Разработка химикоаналитического метода определения метаболитов эфедрина водного экстракта из побегов эфедры в моче методом ГХМС

Размещено на http://www.allbest.ru/

Разработка химикоаналитического метода определения метаболитов эфедрина водного экстракта из побегов эфедры в моче методом ГХМС

Барсукова Дарья Александровна,

Коваленко Алексей Евгеньевич,

Кардонский Дмитрий Александрович

Еганов Александр Анатольевич

Аннотация

Освещаются вопросы изучения метаболитов эфедрина в моче лабораторных животных и разработки методики пробоподготовки биожидкостей с помощью твердофазной экстракции, и последующим определением целевых аналитов методом газовой хроматографии с массселективным детектированием.

Введение

Изучение продуктов метаболизма препаратов на основе растительного сырья зачастую является трудной задачей из-за достаточно низкой концентрации интересующих и большого количества сопутствующих веществ в растительном сырье и биообъектах. Нами было проведено исследование биожидкостей животных, получавших водное извлечения из побегов эфедры, повсеместно использующихся в Республике Тыва в лечебных целях. эфедрин метаболит экстракция

Сырье Эфедры (хвойника) имеет токсикологическое значение [6]. В связи с этим, нами была предпринята попытка разработки методики, позволяющей проводить определение наиболее активных компонентов сырья данного вида в моче лабораторных животных, принимавших водные извлечения на его основе.

Побеги эфедры, как лекарственное растительное сырье, на протяжении 5 тысяч лет применяются в восточной медицине [4], в том числе и в Республике Тыва. Местным населением препараты на основе побегов Эфедры применяются в качестве средства регулирующего сердечно-сосудистую, выделительную системы и при онкозаболеваниях.

В современной научной медицине до недавнего времени препараты эфедрина широко назначались при бронхиальной астме, состояниях, сопровождающихся гипотонией, острых респираторных вирусных инфекциях, простуде, отравлении препаратами группы морфина и скополамином [8].

С другой стороны Республика Тыва является одним из самых неблагополучных районов, где распространено использование некоторых видов растений в качестве прекурсоров наркотических веществ. Так, эфедрин и псевдоэфедрин могут служить сырьём для нелегального производства метамфетамина и эфедрона. Изза высокого содержания этих веществ, трава некоторых видов хвойника может выступать в роли прекурсора для нелегального производства наркотиков, хотя для этих целей она редко используется на практике [5].

В связи с ужесточением законодательных ограничений в области оборота наркотических средств и психотропных веществ от 3 сентября 2004 года, представители рода Хвойник (лат. Ephedra L.) были включены в список растений, содержащих наркотические вещества, которые запрещены для культивирования на территории Российской Федерации.

Из-за низкого уровня социально-экономического развития северных регионов Российской Федерации (на примере Республики Тыва) медицинское обеспечение, а также фармакологическая поддержка местного населения оставляет желать лучшего. Зачастую у местного населения нет другого выхода, кроме как пользоваться растительными источниками лекарственных средств. С другой стороны достоверных научных данных об их безопасности и эффективности не так уж много.

С целью пополнения базы данных о видах, воздействии, метаболизме и идентификации в биожидкостях человека препаратов и их метаболитов на основе редких видов лекарственного растительного сырья, а также в перспективе изучение воздействия данных препаратов на организм с целью предотвращения токсикологического отравления, было и проведено данное исследование.

Экспериментальная часть

Для получения биожидкости (мочи), содержащей интересующие метаболиты, белым лабораторным мышам самцам на протяжении 7 дней интрагастрально вводили свежеприготовленное водное извлечение (1:10) из побегов эфедры. Далее производили забор мочи у этих животных с целью последующего анализа на алкалоиды эфедринового ряда.

Современный химико-токсикологический анализ состоит из двух основных этапов:

Ш предварительные методы исследования,

Ш подтверждающие методы.

В качестве предварительного было выбрано экспресстестирование с помощью иммуно-хроматографических тестполосок, в качестве подтверждающего - газовая хроматография с массселективным детектированием.

Результаты и их обсуждение

Существует множество иммуно-хроматографических тестов, позволяющих определять наличие производных фенилалкиламина, наиболее известными из которых являются амфетамин, эфедрин, адреналин и др. Мы учли этот факт и для анализа образцов мочи мышей воспользовались экспресстестированием с помощью тестполосок для определения производных фенилалкиламинов. Иммуно-хроматографическую полоску вертикально помещали в пробу мочи, при этом температуру исследуемого образца держали в пределах 2025 оС.

Тест дал положительный результат, что говорит о достаточно высокой чувствительности метода.

Часто интересующие аналиты находятся в моче в связанном с глюкуроновой кислотой или другими эндогенными соединениями состоянии. Для разрыва связей с этими соединениями необходимо проведение гидролиза. Но с учетом того, что эфедрин на 5595% выводится в неизменном виде [1], гидролиз не требовался.

1. Выбор картриджа для проведения твердофазной экстракции

В качестве методики извлечения анализируемых веществ нами была избрана твердофазная экстракция (ТФЭ), как наиболее эффективная по сравнению с традиционными способами извлечения. Например, классическая жидкость-жидкостной экстракция, зачастую не позволяет проводить экстракцию, если анализируемая проба представлена в микроколичествах. На примере модельных смесей мы подобрали наиболее подходящий сорбент для ТФЭ.

В литературе, к сожалению, отсутствует информация по оптимальному подбору картриджей для твердофазной экстракции [3]. Критерием подбора картриджей служило количество экстрагированного анализируемого вещества из водного раствора. Для этого была приготовлена модельная смесь эфедрина гидрохлорида в концентрации предположительно соответствующей таковой в моче.

В качестве картриджей применяли: SepPak C18 (Waters Corp.), Oasis HLB (Waters Corp.), Oasis MCX (Waters Corp.). Подготовку проб с помощью твердофазной экстракции проводили в соответствии с рекомендациями фирм производителей. Приготовленный раствор эфедрина гидрохлорида дериватизировали трифторуксусным ангидридом, полученные производные упаривали досуха и реконструировали в этилацетате для последующего газохроматографического определения.

В качестве образца сравнения был взят раствор анализируемого вещества объемом 20 мкл в метаноле, который не подвергали твердофазной экстракции. Его упаривали досуха, дериватизировали, полученное производное упаривали досуха и реконструировали в этилацетате. Площадь пика образца сравнения была принята за 100%.

Было установлено, что выход анализируемого вещества на картридже SepPak C18 составил 87.99%, Oasis HLB - 80.06, Oasis MCX - 75.66%. Таким образом, был выбран картридж SepPak C18.

2. Подготовка картриджа для ТФЭ

Картридж помещали в вакуумный манифолд для ТФЭ и последовательно промывали 1 мл метанола, 1 мл смеси метанолвода (1:1) и 1 мл деионизованной воды.

3. Процесс экстракции

Образец пропускали через картридж с подготовленным сорбентом со скоростью 2 мл/мин. Далее в течении 1015 минут через картридж пропускали поток воздуха до полного высушивания сорбента. Далее сорбированные вещества смывали в виалу емкостью 2 мл смесью дихлорметан/2пропанол (3:1). Затем содержимое виалы упаривали досуха в токе сухого воздуха при 50 єС.

4. Дериватизация

Следующим этапом была модификация анализируемого вещества с целью улучшения его газохроматографических характеристик. Существует множество дериватизирующих агентов. В соответствии с литературными данными, а также данными из практики, в качестве оптимального нами был выбран метилбистрифторацетамид (МБТФА). На хроматограмме представлен пик производного эфедрина - эфедрин2трифторацетамид (эфедрин2ТФА).

Рисунок. Хроматограмма экстракта мочи, содержащего деиватизированное производное эфедрин 2ТФА

К сухому остатку в виале, полученному после твердофазной экстракции и упаривания добавляли 20 мкл МБТФА, герметически закрывали и помещали в термостат, нагретый до 80 єС на 15 минут. После этого смесь упаривали досуха в токе сухого воздуха при 50 єС. Далее сухой остаток реконструировали в 100 мкл этилацетата. Анализировали методом газовой хроматографии с массселективным детектированием (ГХМС анализ) по дериватизированному производному эфедрина - эфедрин2ТФА

5. Газовая хроматография с массселективным детектированием

Так же нами были подобраны условия массспектрометрического определения эфедрина в моче (сканирование проводилось по полным и выделенным ионам, что обычно позволяет вести детектирование анализируемых веществ в малых концентрациях). На примере одной из полученных хроматограмм хорошо виден пик анализируемого вещества - производного эфедрина. По сравнению со временем удерживания, массспектру образца сравнения, а также библиотечному массспектру PMWTox, он полностью соответствует массспектру производного эфедрина (рисунок).

Ш Инструментальный анализ проводили на газовом хроматографе Agilent 6890. Параметры метода массспектрометрического детектирования: колонка НР5MS, 0.25 мм, 0.25 мкм; газноситель гелий марки А; температура инжектора 250 С; термостат: начальная температура 70 С - 2 мин, повышение температуры со скоростью 20 С/мин до 280 С, сохранение такой температуры 15 мин; инжектор Splitless; скорость потока газаносителя 1 мл/мин. "Задержка на растворитель" - время включения катодов и анализатора - через 3 мин после ввода пробы. Диапазон сканируемых масс 50700 а.е.м. Температура источника ионов 230 С. Температура анализатора 150 С. Режим работы детектора устанавливается по стандартной программе AUTOTUNE.

Ш Детектирование при сканировании по полному ионному току производили при сравнении массспектра пика вещества с массспектром из библиотек массспектров PMWTox.

Ш Выводы

В результате проведенных работ была получена новая универсальная методика определения метаболитов эфедрина в микроколичествах в моче с помощью твердофазной экстракции и последующим анализом методом ГХМС.

Благодарности

Выражаем благодарности Павловой Л.А., заведующей лабораторией биологически активных соединений НИИ молекулярной медицины ПМГМУ им. Сеченова, за предоставление возможности работы с лабораторными животными и получения материалов для исследования.

Литература

1. Коваленко А.Е., Кордонский Д.А., Еганов А.А., Гришин Д.А., Саломатин Е.М. Современные подходы к анализу наркотических веществ в биологических объектах. Судебномедицинская экспертиза. 2007. С.2832.

2. Popat N. Patil, A. Tye and J.B. LaPidus A pharmacological study of the ephedrine isomers JPET May 1965. Vol.148. No.2. P.158168.

3. J. Krol. "The Ephedra Story: Analysis of Ephedra Alkaloids Using LC/UV, Part 2: The Sample Preparation Validation". Waters Corp. 2002.

4. Ikhlas A. Khan, Ehab A. Abourashed. Ephedra. Leung's Encyclopedia of Common Natural Ingredients: Used in Food, Drugs and Cosmetics. New York: Wiley. 2009.

5. K.M. Andrews. Ephedra's role as the precursor in the clandestine manufacture of methamphetamine. Journal of Forensic Science. 1995. Vol.40. P.551560.

6. Гусынин И.А. Токсикология ядовитых растений. М.: Изд. сельскохозяйственной литературы, журналов и плакатов. 1962.

7. Постановление Правительства Российской Федерации от 3 сентября 2004 г. № 454. М.: Федеральная служба Российской Федерации по контролю за оборотом наркотиков. (3 сентября 2004).

8. WHO Monographs on Selected Medicinal Plants. Herba Ephedrae. Geneva: World Health Organization. 1999. Vol.1. P.145153.

Размещено на Allbest.ru