колонка капиллярная НР-5MS, внутренний диаметр 0.25 мм, длина 30 м, толщина пленки 0.25 мкм. Для твердофазной экстракции применяли систему с вакуумной камерой на 12 позиций Supelco, насос низкого вакуума AIR CADET (США). Термоблок ПЭ-4030, одноканальный испаритель ПЭ-2300, микровстряхиватель ПЭ-2 (ОАО «Экрос», Россия). Полуавтоматические пипетки-дозаторы, позволяющие отбирать объемы жидкостей 4-40, 40-200 мкл и 0.2-1, 1-5 мл.

Материалы. В исследовании применялись патроны для твердофазной экстракции SampliQ EVIDEX-200 мг/ 3 мл (Agilent, США). Рабочие спиртовые растворы ибупрофена, напроксена, кетопрофена, диклофенака, кеторолака, индометацина, гексенала готовили из лекарственных форм; буферный раствор - 1/15 М фосфатный буфер рН 4.8; азот (о.с.ч.), гелий (о.с.ч.); все используемые растворители и реактивы градации «х.ч.».

Подготовка проб. К образцам крови объемом 500 мкл прибавляли по 50 мкл раствора внутреннего стандарта (спиртовой раствор гексенала 200 мкг/мл), 20 или 200 мкл спиртового раствора смеси стандартов НПВС, содержащей: ибупрофен и напроксен в концентрации 0,2 мг/мл, кетопрофен, диклофенак, кеторолак и индометацин в концентрации 0.1 мг/мл и по 2 мл 1/15 М фосфатного буфера рН 4.8. Флаконы плотно укупоривали и помещали в ультразвуковую баню на 5 минут. Содержимое флаконов центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут, центрифугат отделяли от осадка. Далее проводили твёрдофазную экстракцию (ТФЭ) по схеме: кондиционирование сорбента осуществляли последовательным промыванием 2 мл 95% этанола и 2 мл 1/15 М фосфатного буфера рН 4.8. Загрузку анализируемого образца крови осуществляли со скоростью 1.0 мл/мин, после чего промывали сорбент последовательным пропусканием через него 1 мл 1/15 М фосфатного буфера рН 4.8 и 1 мл 10% этанола. Сушили патрон под вакуумом в течение 20 минут. Элюирование осуществляли дважды порциями по 2 мл. Элюат испаряли досуха в токе азота при 40 оС.

Дериватизация. К сухому остатку элюата прибавляли 500 мкл безводного ацетона, замывали стенки флакона и переносили раствор в виалу, содержащую 20-25 мг безводного карбоната калия. Добавляли в виалу 40 мкл йодистого метила, герметично закрывали и нагревали при 600 оС в течение 1 часа в термоблоке. Виалу охлаждали, отбирали жидкую фазу реакционной смеси, переносили в чистую виалу и испаряли в токе азота при комнатной температуре. Сухой остаток растворяли в 200 мкл безводного этилацетата и 1 мкл вводили в инжектор хроматомасс-спектрометра.

Режим работы газового хроматографа с моноквадрупольным масс-спектральным детек-тором. Скорость потока газа-носителя (гелий) через колонку 1.5 мл/мин, режим работы split/splitless (деление потока 15:1, с задержкой включения 1 мин после ввода пробы). Температура испарителя хроматографа и интерфейса детектора задавалась 250 и 280 оС.

Температура колонки начальная 70 оС в течение 2 мин и прогрев до 280 оС со скоростью программирования 20 град/мин, выдержка при конечной температуре 8 мин. Напряжение на умножителе масс-селективного детектора устанавливали равной величине автоматической настройки детектора. Регистрация масс-спектров для метильных производных НПВС - в режиме полного сканирования ионов в интервале масс 42-450 а.е.

Обработку хроматограмм с целью идентификации компонентов проб проводили с использованием программ ChemStation G1701DA и AMDIS (The Automatic Mass Spectral Deconvolution and Identification System, NIST). Количественное определение НПВС проводили для их метиловых эфиров по отношению площадей пиков соответствующих ионов и площади пика иона m/z 235 для N-метилгек-сенала (внутренний стандарт) в элюате. Времена удерживания и основные характеристические ионы, использованные для определения эффективности экстракции приведены в табл. 1.

Таблица. 1. Времена удерживания метилированных НПВС, внутреннего стандарта и их характеристические ионы

противовоспалительный кровь хроматография

Результаты расчетов логарифма распределения октанол-вода (LogP) и коэффициента адсорбции (Koc) получены с использованием пакета программ ACD/Labs v6.0 (Advanced Chemistry Development Inc., Toronto, Canada).

Результаты и их обсуждение

Для прогнозирования поведения 6 соединений ряда НПВС в процессе ТФЭ нами были проведены расчеты их физико-химических свойств, таких как: константа диссоциации (рКа), липофильность (logР), а также учитывая, что в процедуре скрининга применяется буферный

раствор с величиной рН = 4.8 [2], проведены расчеты значений logD и KOC для ибупрофена, диклофенака, кеторолака, индометацина, напроксена и кетопрофена при данных условиях. Результаты представлены в табл. 2.

Таблица. 2. Результаты расчетов значений рКа, log Р, logD и KOC для ряда НПВС (ACD\Labs LogD v. 6.12, рКа v. 6.11, LogP v. 6.18)

противовоспалительный кровь хроматография

Все соединения, исключая кеторолак, являются высоколипофильными. Кеторолак относится к низколипофильным веществам. Как видно из полученных результатов (значений величин коэффициента распределения с учетом концентраций ионизированных форм соединения LogD и коэффициента сорбции KOC), все исследуемые вещества будут адсорбироваться на сорбентах, имеющих обращенную фазу, что позволяет прогнозировать возможность их выделения в процессе скрининга лекарственных и наркотических веществ при использовании ТФЭ на патронах со смешанной фазой, в частности, «SampliQ EVIDEX».

Для количественного определения ряда НПВС в крови применялась скрининговая методика, включающая ТФЭ НПВС из цельной крови с использованием патронов для ТФЭ со смешанной фазой и последующим анализом методом газовой хроматографии с масс-спектро-метрическим детектированием [2].

В процедуре ТФЭ были использованы элюенты с различной степенью полярности. Тип элюента:

Ш гексан-этилацетат (3:1)

Ш гексан-этилацетат (2:1)

Ш гексан-этилацетат (1:1)

Ш этилацетат

Эффективность экстракции НПВС при использовании различных элюентов представлена в табл. 3.

Таблица 3. Эффективность экстракции НПВС при использовании элюентов 1-4

Как видно из табл. 3, при использовании в качестве элюента смеси гексан-этилацетат (3:1) наблюдается низкий выход напроксена и кеторолака и недостаточный - для кетопрофена и диклофенака (на низких концентрациях). Максимальный выход 6 соединений НПВС достигается при использовании в качестве элюента смеси гексан-этилацетат (2:1). Дальнейшее увеличение полярности элюента (гексан-этилацетат (1:1) и этилацетат) не приводит к значительному улучшению эффективности экстракции НПВС.

Самая низкая эффективность экстракции наблюдается у кеторолака, что ожидаемо, учитывая его низколипофильные свойства, и подтверждено экспериментальными данными [3].

Смесь гексан-этилацетат (2:1) можно рекомендовать в качестве элюента в скрининге крови на наркотические и лекарственные вещества для выделения и идентификации НПВС на патронах со смешанной фазой.

Выводы

противовоспалительный кровь хроматография

1.Показана возможность определения ряда нестероидных противовоспалительных средств в процедуре скрининга крови на наркотические и лекарственные вещества с применением методов твердофазной экстракции и газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.

2.Оптимальным элюентом для выделения ибупрофена, напроксена, кетопрофена, диклофенака, индометацина, кеторолака в процедуре твёрдофазной экстракции является гексан-этилацетат (2:1).

Литература

1.О порядке назначения и выписывания лекарственных средств, изделий медицинского назначения и специализированных продуктов лечебного питания [Электронный ресурс]: приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 12 февраля 2007 г. №110. Доступ из справ. правовой системы «Консультант Плюс».

2.Катаев С.С., Дворская О.Н. Применение твердофазной экстракции в исследовании крови на наркотические и лекарственные вещества. Судебно-медицинская экспертиза. 2012. Т.55. №4. С.38-42.

3.Петухова Н.Н., Катаев С.С. Предварительное исследование эффективности экстракции кеторолака из водных растворов методами ЖЖЭ и ТФЭ. Морфология критических и терминальных состояний. Материалы научно-практической конференции с международным участием, посвященной 85-летию со дня рождения Заслуженного деятеля науки РФ, профессора В.И. Алисиевича. М. 2011. С.143-149.

Размещено на Allbest.ru