Синтез и биологическая активность некоторых 3-гидрокси-1,5-диарил-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пирролонов

Полная исследовательская публикация Зыкова С.С., Любосеев В.Н., Одегова Т.Ф. и Галембикова А.Р.

Размещено на http://www.allbest.ru/

154 _____ http://butlerov.com/ _____ ©--Butlerov Communications. 2014. Vol.38. No.6. P.153-158. (English Preprint)

Тематический раздел: Исследование биологической активности. Полная исследовательская публикация

Подраздел: Биохимия. Регистрационный код публикации: 14-38-6-153

г. Казань. Республика Татарстан. Россия. __________ ©--Бутлеровские сообщения. 2014. Т.38. №6. ________ 153

УДК 615.012.01.

Кафедра зоотехнии. ФКОУ ВПО Пермский институт ФСИН России

Cинтез и биологическая активность некоторых 3-гидрокси-1,5-диарил-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пирролонов

Зыкова Светлана Сергеевна

Источником большого числа биологически активных гетероциклов являются 1,2,4-три-карбонильные соединения, выступающие в качестве синтонов в реакциях с моно- и бинуклео-фильными агентами.

В основе практически любого патологического процесса находится воспаление [1]. Про-тивовоспалительные средства являются средствами выбора при многочисленных заболева-ниях различной этиологии.

В связи с этим потребность в низкотоксичных и эффективных противовоспалительных средствах является актуальной.

Множество различных гетероциклических соединений обладает различными видами биологической активности, противомикробной, анальгетической, противовоспалительной [2, 3].

Важную роль в процессе развития воспаления играет антиоксидантная система организ-ма. В ряде случаев дефекты антиоксидантной защиты могут привести к значительной интен-сификации воспалительных реакций [4].

Экспериментальная часть

В качестве субстрата использовали пивалоилпировиноградную кислоту, которая является прак-тически нетоксичным соединением и представляет собой смесь таутомерных изомеров, состоящих из линейных оксотаутомерных (Ix и Iy) и минорной кольчатой форм (Iz) (cхема).

Схема. Синтез 3-гидрокси-1,5-диарил-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пирролонов (IIa-l)

В среде этанола с различными основаниями Шиффа были получены с удовлетворительными выходами 3-гидрокси-1,5-диарилзамещенные-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пирролоны (IIa-l) (схема).

Синтез 3-гидрокси-1,5-диарил-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пирролонов (IIa-l). К раствору 0.68 г (4 ммоль) пивалоилпировиноградной кислоты в 20 мл этанола добавляют при перемешивании раствор 4 ммоль соответствующего арилиденариламина (основания Шиффа) в 10 мл этанола и нагревают смесь 15 минут. Растворитель испаряют, остаток перекристаллизовывают из бензола, толуола или ацетонитрила [5].

3-Гидрокси-1,5-бис-п-толил-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пирролон (IIc). ИК спектр, нmax, cм -1: 3118 (С3ОН), 1683 (С2=О),1632 (t-Bu-C=O), 1607, 1584, 1507, 1455, 1440, 1372, 1326, 1303, 1292, 1270, 1241, 1222, 1198, 1185, 1174, 1155, 1132, 1038, 1005, 916, 863, 826. Спектр ЯMP 13C, ДМСО -d6, д, м.д.: 20.0 (4-СН3С6Н4), 24.8 [(СН3)3С], 37.5-42.5 (ДМСО, (СН3)3С), 55.3 (4-СН3ОС6Н4), 61.5 (С5), 113.2; 120.3; 122.7; 128.4; 129.0; 133.5; 134.4; 158.2 (атомы С в Ar и С4); 146.8 (С3ОН); 164.5 (С2=О); 200.3 [(CH3)3C-CO]. Масс-спектр, m/z (Iотн., %), приведены пики с Iотн. >5%: 380 (6) [M+1]+, 379 (17) [M]+, 323 (17), 322 (54) [M-(CH3)3C]+, 321 (27) [M-(CH3)3C-H]+, 320 (57), 296 (5), 295 (22), 294 (41) [M-(CH3)3C-CO]+, 266 (10) [M-(CH3)3C-2CO]+, 264 (6), 244 (100), 133 (6), [4-CH3C6H4-C? N-C6H4CH3-4]+, 211 (23), 205 (30), 193 (7), 181 (18), 178 (9), 162 (6), 161 (38), 160 (5), 159 (15), 148 (7), 140 (6), 133 (8) [4-CH3C6H4-N=C=O]+, 132 (9), 131 (27), 118 (12), 92 (6), 91 (58) [4-CH3C6H4]+. Найдено, %: С 73.11; Н 6.42; N 3.86. Вычислено, %: С 72.80; Н 6.64; N 3.69.

3-Гидрокси-5-п-нитрофенил-4-пивалоил-1-п-толил-2,5-дигидро-2-пирролон (IId). Масс-спектр, m/z (Iотн., %), приведены пики с Iотн. >5%: 395 (5) [M+1]+, 394 (19) [M]+, 338 (8), 337 (38) [M-(CH3)3C]+, 310 (6), 309 (37) [M-(CH3)3C-CO]+, 263 (5), 176 (8), 134 (10), 133 (6), [4-CH3C6H4N=C=O]+, 132 (7), 130 (8), 118 (9), 104 (6), 102 (8), 101 (5), 92 (40), 91 (100) [4-CH3C6H4]+, 51 (15), 41 (69). Найдено, %: С 66.74; Н 5.81; N 6.93. Вычислено, %: С 66.99; Н 5.62; N 7.10.

Спектральные характеристики соединений IIa, IIb, IIe-l приведены в ранних публикациях [5].

Для исследования антиоксидантной активности была использована оценка влияния синтезиро-ванных 3-гидрокси-1,5-диарилзамещенных-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пирролонов на устойчивость кле-ток бактерий Escherichia coli штамм BW 25113 к бактериостатическому действию Н2О2 (3 мМ) [6].

Бактерии E.coli штамм BW 25113 выращивали аэробно на минимальной среде М-9 с добавле-нием глюкозы. После центрифугирования клетки из конечной культуры суспендировали в 100 мл свежей среды до показателя оптической плотности при длине волны 600 нм от 0.1-0.15 и далее выращивали при 37 оС в колбах объемом 250 мл с перемешиванием при частоте вращения 150 об/мин. За ростом бактерий следили по изменению величины оптической плотности, измеряемой на фотометре КФК -3 (толщина кюветы 5 мм). В середине логарифмической фазы роста клетки центрифугировали и затем ресуспендировали в 4 мл среды М-9. По 100 мкл клеточной суспензии (до конечной оптической плотности 0.1) вносили в пробирки, содержащие 5 мл среды и 50 мкл веществ, предварительно растворили в ДМСО и в концентрации 1х10-5 М инкубировали в пробирках при перемешивании 37 оС до достижения значения оптической плотности 0.2. Культура бактерий в присутствии синтезиро-ванных соединений находилась при перемешивании и температуре 37 оС не менее 30 минут. Затем клетки бактерий подвергали действию Н2О2 (3 мМ) и инкубировали ещё в течение 30 минут. Удель-ную скорость роста рассчитывали по уравнению:

м = ln (N/N0)/t;

где м - удельная скорость роста, ч-1, N и N0 - значения оптической плотности в начальный и t момент времени соответственно.

В качестве стандарта антиоксидантной активности использовали субстанцию ресвератрола, в концентрации соответствующей эквимолярной концентрации исследуемых замещенных 3-гидрокси-1,5-диарил-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пирролонов.

Исследования острой токсичности и противовоспалительной активности были прове-дены в ФГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия». Все исследо-вания проводились с разрешения локального этического комитета и соблюдением требований к работе с экспериментальными животными (Федеральный закон «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997г., Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации №267 от 19.06.2003, Директива Совета ЕЭС).

Изучение острой токсичности синтезированных 3-гидрокси-1,5-диарилзамещенных-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пирролонов показало, что соединения являются практически неток-сичными (LD50 >1000 мг/кг).

Противовоспалительную активность соединений исследовали на модели каррагининового воспаления [8, 9]. Эксперимент проводили на белых беспородных крысах массой 170-220 г, содержа-щихся в стандартных условиях вивария. Группа контроля, опытная и группа препарата сравнения состояли из восьми животных. Исследуемые соединения в дозе 50 мг/кг, предварительно суспенди-ровав 2% крахмальной слизи, вводили внутрибрюшинно за 1 час до эксперимента. Препарат сравнения - диклофенак натрия вводили в дозе 10 мг/кг (в виде суспензии в 2% крахмальной слизи) внутри-брюшинно за 1 час до эксперимента. Исследуемые соединения и диклофенак натрия были взяты в эквитоксических дозах. Выбор дозы препарата сравнения в пересчете на массу крысы соответствует суточной дозе для человека. Контрольной группе животных внутрибрюшинно вводили эквимолярный объем 2% крахмальной слизи. Воспалительный отек вызывали введением 0.1 мл 1% раствора кара-гинина в подушечку правой задней лапы экспериментального животного. Определяли степень выра-женности отека онкометрически между правой (с воспалением) и левой (интактной) лапами для каждого животного [8]. Расчеты проводили в программе Statistica 6.0 для Windows.

В Казанском государственном медицинском университете было исследована противоопухо-левая активность семи соединений, относящихся к классу замещенных 2-пирролонов IIc,f,g-l. Объектами исследования служили фибробласты человека линии BJ (контроль), опухолевые клетки линии НeLa S3 (аденокарцинома шейки матки), U2OS (остеосаркома), H1299 (немелкоклеточный рак легкого). Клетки культивировали в полной культуральной среде DMEM (или RPMI-1640), содержащей антибиотики (пенициллин и стрептомицин), а также L-глутамин (ПАНЭКО, Россия) и 10% эмбрио-нальной телячьей сыворотки (HyClone, США). Клетки культивировали в соответствующей культу-ральной среде в присутствии вышеуказанных соединений в течение 72 ч при 37 oС и 5% СО2.

Вели подсчет общего количества клеток, количества клеток в фазе митоза, а также количество жизнеспособных и погибших клеток, оцениваемых по включению трипанового синего. Количество клеток в фазе митоза определяли методом проточной цитометрии, используя моноклональные антитела (мАТ) к гистону 3 (Н3) (Cell Signaling, США) и йодистый пропидий (Sigma, США) [9].

Группа лекарственных препаратов, которые относятся к таксанам, которые в отличие от алкалоидов барвинка малого (Vinca minor), связываются со свободным тубулином и повышают скорость его полимеризации, стимулируя, тем самым, сборку и стабилизацию уже сформировавшихся микротрубочек, что препятствует в дальнейшем деполимеризации тубулина и распаду микротрубочек. Таким образом, таксаны нарушают функционирование клеток при митозе (М-фаза) и в интерфазе. Нарушения процессов митоза делают невозможным продолжение клеточного цикла, что приводит к последующей гибели клетки, например, вследствие запуска в ней процессов программированной клеточной гибели (апоптоза). Данный феномен получил название “катастрофы в митозе” [10]. Таков механизм действия используемого препарата сравнения таксол.

Следовательно, способность лекарственных противоопухолевых препаратов инициировать “ми-тотическую катастрофу” в опухолевых клетках является одним из механизмов, обуславливающих эффективность их применения [10, 11]. пирролон кислота антиоксидантный цитотоксический

В ходе проведения скрининга на предмет потенциальной противоопухолевой активности среди исследованных 4-пивалоил-2-пирролонов гибель клеток in vitro не вызывали.

Индивидуальность и чистота полученных соединений подтверждена с помощью метода тонко-слойной хроматографии в системе бензол-эфир-ацетон (10:9:1), детектирование проводили в камере, насыщенной парами йода.

Синтезированные соединения получены с удовлетворительными выходами и представляют собой большей частью кристаллические порошки желтого цвета, растворимые в диметилформамиде, диметилсульфоксиде, бензоле, толуоле, трудно растворимые в этаноле, нерастворимые в воде. ИК-спектры соединений записывали на спектрометрах UR-20 и Рhillips Analytical PU9716 IR в вазели-новом масле. Спектры ЯМР 13С записан на спектрометре JEОL EX90A FT-NMR (частота по углероду 22.3 МГц) в растворе ДМСО-d6. Масс-спектры записаны на спектрометре MS-30 фирмы Kratos в режи-ме прямого ввода образца в ионный источник (ЭУ), ток эмиссии 1000 мА, ионизирующее напряжение 70 эВ, температура испарителя 100-150 оС.

Результаты и их обсуждение

Физико-химические константы синтезированных 3-гидрокси-1,5-диарил-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пирролонов приведены в табл. 1.

Табл. 1. Физико-химические константы 3-гидрокси-1,5-диарил-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пирролонов

Механизмы действия противовоспали-тельных средств, вероятно, связаны с актива-цией белков острой фазы (С-реактивный бе-лок, транскобаламин, гаптоглобин, б-2-макро-глобулин, лактоферрин), обладающих выра-женным антиоксидантным действием [1, 4].

Исследования биологической активнос-ти ранее были начаты с проведения теста острой токсичности 3-гидрокси-1,5-диарил-замещенных-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пир-ролонов, который показал, что соединения являются практически нетоксичными (LD50 >1000 мг/кг) [5].

Для исследования антиоксидантной ак-тивности была использована оценка влияния синтезированных 3-гидрокси-1,5-диарилзамещен-ных-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пирролонов на устойчивость клеток бактерий Escherichia coli штамм BW 25113 к бактериостатическому действию Н2О2 (3 мМ) по методике, ранее эффектив-но использованной для доказательства антиоксидантной активности экстрактов растений [7].

C целью исследования антиоксидантной активности в качестве тест-системы были использованы бактерии Еscherichia сoli BW 25113.

В качестве стандарта антиоксидантной активности использовали субстанцию ресвера-трола, который соответствовал эквимолярной концентрации исследуемых замещенных 3-гид-рокси-1,5-диарилзамещенных-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пирролонов (2x10-4М).

Удельную скорость роста микроорганизмов в присутствии веществ и среды М-9, а так-же в присутствии раствора пероксида водорода в концентрации 3мМ можно проанализи-ровать на рис. 2 и 3.

Показатель удельной скорости роста бактерий в присутствии соединений IIa-d, IIf, IIg, IIj и IIk рассчитан по t-критерию Стьюдента при p<0.05 в сравнении с контролем и является статистически значимым.

Наиболее выраженной антиоксидантной активностью обладает соединение IIa-c, IIe-j и IIl, а прооксидантный эффект отмечается у соединений IId и IIg.

Исследования противовоспалительной активности показали, что наибольшим антиэкс-судативным действием обладают соединения IIc, IIg и IIj, активность соединения IIg тормозит образование воспалительного отека на 61.2%, что превышает препарат сравнения - диклофенак. Стоит отметить, что наличие в структуре синтезированных 4-пивалоил-2-пирролонов метиль-ного радикала усиливает антиоксидантную и противовоспалительную активность.

Рис. 2. Удельная скорость роста Е.сoli BW 25113 за 1 час

Противовоспалительную активность соединений исследовали на модели каррагини-нового воспаления. Эффективность исследуемых соединений оценивали по степени подавле-ния роста воспалительного отека в процентах к контролю (табл. 2).

Наиболее выраженная взаимосвязь между антиоксидантной и противовоспалительной активностью установлена у соединений IIc, IIg и IIj.

Рис. 3. Удельная скорость роста Е.сoli BW 25113 за 1 час (продолжение)

Табл. 2. Противовоспалительная активность 3-гидрокси-1,5-диарилзамещенных-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пирролонов

Исследования показали целесообразность дальнейшего поиска соединений с антиок-сидантными, противовоспалительными и противоопухолевыми свойствами среди замещен-ных 3-гидрокси-1,5-диарилзамещенных-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пирролонов.

Изученные семь соединений не обладают противоопухолевой активностью, но ранее были сведения о наличии у 4-пивалоилзамещенных противоопухолевой активности [6].

Выводы

1. Один из субстратов 1,2,4-трикарбонильных соединений - пивалоилпировиноградная кис-лота - в реакции с арилиденариламинами приводит к 3-гидрокси-1,5-диарил-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пирролонам.

2. Проведен анализ острой токсичности 3-гидрокси-1,5-диарилзамещенных-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пирролонов, который показал, что соединения являются практически нетоксич-ными (LD50 >1000 мг/кг).

3. Изучена антиоксидантная активность синтезированных 4-пивалоил-2-пирролонов на моде-ли окислительного стресса, создаваемого 3 мМ раствором пероксида водорода с использо-ванием в качестве тест-системы культуру бактерий Escherichia coli BW 25113. Наиболее выраженной антиоксидантной активностью обладают 3-гидрокси-1,5-бис-п-толил-4-пива-лоил-2,5-дигидро-2-пирролон и 3-гидрокси-1-п-нитрофенил-4-пивалоил-5-п-метокси-фе-нил-2,5-дигидро-2-пирролон.

4. Исследована противовоспалительная активность 2-пирролонов in vivo на модели карраги-нинового воспаления. Обнаружены четыре соединения, обладающих выраженной противо-воспалительной активностью: 3-гидрокси-1,5-бис-п-толил-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пир-ролон, активность соединения 3-гидрокси-1-п-нитрофенил-4-пивалоил-5-п-метоксифенил-2,5-дигидро-2-пирролон тормозит образование воспалительного отека на 61.2%, что превы-шает препарат сравнения - диклофенак.

5. Поиск биологически активных соединений, обладающих противовоспалительной и антиоксидантной активностью cреди замещенных 3-гидрокси-1,5-диарил-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пирролонов является весьма перспективным и актуальным.

Литература

[1] Активация липопероксидации как ведущий патогенетический фактор развития типовых патологических процессов и заболеваний различной этиологии. Коллектив авторов. М.: Изд. Академия естествознания. 2012. С.136.

[2] Пидэмский Е.Л., Махмудов Р.Р. Скрининг и изучение механизма действия флоголитиков, нейротропных и противомикробных средств. Перм.ун-т. Пермь. 2008. 116с.

[3] Гейн В.Л., Юшков В.В., Касимова Н.Н., Шуклина Н.С., Васильева М.Ю., Губанова М.В. Синтез, противовоспалительная и анальгетическая активность 1-(2-аминоэтил)-5-арил-4-ацил-3-гидрокси-3-пирролин-2-онов. Хим.-фарм. журн. 2005. Т.39. №9. С.484-487.

[4] Зенков Н.К., Ланкин В.З., Менщикова Е.Б. Окислительный стресс. Биохимический и патофизиологический аспекты. М.: Наука/Интерпериодика. 2001. 340с.

[5] Галеева М.Э., Лапин А.А., Чугунов Ю.В. Калайда М.Л. Антиоксидантная активность - перспективный интегральный показатель для определения индекса качества вод. Бутлеровские сообщения. 2012. Т.29. № 3. С.110-119.

[6] Козьминых В.О., Игидов Н.М., Зыкова С.С. Синтез и фармакологическая активность 3-гидрокси-1,5-диарил-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пирролоны. Хим.-фарм.журнал. 2002. С.23-26.

[7] Безматерных К.В., Ширшова Т.И., Бешлей И.В., Матистов Н.В., Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н., Володин В.В. Оценка антиоксидантной активности экстрактов Allium schoenoprasum L. и Rubus chamaemorus L., произрастающих в Республике Коми. Хим.-фарм.журнал. 2014. №2. С.36-40.

[8] Салямон Л.С. Руководство по фармакологии. Медгиз. 1961. С.81.

[9] Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. Под ред. Миронова А.Н. М.: Гриф и К. 2012. С.944.

[10] Vakifahmetoglu H., Olsson M., Zhivotovsky B. Death through a tragedy: mitotic catastrophe. Cell Death Differ. 2008. Vol.15. P.1153-1162.

[11] Diaz J.F., Andreu J.M. Assembly of purified GDP-tubulin into microtubules induced by taxol and taxotere: reversibility, ligand stoichiometry, and competition. Biochemistry. 1993. Vol.32. P.2747-55.

Аннотация

На основе реакции пивалоилпировиноградной кислоты и арилиденарилминов синтезированы разнообразные 3-гидрокси-1,5-диарил-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пирролоны. В связи с актуальностью поиска новых биологически активных соединений исследованы антиоксидантная, противовоспали-тельная и цитотоксическая активность полученных 2-пирролонов. Антиоксидантные свойства полу-ченных соединений изучали на модели окислительного стресса, создаваемого раствором 3мМ раствора пероксида водорода с использованием в качестве тест-системы бактерий Escherichia coli штамм BW 25113. В качестве эталона сравнения использовали ресвератрол. Противовоспалительная активность была изучена in vivo на модели каррагининового воспаления. Обнаружены два соединения с умерен-ной антиоксидантной активностью и четыре соединения, обладающие противовосплительной актив-ностью, одно из которых превышает препарат сравнения диклофенак натрия. Синтезированные 4-пивалоил-2-пирролоны не обладают цитотоксичностью.

Ключевые слова: 1,2,4-трикарбонильные соединения, 3-гидрокси-1,5-диарил-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пирролоны, антиоксидантная активность, окислительный стресс, Escherichia coli, противовоспалительная активность, цитотоксическая активность.

Размещено на Allbest.ru