138 К.Е. Медведев, Д.А. Афонников, Ю.Н. Воробьев

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Изучение методами молекулярной динамики структур белков Nip7 глубоководных и мелководных архей в условиях повышенного давления

Давление - один из важных факторов внешней среды. Большинство живых организмов обитает при атмосферном давлении ~0,1 МПа, а воздействие на них повышенного давления нарушает работу таких систем, как репликация, транскрипция, трансляция и синтез белка, транспорт веществ через мембраны, и приводит к гибели клеток [1]. Однако существуют организмы-пьезофилы, которые способны жить при давлениях в тысячу раз больших атмосферного, например на дне Марианской впадины (~100 МПа). Изучение механизмов адаптации этих организмов к высоким давлениям позволит выявить факторы, обеспечивающие устойчивость живых систем в экстремальных условиях, а их белки могут быть использованы в биотехнологии [2].

На молекулярном уровне одним из факторов нарушения работы клетки при воздействии высоких давлений является дестабилизация белков, которые выполняют важнейшие функции. Эксперименты показали, что высокие давления могут нарушать структуру белков и их комплексов. При увеличении давления до 200 МПа происходит распад белковых комплексов. При давлении 500 МПа может наблюдаться частичная денатурация белка, и при 1 ГПа он полностью денатурирует [3]. Предполагают, что ключевым фактором такой дестабилизации является проникновение молекул растворителя внутрь гидрофобного ядра белка [1].

Изучение механизмов устойчивости белков при повышенных давлениях представляет большой интерес. В последнее время при решении этих задач все больше используется компьютерное моделирование динамики белка. Это направление исследований становится все более актуальным, так как молекулярная динамика позволяет проникнуть в суть процессов, происходящих в растворе с биомолекулами, получать распределения термических свойств молекул, анализировать ансамбли конформаций белка.

Так, в работе [4] проводилось моделирование молекулярной динамики репрессора Arc при температуре 300 К, на протяжении 500 пикосекунд, в диапазоне давлений от 0,1 до 100 МПа. Результаты показали, что значение среднеквадратичного отклонения RMSD при температуре 300 К и атмосферном давлении оставалось на уровне 0,2 нм на протяжении всего моделирования. При температуре 400 К белок терял свою структуру и наблюдалась денатурация. Увеличение давления до 1 000 МПа при нормальной температуре не давало никаких особых изменений в структуре репрессора, при 400 К и 1000 МПа не наблюдалась денатурация белка, однако присутствовало увеличение значений RMSD. В работе [5] методом молекулярной динамики исследовалось влияние высокого давления на равновесие между двумя формами белковых структур - миоглобина и нейроглобина. Результаты показали, что основной эффект влияния давления - это снижение подвижности белка без значительных структурных изменений.

В настоящей работе было проведено исследование структур белков Nip7 архей рода Pyrococcus из мелководных термальных источников (P. furiosus [6], глубины обитаний до 100 м) и глубоководных, пьезофилов (P. abyssi [7], глубины обитания около 2 200 м). Белок Nip7 вовлечен в биогенез рибосом и участвует в процессинге 27S пре-рРНК и в образовании 60S субъединицы рибосом [8]. Атомная модель данного белка содержит два независимых мономера и 252 молекулы воды. Мономеры не содержат структурных различий и формируют димер, который, по мнению авторов, образовался в результате кристаллизации и не имеет биологической значимости. Мономер Nip7 состоит из двух альфа-бета доменов (рис. 1). N-терминальный домен состоит из пяти антипараллельных в-листов, окруженных тремя б-спиралями и одной спиралью 3₁₀. РНК-связывающий С-терминальный домен включает аминокислотные остатки с 95-го по 159-й и состоит из в-листов, одной б-спирали и одной короткой спирали 3₁₀ [9]. Аминокислоты аргинин и лизин R151, R152, K155, K158 С-терминального домена формируют положительно заряженную область, которая способствует связыванию белка и РНК.

Мы сравнили динамику белков Nip7 из двух организмов при различных давлениях между собой, чтобы выявить возможные отличия структурных свойств этих белков. В результате было показано, что деформация структуры Nip7 мелководной археи P. furiosus в целом больше, чем у глубоководной P. abyssi. Структурные деформации РНК-связывающего сайта при высоких давлениях больше у белка из P. furiosus. Анализ компьютерных моделей белков Nip7 из P. abyssi и P. furiosus показал, что с увеличением давления площадь поверхности белка, доступной растворителю, уменьшается. Для моделей Nip7 P. abyssi эта площадь меньше и ее относительные изменения меньше, чем у Nip7 из P. furiosus. Полученные результаты согласуются с гипотезой о важности взаимодействия белка с растворителем при увеличении давления.

N-терминальный домен

138 К.Е. Медведев, Д.А. Афонников, Ю.Н. Воробьев

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Трехмерная структура белка Nip7 P. furiosus. Серым цветом выделены остатки, которые отличаются у белков P. abyssi и P. furiosus, черным - идентичные остатки. Пунктиром выделены домены белка. Изображение структуры получено с помощью программы Accelrys Discovery Studio Visualizer [10]

растворитель белок молекулярный

Структуры белков Nip7 P. abyssi и P. furiosus. Белки Nip7 были выбраны по следующим причинам. Во-первых, для них был идентифицирован режим движущего отбора в ходе эволюции архей Pyrococcus [11]. Следовательно, функция этого белка может быть важной для адаптации организмов к изменению давления среды. Во-вторых, для гомолога P. abyssi известна пространственная структура [9]. В-третьих, длина его полипептидной цепи невелика, составляет 166 аминокислотных остатков, что приемлемо для моделирования. В-четвертых, последовательности Nip7 P. abyssi и его гомолога у P. furiosus выравниваются без делеций / вставок, уровень сходства последовательностей составляет около 75%, что позволяет моделировать пространственную структуру гомолога у P. furiosus без реконструкции петель (этапа предсказания структуры белка по гомологии, который вносит существенные ошибки).

Для создания модели белка в окружении молекул раствора использовалась программа WHAT IF [14]. Модель включает 1 568 атомов белка и 50 000 молекул воды.

Моделирование молекулярной динамики пространственной структуры белка осуществлялось с помощью пакета программ GROMACS [15] с использованием молекулярного силового поля GROMOS 45А3. Мы моделировали белок при температуре 300 К в кубической ячейке с ребром 6 нм, окруженный молекулами воды и ионами для компенсации заряда, при давлениях 0,1 10, 100, 150 и 200 МПа. Параметры моделирования были установлены, как рекомендовано в работе Коллинза и соавт. [16]. Время моделирования равнялось 300 пикосекундам. Это время соответствует небольшим флуктуациям в структуре белка и является достаточным для того, чтобы программа привела белок в состояние равновесия.

Для анализа брались структуры после достижения равновесия в процессе моделирования в системе «белок - растворитель». Равновесие достигалось начиная с 250 пс. Таким образом, в рассмотрение брались структуры с момента моделирования 250 до 300 пс через каждые 5 пс, всего 11 структур.

Для сравнения бралась исходная модель в начальный момент времени (0 пс).

Анализ результатов моделирования

Вторичная структура рассчитывалась программой DSSP [17].

Отклонение структур характеризовали среднеквадратичным отклонением координат C-альфа атомов (RMSD). Эта величина измеряется в ангстремах (1Е = 10-¹⁰м) и вычисляется по следующей формуле:

RMSD (, v w) =138 К.Е. Медведев, Д.А. Афонников, Ю.Н. Воробьев

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

где v, w - структуры белка; i - номер остатка; j - координаты С-альфа атома (j = x, y, z); v_ij, w_ij - значения координаты j С-альфа атома остатка i структуры v; n - общее количество остатков. Для полностью совпадающих структур RMSD равно 0; чем больше ее значения - тем выше различия в структурах белков. Все структурные характеристики моделей, такие как значение RMSD и поверхность, доступная растворителю, рассчитывались программами из пакета GROMACS.

Для того чтобы определить, какие участки структуры белка подвержены наибольшим изменениям в результате воздействия давления, мы рассчитывали для каждого остатка m локальное отклонение структуры полипептидной цепи RMSD_qm:

RMSD (,_q v w) =138 К.Е. Медведев, Д.А. Афонников, Ю.Н. Воробьев

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

RMSD_qm по смыслу аналогичен RMSD, но оценивается в пределах скользящего окна размером q = 10 аминокислот. Величины v_ij, w_ij определены выше, m - индекс положения окна в последовательности (q / 2 < m < = n-q / 2).

На рис. приведены значения RMSD между исходной моделью белка Nip7 P. furiosus и моделями на разных шагах моделирования. Из рис. 3 видно, что после шага моделирования, соответствующего времени 250 пс, RMSD выходит на плато 2-3 Е и в дальнейшем не возрастает. Это означает, что модель белка достигает состояния равновесия, является стабильной и не подвергается разворачиванию полипептидной цепи при времени моделирования до 300 пс. Аналогичную стабилизацию значений RMSD мы наблюдали и для всех остальных моделей при исследованных нами давлениях. Таким образом, все полученные нами модели были стабильными на интервалах до 300 пс.

Зависимость среднеквадратичного отклонения RMSD от времени моделирования для белка Nip7 P. furiosus при различных значениях давления

Для того чтобы исследовать, какие участки белка подвергаются структурным изменениям при воздействии давлений, мы сравнили профиль локальных изменений структуры белка RMSD_q для белков Nip7 P. furiosus и P. abyssi при различных давлениях. Пример профиля при давлении 150 МПа приведен на рис. 4. Интересно отметить, что для некоторых участков белка и в одном и в другом белке наблюдается сильное отклонение от исходной структуры (позиции 59-77). В то же время для профиля отклонений есть и отличия. В целом отклонения структуры для белка P. furiosus больше, чем для P. abyssi. Интересно, что отличия RMSD_q наблюдаются и для участка связывания РНК: отклонения от исходной структуры меньше в этих районах для белка P. abyssi, что может свидетельствовать о большей стабильности РНК связывающего домена этого белка.

Известно, что одним из основных факторов дестабилизации белковой структуры при действии высокого давления является взаимодействие с растворителем. Для того чтобы проанализировать, как меняется взаимодействие с растворителем при воздействии на структуру белка высокого давления, мы рассчитали для разных давлений среднюю площадь остатков, доступных растворителю для моделей белков Nip7 P. abyssi и P. furiosus и разных давлений. Результаты представлены на рис.

138 К.Е. Медведев, Д.А. Афонников, Ю.Н. Воробьев

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Зависимость среднеквадратичного отклонения RMSD_q от номера аминокислотного остатка для двух исследуемых белков при давлении 150 МПа

Стрелками отмечены участки связывания РНК [9], которые являются достаточно консервативными, и с увеличением давления значение их RMSD_q практически

не изменяется. Прямоугольником отмечена область наибольшего изменения значения RMSD_q для обоих белков

138 К.Е. Медведев, Д.А. Афонников, Ю.Н. Воробьев

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Давление, МПа

График зависимости средней доступности остатка растворителю от давления для двух исследуемых белков

Из рис. видно, что для белка Nip7 P. furiosus, который обитает на мелководье, средняя доступность остатка растворителю выше, чем у P. abyssi. Кроме того, наибольшее изменение средней доступности остатка растворителю происходит при переходе от 0,1 к 100 МПа, что соответствует природным давлениям: 0,1 МПа - атмосферное давление, 100 МПа - давление на дне Марианской впадины. Это означает, что наиболее сильные изменения площади поверхности этих белков происходят в интервалах давлений, характерных для глубин Мирового океана.

Из рис. видно, что доступность гидрофильных остатков растворителю практически остается неизменной. Поэтому основной вклад в изменение доступности остатков растворителю вносят гидрофобные аминокислоты белковой структуры.

138 К.Е. Медведев, Д.А. Афонников, Ю.Н. Воробьев

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

138 К.Е. Медведев, Д.А. Афонников, Ю.Н. Воробьев

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

б

Изменение средней доступности остатков растворителю в зависимости от давления для гидрофильной (б) и гидрофобной (а) составляющих поверхности

Полученные результаты согласуются с гипотезой о важном вкладе взаимодействия белка с растворителем при воздействии повышенных давлений.

В работе проведено сравнение компьютерных моделей трехмерных структур белков Nip7 из P. abyssi и P. furiosus при давлениях от 0,1 до 200 МПа. Показано, что деформация структуры Nip7 мелководной P. furiosus в целом больше, чем глубоководной P. abyssi. Структурные деформации РНК-связывающего сайта при высоких давлениях больше у белка из P. furiosus. Кроме того, анализ компьютерных моделей белков Nip7 из P. abyssi и P. furiosus показал, что с увеличением давления площадь поверхности белка, доступной растворителю, уменьшается. Для моделей Nip7 P. abyssi эта площадь меньше и ее относительные изменения меньше, чем у Nip7 из P. furiosus. Полученные результаты согласуются с гипотезой о важности взаимодействия белка с растворителем при увеличении гидростатического давления.

Литература

растворитель белок молекулярный

1. Winter R., Oger P. Origins of life and biochemistry under high-pressure conditions // Chemical Society Reviews. 2006. №35. P. 858-875.

2. Bull A.T., Ward A.C., Goodfellow M. Search and Discovery Strategies for Biotechnology: the Paradigm Shift // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. №64. Р. 574-606.

3. Doster W., Petry W., Schober H. High pressure - unfolding of myoglobin studied by dynamic neutron scattering // Chemical Physics. 2003. Р. 383-387.

4. Trzesniak D., Lins R.D., van Gunsteren W.F. Protein under pressure: molecular dynamics simulation of the arc repressor // Proteins. 2006. №65. Р. 136-144.

5. Capece L., Marti M.A., Bidon-Chanal A. et al. High pressure reveals structural determinants for globin hexacoordination: Neuroglobin and myoglobin cases // Proteins. 2009. №75. Р. 885-894.

6. Fiala G., Stetter K.O. Pyrococcus furiosus sp. nov. represents a novel genus of marine heterotrophic archaebacteria growing optimally at 100°C // Arch Microbiol. 1986. №145. Р. 56-61.

7. Erauso G., Reysenbach A-L., Godfroy A., Meunier J-R. et al. Pyrococcus abyssi sp. nov., a new hyperthermophilic archaeon isolated from a deep-sea hydrothermal vent // Arch Microbiol. 1993. №160. P. 338-349.

8. Bassler J., Grandi P., Gadal O. et al. Identification of a 60S preribosomal particle that is closely linked to nuclear export // Mol. Cell. 2001. №8. Р. 517-529.

9. Coltri P., Guimaraes B., Garanto D., Luz J. Structural Insights into the Interaction of the Nip7 PUA Domain with Polyuridine RNA // Biochemistry. 2007. №46. Р. 14177-14187.

10. Sali A., Pottertone L., Yuan F. et al. Evaluation of comparative protein modeling by MODELLER // Proteins. 1995. №23. P. 318-326.

11. Gunbin K.V., Afonnikov D.A., Kolchanov N.A. Molecular evolution of the hyperthermophilic archaea of the Pyrococcus genus: analysis of adaptation to different environmental conditions // BMC Genomics. 2009. №10. Р. 639.

12. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G. et al. The Protein Data Bank // Nucleic Acids Research. 2000. №28. Р. 235-242.

13. Schwede T., Kopp J., Guex N., Peitsch M.C. SWISS-MODEL: An automated protein homology-modeling server // Nucl. Acids Res. 2003. №31. Р. 3381-3385.

14. Vriend G. WHAT IF: A molecular modeling and drug design program // J. Mol. Graph. 1990. №8. P. 52-56.

15. Van der Spoel D., Lindahl E., Hess B. et al. GROMACS: Fast, Flexible and Free // J. Comp. Chem. 2005. №26. Р. 1701-1718.

16. Collins M.D., Hummer G., Quillin M.L., Matthews B.W. and Gruner S.M. Cooperative water filling of a nonpolar protein cavity observed by high-pressure crystallography and simulation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. №102. Р. 16668-16671.

17. Kabsch W., Sander C. Dictionary of protein secondary structure: pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features // Biopolymers. 1983. №22. Р. 2577-2637.

Размещено на Allbest.ru