Влияние углеводов на протеолитическую активность штаммов Lactococcus lactis

48 М.А. Брацихина, С.А. Рябцева

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Влияние углеводов на протеолитическую активность штаммов Lactococcus lactis

Lactococcus lactis относится к грамположительным молочнокислым бактериям и широко используется в молочной промышленности, в частности при производстве кисломолочных продуктов, кислосливочного масла и сыров. Кроме того, L lactis активно используется в различных направлениях биотехнологии [1-4]. На сегодняшний день много работ посвящено исследованию физиологических и генетических свойств L lactis и полностью расшифрована последовательность геномов некоторых штаммов [5-7]. Одной из важнейших характеристик молочнокислых микроорганизмов является их протеолитическая активность. Повышенная способность микрофлоры заквасок разлагать белки используется в сыроделии, однако при производстве кисломолочных продуктов это свойство может привести к возникновению пороков.

В исследованиях, проведенных ранее, было установлено, что некоторые углеводы, в частности пребиотик лактулоза, могут оказывать влияние на такие свойства молочнокислых микроорганизмов, как: кислотообразующая способность и выживаемость [8, 9]. Однако зависимость протеолитической активности лактококков от присутствия в среде культивирования углеводов изучена недостаточно. В связи с этим целью данной работы стало исследование влияния лактулозы, лактозы и глюкозы на протеолитическую активность двух штаммов L lactis.

Работа выполнена в рамках программы Erasmus Mundus Action 2 (01.02.2011-30.06.2012) на кафедре биотехнологии Вроцлавского университета (Польша); консультантом выступал д-р техн. наук, проф. Марчин Лукашевич.

Объектами исследований являлись два генетически модифицированных штамма L lactis: pNZ45subC и pNZ48СЕ, взятые из коллекции микроорганизмов Университета во Вроцлаве. Оба штамма содержат ген subC, полученный из Bacillus licheniformis и отвечающий за продукцию протеазы. Отличительной особенностью штамма L lactis pNZ48СЕ является способность к синтезу двух протеаз. Поскольку синтез протеазы данными микроорганизмами возможен лишь в результате индукции низином, то в работе был использован также низинпродуцирующий штамм L lactis NZ9700.

Исследования проводились с использованием системы NICE (nisincontroled gene expression) [10]. Система основана на механизмах регуляции оперона nisinA в штаммах L lactis. Низин индуцирует последовательность процессов, которая начинается с присоединения к мембраносвязанному рецептору NisK. Затем фосфатная группа от активированного NisK переходит к внутриклеточному ответному регулятору NisR, активируя этот регулятор. Далее NisR индуцирует низин-оперон в промоторе nisA. Промотор nisA контролирует экспрессию генов, участвующих в биосинтезе низина (или интересующего гена).

На первом этапе исследований проводилась активация штаммов L lactis путем инкубирования при температуре 30°С в течение 20 ч в среде М17 [11], содержащей 0,5% глюкозы и 5 мг/мл антибиотика хлорамфеникола. Рост культур определяли по изменению оптической плотности при длине волны 600 нм (Thermo Electron Corporation Evolution 600 UV-Visible Spectrophotometer, США).

На следующем этапе для приготовления опытных образцов в среду, предназначенную для культивирования L lactis, добавляли обезжиренное молоко в количестве 10% от объема образца и углеводы: глюкозу, лактозу или лактулозу в концентрации 1, 3 и 5%. Далее в среду вносили активированную культуру с концентрацией клеток, соответствующей оптической плотности 0,1. Индукция штаммов L lactis проводилась при этом же значении оптической плотности путем добавления низина или супернатанта, полученного из штамма L lactis NZ9700, разведенного в 10⁴ раз. Культивирование микроорганизмов проходило в течение 20 ч при 30°С.

После инкубирования проводили определение протеолитической активности опытных образцов. Для определения протеолитической активности использовался метод с применением в качестве субстрата 0,5% раствор казеина, приготовленного в 50 мМ Tris-HCl буфере, рН раствора поддерживали на уровне 10. Метод основан на определении скорости ферментативной реакции гидролиза субстрата под действием исследуемых протеолитических ферментов, содержащихся в материале, взятом на анализ. Скорость реакции определяли по количеству образовавшихся аминокислот - тирозина и триптофана.

Для измерения протеолитической активности к 500 мкл субстрата добавляли 100 мкл супернатанта, полученного в результате центрифугирования опытных образцов в течение 10 мин при температуре 4°С и скорости 13 000 об./мин (5415R centrifuge, Eppendorf, Германия). Приготовленные образцы инкубировали при 50°С (термостат Bio TDB-100, BioSan, Латвия) в течение 30 мин. Остановку реакции осуществляли путем добавления 500 мкл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Далее проводили повторное центрифугирование образцов и измерение оптической плотности супернатанта при длине волны 275 нм. Все исследования проведены в 4-5-кратной повторности. Полученные результаты были обработаны с помощью программы MS Excel и представлены на рисунках в виде среднеарифметических значений с указанием стандартных отклонений измеряемых показателей.

Для всех измерений величина стандартного отклонения не превышала 5%.

Синтез протеазы указанными штаммами L lactis возможен лишь под действием низина, однако низин является довольно дорогостоящим веществом. В связи с этим на первом этапе исследований представляло интерес проведение сравнения протеолитической активности L lactis, индуцированных низином либо супернатантом, полученным из штамма L lactis NZ9700. В исследованиях, проведенных нами ранее, отмечено, что наивысшие показатели протеолитической активности наблюдаются при культивировании штаммов L lactis в среде, содержащей 10% обезжиренного молока. В связи с этим культивирование и индукцию штаммов L lactis pNZ45subC и L lactis pNZ48СЕ проводили в среде М-17, содержащей 0,5% глюкозы и 10% обезжиренного молока. Результаты измерения протеолитической активности штамма L lactis pNZ45subC, индуцированного низином и супернатантом, представлены на рис. 1 и 2 соответственно.

Полученные результаты (рис. 1) показывают, что наибольшая протеолитическая активность была отмечена в образцах, содержащих 0,5-10 нг/мл низина, в образцах, не содержащих низин, уровень протеолитической активности был близок к 0.

На рис. 2 видно, что наивысший уровень протеолитической активности отмечен в образцах, индуцированных супернатантом, разведенным в 10⁴ раз. Аналогичные результаты были получены при использовании штамма L lactis pNZ48СЕ.

48 М.А. Брацихина, С.А. Рябцева

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Зависимость протеолитической активности L lactis pNZ45subC от концентрации низина

48 М.А. Брацихина, С.А. Рябцева

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2. Зависимость протеолитической активности L lactis pNZ45subC от концентрации супернатанта

лактулоза низин штамм

Поскольку уровень протеолитической активности в образцах, индуцированных низином и супернатантом, разведенным в 10⁴ раз, находится практически на одинаковом уровне, то в дальнейших исследованиях индукция проводилась супернатантом, полученным из штамма NZ9700, что является экономически более выгодным.

На следующем этапе были проведены исследования по влиянию различных углеводов на уровень протеолитической активности двух штаммов L lactis pNZ45subC и pNZ48СЕ. Культивирование и индукция штаммов проводилась в среде М-17, содержащей 10% обезжиренного молока. Результаты измерения протеолитической активности представлены на рис. 3, 4.

Рис. 3. Зависимость протеолитической активности L lactis pNZ45subC от вида и концентрации углеводов

Рис. 4. Зависимость протеолитической активности L lactis pNZ48СЕ от вида и концентрации углеводов

Как видно из рис. 3, 4, наивысший уровень протеолитической активности штаммов L lactis pNZ45subC и pNZ48СЕ отмечен в образцах, содержащих глюкозу. Присутствие же в среде лактозы и лактулозы, вероятно, блокирует действие низина, вследствие чего протеолитическая активность обоих штаммов близка к 0.

Таким образом, проведенные исследования позволили установить возможность замены низина, необходимого для индукции штаммов L lactis pNZ45subC и pNZ48CE, на супернатант, полученный из низинпродуцирующего штамма L lactis NZ9700. При этом использование разведенного в 10⁴ раз супернатанта обеспечивает тот же уровень протеолитической активности, что и 0,5-10 мг/мл низина.

Наивысшая протеолитическая активность наблюдается при культивировании штаммов L lactis pNZ45subC и pNZ48CE в среде М-17 с добавлением 10% обезжиренного молока и 0,5-1% глюкозы. Поскольку протеолитическая активность образцов с добавлением глюкозы 0,5 и 1% находится практически на одинаковом уровне, то экономически более выгодным является внесение меньшей концентрации углевода - 0,5%. Добавление в среду для культивирования лактозы и лактулозы способствует значительному снижению протеолитической активности обоих штаммов L lactis и, по всей видимости, ингибирует действие низина. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что внесение лактозы и лактулозы не будет активизировать протеолитическую активность молочнокислых лактококков и, как следствие, возникновение пороков кисломолочных продуктов.

Литература

1. Blatny J.M., Ertesvag H., Nes I.F., Valla S. Heterologous gene expression in Lactococcus lactis; expression of the Azotobacter vinelandii algE6 gene product displaying mannuronan C-5 epimerase activity // FEMS Microbiology Letters. 2003. Vol. 227, is. 2. P. 229-235.

2. Kunji E.R., Slotboom D.J., Poolman B. Lactococcus lactis as host for overproduction of functional membrane proteins // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 2003. Vol. 1610, is. 1. P. 97-108.

3. Morello E.L., Bermudez-Humaran G., Llull D. еt al. Lactococcus lactis, an efficient cell factory for recombinant protein production and secretion // Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2008. №14. P. 48-58.

4. Nouaille S., Ribeiro L.A., Miyoshi A., Pontes D. et al. Heterologous protein production and delivery systems for Lactococcus lactis // Genetics and Molecular Research. 2003. №2. P. 102-111.

5. Bolotin A., Wincker P., Mauger S. et al. The complete genome sequence of the lactic acid bacterium Lactococcus lactis ssp lactis IL1403 // Genome Research. 2001. №11. P. 731-753.

6. Siezen R.J., Bayjanov J., Renckens B., Wels M. et al. Complete genome sequence of Lactococcus lactis subsp lactis KF147, a plant-associated lactic acid bacterium // Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2003. Vol. 192. P. 2649-2650.

7. Wegmann U., O'Connell-Motherway M., Zomer A. et. al. Complete genome sequence of the prototype lactic acid bacterium Lactococcus lactis subsp cremoris MG1363 // Journal of Bacteriology. 2007. Vol. 189, №8. P. 3256-3270.

8. Храмцов А.Г., Рябцева С.А., Полищук Д.О. (Мячина Д.О.). Разработка технологии цельномолочных продуктов с внесением концентрата лактулозы // Вестник Северо-Кавказского государственного технического университета. 2003. №1 (6). С. 30-32.

9. Рябцева С.А., Брацихина М.А., Ганина В.И. Проблема сохранения жизнеспособности заквасочной микрофлоры и пути ее решения // Молочная промышленность. 2010. №1. С. 22-23.

10. Platteeuw C., van Alen-Boerrigter I. еt al. Food-grade cloning and expression system for Lactococcus lactis // Applied and Environmental Microbiology. 1996. Vol. 62, №3. P. 1008-1013.

11. Terzaghi B.E., Sandine W.E. Improved medium for lactic streptococci and their bacteriophages // Applied Microbiology. 1975. Vol. 29, №6. P. 807-813.

Размещено на Allbest.ru