Создание и применение методов количественной протеомики с использованием и без использования изотопного мечения

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

При помощи современных методов, основанных на масс-спектрометрическом анализе, можно исследовать биологические объекты самого разного происхождения и сложности. Это стало возможным благодаря открытию новых методов ионизации вещества: метода электроспрей и метода лазерной десорбции/ионизации из матрицы (МАЛДИ) - которые позволили переводить в газовую фазу и одновременно ионизировать большие биологические молекулы, такие как пептиды, белки и полинуклеотиды. Среди методов масс-спектрометрии, используемых в протеомных исследованиях, масс-спектрометрия ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (ИЦР ПФ) занимает особое место. Главными достоинствами этого метода являются: сверхвысокая разрешающая способность и рекордная точность измерения масс. С помощью современного масс-спектрометра ИЦР ПФ можно однозначно как идентифицировать индивидуальные биомолекулы, так и определять состав их смесей.

В настоящее время полностью расшифрованы геномы различных организмов, в том числе и человека. В связи с исследованиями многообразия белков, содержащихся в различных биологических объектах, возникла новая фундаментальная концепция, названная «протеом» (ПРОТЕиновое дополнение к генОМу). Создана новая дисциплина - протеомика, которая призвана дополнить и аннотировать информацию, содержащуюся в геномах. Современная масс-спектрометрия (в том числе, и ИЦР ПФ) занимает передовые позиции в решении основной задачи протеомики идентификация белков. В настоящее время также ведется активная разработка масс-спектрометрических методов количественного анализа протеомов.

Масс-спектрометр ИЦР ПФ обладает ограниченным динамическим диапазоном, в то же время, протеомы различных организмов содержат белки в широком диапазоне относительных концентраций. И поэтому необходимо использовать масс-спектрометрии ИЦР ПФ в комбинации с существующими методами разделения (жидкостная хроматография, электрофорез). Время удерживания пептида (продукта гидролиза белка энзимом трипсин) на хроматографе может являться дополнительным параметром при идентификации пептида.

В работе разрабатывались и оптимизировались методы, использующие масс-спектрометрию ИЦР ПФ для исследования протеомного состава одной из физиологических жидкостей человека - мочи. В работе были разработаны и использованы новые подходы для обработки и интерпретации полученных данных, в том числе, для сравнительного количественного анализа протеома. Также проводилась разработка подхода для совмещения методов атомно-силового микроскопа и масс-спектрометрии, где масс-спектрометрические методы использовались для идентификации молекул, обнаруживаемых АСМ.

Цели и задачи:

1. разработать хромато-масс-спектрометрические методики анализа протеомного состава мочи человека;

2. разработать и применить в реальных исследованиях метод точной массово-временной метки для анализа протеома мочи;

3. создать новую базу данных, состоящую из точных массово-временных меток, для быстрого поиска и идентификации белков содержащихся в моче человека;

4. разработать методику сравнительного количественного анализа протеома, реального биологического объекта;

5. разработать подход масс-спектрометрической идентификации белков детектируемых методами атомно-силовой микроскопии.

Научная новизна работы.

1. Cоздана база данных точных массово-временных меток триптических пептидов протеома мочи человека.

2. Cоздана новая процедура нормирования времен удерживания на колонке жидкофазного хроматографа триптических пептидов белков, содержащихся в моче человека, которая может быть использована для идентификации белков методом точных массово-временных меток.

3. Разработан новый метод для сравнительного количественного анализа на основе использования методов точной массово-временной метки и изотопного мечения с применением концепции гипотетической аминокислоты «аверагин» для коррекции значений интенсивности пиков пептидов в спектрах.

4. Исследован протеомный состав мочи здорового человека, при помощи новой хромато-масс-спектрометрической методики, основанной на методе точной массово-временной метки. Обнаружено 39 новых генных продуктов.

5. Предложен подход совместного использования методов атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии для идентификации и количественного определения содержания белков при сверхмалых концентрациях.

Практическая значимость работы.

Разработанные хромато-масс-спектрометрические подходы для качественного и количественного анализа биологических жидкостей человека могут быть использованы при разработке методов диагностики различных патологий, вызванных, в том числе, заболеваниями.

Новая база данных точных массово-временных меток может использоваться для высокопроизводительного анализа протеома мочи человека при поиске биомаркеров различных заболеваний.

Подход, разработанный для идентификации белков, детектируемых методами атомно-силовой микроскопии может применяться для исследования других объектов, содержащихся в сверхнизких концентрациях в реальных биологических жидкостях.

Личный вклад автора.

Материал, представленный в диссертации, получен при непосредственном участии автора как в постановке задачи, так и при проведении исследований. База данных точных массово-временных меток создавалась автором совместно с Д.М. Автономовым (ИНЭП ХФ РАН), И.А. Поповым (ИБХФ РАН) и А.С. Кононихиным (ИНЭПХФ РАН). Метод количественного анализа был разработан автором совместно с Д.М. Автономовым (ИНЭП ХФ РАН). Подход к совместному использованию методов атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии был разработан совместно с А.С. Батуриным, Е.В. Дедковой (МФТИ (ГУ)). Диссертационная работа выполнена в Институте энергетических проблем химической физики Российской академии наук, в Лаборатории ионной и молекулярной физики, часть работ выполнялась автором параллельно в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук в период с 2005 по 2011 год.

Защищаемые положения.

1. новая база данных точных массово-временных меток триптических пептидов протеома мочи;

2. новый метод количественного анализа протеома физиологических жидкости человека, основанный на использовании методик точной массово-временной метки и изотопного мечения триптических пептидов изотопом 18O;

3. новая процедура нормирования времен удерживания на хроматографической колонке и идентификации пептидов;

4. метод идентификации белков при сверхмалых концентрациях с использованием масс-спектрометрии и атомно-силовой микроскопии.

Апробация работы.

Результаты работы докладывались на следующих российских и международных конференциях: 58-ая Ежегодная конференция американского масс-спектрометрического общества «Масс-спектрометрия и смежные темы», Солт Лейк Сити, США, 23-27 мая 2010; 4-я Всероссийская конференция «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения», Звенигород, Россия, 10 -14 октября 2010; 8-ая Международная конференция организации “Протеом Человека” (HUPO), Торонто, Канада, 26-30 сентября 2009; 57-ая Ежегодная конференция американского масс-спектрометрического общества «Масс-спектрометрия и смежные темы», Филадельфия, США, июнь 2009.

Публикации.

Основное содержание диссертации опубликовано в работах, список которых приводится в конце автореферата. Работы, результаты которых изложены в диссертации выполнены при поддержке грантов РФФИ, INTAS, Миннауки.

Список сокращений, используемых в тексте автореферата

ИЦР ПФ - ионный циклотронный резонанс с преобразованием Фурье;

AMT - подход точной массово-временной метки (accurate mass and time tags database);

LC - высокоэффективная жидкофазная хроматография (liquid chromatography);

MS - масс-спектрометрия (mass-spectrometry);

MS/MS - тандемная масс-спектрометрия;

CID - столкновительно-индуцированная фрагментация (collision induced dissociation);

ECD - фрагментация при захвате медленнего электрона (electron capture dissociation);

IRMPD - инфракрасная мультифотонная диссоциация (infrared multi photon dissociation);

АСМ - атомно-силовая микроскопия.

1. Литературный обзор

В котором дается краткое описание объекта исследования (моча человека), обсуждаются трудности и ограничения стандартных методов исследования протеома мочи (нисходящий и восходящий подходы протеомного анализа, подход точной массово-временной метки), обсуждаются возможности и преимущества применения масс-спектрометрии ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (ИЦР ПФ) в комбинации с различными методами фрагментации и ионизации биомакромолекул, с высокоэффективной жидкостной хроматографией и новыми методами обработки масс-спектров ИЦР.

Однозназначная идентификация, как индивидуальных биомакромолекул, так и их смесей напрямую связана с точностью измерения масс, поэтому в обзоре особое внимание уделено обсуждению этой характеристики.

Точность измерения масс и разрешение в масс-спектрометрии ИЦР ПФ

Измеряемой величиной в масс-спектрометрии ИЦР ПФ является частота, по значению которой можно рассчитать массу иона используя общепринятое калибровочное выражение:

,

где m и z - масса и заряд иона, соответственно, - измеряемая частота. Коэфиценты А и В являются постоянными величинами и расчитываются при калибровке масс-спектрометра по двум или более известным массам. Выражение (1) получается в приближении одного иона и не учитывает влияние объемного заряда и кулон-кулоновского взаимодействия между ионами. На практике для более точных измерений используется внутренняя калибровка масс-спектрометра, когда в образце содержатся одновременно исследуемое вещество и калибрант, поскольку, ионы калибранта вместе с ионами исследуемого вещества, подвержены одинаковым эффектам, искажающим точность измерения масс. Также проводят точные измерения с использованием внешней калибровки, при этом калибрант вводят отдельно от исследуемого вещества, если для каждого измерения в ИЦР ячейку захватывается примерно одинаковое число ионов.

В работе все измерения производились на гибридном масс-спектрометре Finnigan LTQ FT (Thermo Electron, Бремен, Германия; Рис. 1), который состоит из масс-спектрометра ИЦР ПФ со сверхпроводящим соленоидом (7 Тесла) и высокочувствительной линейной квадрупольной ионной ловушки.

Рис. 1. Схема гибридного масс-спектрометра Finnigan LTQ FT.

Изображенный на Рис. 1 гибридный масс-спектрометр является одним из самых современных приборов в своем классе и позволяет проводить измерения в режиме ИЦР ПФ с максимальным разрешением R=500000 для m/z=400 и точностью измерения масс 2ppm (при использовании внешней калибровки). Главными достоинствами прибора являются автоматический контроль числа ионов в масс-анализаторе и возможность использовать современные методы ионизации (электроспрей, атмосферный МАЛДИ) и фрагментацию биомакромолекул (в линейной квадрупольной ионной ловушке реализована столкновительно индуцированная фрагментация (CID), в ячейке ИЦР - инфракрасная мультифотонная диссоциация (IRMPD) и диссоциация, происходящая при захвате медленных электронов (ECD)). Последний из перечисленных методов фрагментации в отличии от двух первых позволяет получить осколки пептидов, образованные не по пептидной связи, а по связи N-C(альфа), так называемые c-, z-фрагменты.

Масс-спектрометрия ионного циклотронного резонанса была выбрана по причине максимальной точности измерения масс (в сравнении с другими масс-спектрометрическими методами- времяпролетная масс-спектрометрия, ионная ловушка, Орбитрэп), и достаточно высокой скорости измерения спектров для совмещения с хроматографическим методом разделения триптических пептидов, что необходимо для работы с использованием метода точной массово-временной метки, который в свою очередь, позволяет добиться минимального времени проведения эксперимента, количества образца и понижения порога чувствительности (из-за отказа от MS/MS).

Количественные методы в протеомике глобально подразделяются на два типа: с применением и без применения изотопных меток.

Изотопные метки для попарного сравнения образцов (для задач протеомики) начали разрабатываться с самого начала применения в этой области тандемной хромато-масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Метод основан на том, что в результате мечения пептиды в опытном и контрольном образцах дают пики в масс-спектрах, отстоящие друг от друга на несколько единиц массы. Метки конструируют таким образом, чтобы они не влияли на эффективность ионизации и времена хроматографического удерживания. По отношению интенсивностей пиков соответствующих пептидов определяют их относительное содержание в образцах.

Разработано несколько коммерчески доступных решений для проведения сравнительного количественного анализа протеомов. Примерами могут служить технологии ICAT (Isotope-Coded Affinity Tag) и ICROS (Isotope Coded Reduction Off of Chromatographic Support), в которых мечение производится по цистеиновому остатку. Более сложной является технология iTRAQ (Isobaric Tagging Reagents Amino-reactive Quantification), которая позволяет проводить количественный анализ сразу 4 образцов - но с использованием MS/MS. Изобарные (имеющие одинаковые массы) метки в iTRAQ связываются с N-концевым остатком пептидной цепи. Одним из методов модификации для количественного анализа является гуанидирование лизинового остатка пептидов.

Для сравнительного количественного анализа протеомов нами было использовано более простое и экономичное C-концевое ферментативное мечение изотопом кислорода 18О. Использование 18О-атома в качестве метки известно еще с работ Спирсона (Spirson) и Риттенберга (Rittenberg) 1951-го года, которые исследовали механизм ингибирования продуктов реакции гидролиза амидной связи химотрипсином. При применении 18О/16О изотопного мечения получаются химотриптические пептиды, меченые по С-концу независимо от их аминокислотной последовательности. Благодаря ряду преимуществ, таких как относительно несложная химия и сдвиг массы на строго определенную величину, 18О/16О изотопное мечение стало популярным методом в количественной протеомике. Однако из-за слишком малой разницы масс между изотопами (всего 2 или 4 Да) этот подход применяется только в сочетании с масс-спектрометрами сверхвысокого разрешения (R порядка 500000).

Также в первой главе приводится обзор литературы, посвященной методу атомно-силовой микроскопии и методикам совмещения АСМ и масс-спектрометрии для идентификации биомолекул. Описаны концентрационные критерии для возможности совмещения этих методов.

2. Хромато-масс-спектрометрическая методика, разработанная для анализа протеома мочи человека, процедура создания базы данных метода точных массово-временных меток, структура базы и методы поиска и идентификации белков, содержащихся в моче человека, с ее использованием

Процедура анализа протеома мочи человека строилась на стандартном подходе, который используется в протеомике биологических жидкостей и состоящем из следующих этапов: (1) отбор пробы содержащей белки; (2) очистка, концентрирование и предварительное разделение смеси белков; (3) энзиматическое расщепление белков - получение смеси пептидов; (4) хромато-масс-спектрометрический анализ смеси пептидов; (5) поиск и идентификация белков.

Хромато-масс-спектрометрическая методика анализа смеси пептидов была разработана на базе нанопоточного высокоэффективного жидкостного хроматографа (нано-ВЭЖХ) Agilent 1100 (Agilent, США) и масс-спектрометра Finnigan LTQ FT (Thermo Electron, Бремен, Германия). Для соединения нано-ВЭЖХ с масс-спектрометром использовался наноспрейный ионный источник, который был разработан и собран в лаборатории.

Разделение смеси пептидов при помощи нано-ВЭЖХ проводилось методом градиентного элюирования - подвижная фаза В (80% ацетонитрил + 20% вода + 0,1% муравьиной кислоты) изменялась от 3% до 35% в течение 120 минут, скорость потока подвижной фазы была 0,3мкл/мин.

Масс-спектрометрический анализ фракций пептидов осуществлялся при помощи программы Xcalibur (Thermo Electron, Бремен, Германия) в двухстадийном режиме автоматического измерения спектров. На первой стадии в масс-спектрометре ИЦР ПФ измерялись точные массы пептидов в диапазоне m/z 300-1600, с разрешением R=25000 для m/z 400 (число ионов в ячейке ИЦР: 5*106). На второй стадии из ИЦР масс-спектра выбирались три максимальных пика, для которых производилась либо столкновительно индуцированная фрагментация (CID), либо фрагментация, при захвате медленных электронов (ECD). Фрагментация CID и измерение спектров CID фрагментов происходили в линейной квадрупольной ионной ловушке (число ионов: 3*104). Фрагментация ECD и измерение спектров ECD фрагментов осуществлялись в ИЦР-ячейке (число ионов: 5*105). В режиме автоматического двухстадийного анализа пептиды, для которых фрагментация уже была проведена, динамически исключались из исследования на 30 секунд.

Данные хромато-масс-спектрометрического анализа (Рис. 2) обрабатывались с использованием программного обеспечения, разработанного автором. В результате обработки формируется список масс и времен удерживания. Этот список используется для поиска и идентификации белков по базе данных SwissProt при помощи программы Mascot (Matrix Science, London, UK; version 2.0.04).

Рис. 2. Масс-хроматограмма полученная для пробы мочи (вверху). СТАДИЯ 1: измерение ИЦР масс-спектра в момент времени, выделенный на хроматограмме (в центре). СТАДИЯ 2: фрагментация (ECD или CID) ионов, дающих самый интенсивный пик, выделенный в ИЦР масс-спектре, и измерение спектра фрагментов (внизу)

Всего в результате анализа всех исследованых проб мочи было идентифицировано около 820 белков. В одном хромато-масс-спектрометрическом прогоне удается идентифицировать около 120 белков.

Метод точных массово-временных меток (Рис. 3) подразумевает создание базы данных точных массово-временных меток и использование этой базы для поиска и идентификации белков в хромато-масс-спектрометрических экспериментах - без применения методов фрагментации. Эта идеология была использована для анализа проб мочи человека. На первой стадии производился хромато-масс-спектрометрический анализ для предварительной идентификации пептидов, содержащихся в пробе.

Рис. 3. Блок-схема алгоритма формирования и использования базы данных точных массово-временных меток

спектрометрия атомный массовый белок

Из списка идентифицированных пептидов формировалась база данных (Рис. 4), содержащая массы (рассчитанные по идентифицированной аминокислотной последовательности) и соответствующие (измеренные) времена удерживания пептидов в хроматографической колонке.

Рис. 4. Структура базы данных точных массово-временных меток

В результате формировалась база данных точных массово-временных меток, которая может использоваться для поиска и идентификации белков из мочи человека по точной массе пептидов (Рис. 5), входящих в состав белка, и временам удерживания пептидов в хроматографической колонке.

Рис. 5. Последовательность действий по наполнению и использованию базы точных массово-временных меток

Эта база данных точных массово-временных меток позволяет быстро идентифицировать большое количество белков во всех последующих хромато-масс-спектрометрических экспериментах.

3. Метод и результаты серии тестовых экспериментов

В самом начале использования этого метода протеолитическое расщепление белков проводилось нами в присутствии H218O. Со временем была разработана оптимизированная процедура, в соответствии с которой протеолиз проводился в обычной воде, а после лиофилизации смесь пептидов растворялась в буфере в H218O. При этом в присутствии трипсина два атома 16О на С-конце пептида замещаются двумя атомами 18О. Условия для каждого из этапов в таком процессе могут быть оптимизированы независимо друг от друга.

При использовании мечения 18О важным аспектом обработки результатов является коррекция интенсивностей пиков при наложении углеродных изотопных распределений. Для этого мы применили модифицированную концепцию виртуальной аминокислоты “аверагин” (см. ниже).

Файл масс-хроматограммы, полученной без использования тандемной масс-спектрометрии на приборе ионного циклотронного резонанса, обрабатывали программой Decon2ls для выделения моноизотопных однозарядных ионов пептидов и определения их масс и времен удерживания в хроматографической колонке с учетом пиков пептидов, меченных кислородным изотопом 18O.

После обработки спектров проводили нормировку значений времени удерживания по массам пептидов.

Далее проводили два цикла поиска по базе точных массово-временных меток: стандартный поиск и поиск по базе с массами, сдвинутыми на 4 Да (удвоенная разница масс между 18O и 16O). Под стандартным поиском подразумевается поиск в AMT-базе по сочетанию нормированного времени удерживания и массы пептида в хроматограмме без использования тандемной масс-спектрометрии (точность по массам составила 10 миллионных долей, а по значениям времени удерживания - 2% от длительности хроматограммы).

Поскольку эффективность ионизации и времена удерживания на обращенно-фазовой хроматографической колонке меченого и немеченого пептидов одинаковы, то возможно произвести сопоставление обоих результатов поиска по времени удерживания и аминокислотной последовательности пептида: по результатам поиска выбирают те пептиды, которые имеют одну и ту же последовательность (идентифицированную по AMT-базе) и одинаковое время удерживания на хроматографической колонке. Малая разница по массам (порядка 2 или 4 Да) между одно- и двукратно меченным и немеченым пептидами создает сложность корректной оценки интенсивностей: изотопные распределения немеченого и одно- и двукратно меченных пептидов накладываются, то есть видимая интенсивность в спектре не соответствует реальной интенсивности моноизотопных пиков одно- и двукратно меченных пептидов.

Для решения этой проблемы была разработана процедура коррекции, основанная на использовании теоретической аминокислоты «аверагин», элементный состав которой соответствует усредненному элементному составу всего множества белков в протеоме человека (альтернативным является подход, в котором для каждого пептида в базе точных массовых меток-времен удерживания имеется запись, содержащая информацию о распределении интенсивностей пиков изотопных модификаций в масс-спектрах). В принятой нами процедуре для каждого пептида, точнее, его массы, записывается аминокислотная последовательность, состоящая только из аверагинов (C4,9384H7,7583N1,3577O1,4773S0,0417), то есть приблизительный элементный состав соединения (пептида). По элементному составу можно построить теоретический масс-спектр получаемого соединения. В расчете учитываются атомы углерода, азота, кислорода и серы. Моделируются спектры, соответствующие трем пептидам (немеченому и двум меченым), за единицу принимают интенсивность моноизотопного пика немеченого пептида, и последовательно из интенсивности моноизотопного пика однократно меченого пептида вычитали интенсивность пика немеченого пептида, содержащего два углерода 13C, а затем также вычитали интенсивность однократно меченного пептида, содержащего два углерода 13C, из интенсивности моноизотопного пика двукратно меченного.

Следующая формула описывает корректировку интенсивности пика однократно меченного пептида за счет вычитания из его интенсивности значения интенсивности пика, соответствующего пептиду, содержащему два углерода 13C:

где ab0, ab2 - интенсивности пиков немеченого и меченого пептидов, mw - молекулярная масса пептида, ab2_vis - видимая интенсивность моноизотопного пика однократно меченного пептида; 111,1237 - молекулярная масса аминокислоты аверагин, 4,9384; 1,35774 1,4773 - количество атомов углерода, азота, кислорода в одной аминокислоте аверагин (2,97 и 5,5 - коэффициенты, показывающие, во сколько раз в природе ниже содержание изотопа 15N и 18O, чем 13C).

Аналогичным образом осуществлялась коррекция интенсивностей пиков для двукратно меченных пептидов.

Для иллюстрации принципиальной работоспособности метода, т.е. для определения ошибок метода, диапазона применимости, закономерностей систематического нестопроцентного мечения, был проведен модельный эксперимент на контрольном образце, в рамках которого были определены ошибки метода и диапазон применимости, проведена статистическая обработка для определения зависимостей систематического недомечения.

В модельном эксперименте исследовалась смесь двух образцов, один из которых был помечен в присутствии трипсина кислородом-18.

В каждом из трех экспериментов было идентифировано более 150 пептидов. После чего для любых двух различных, случайно выбранных и идентичных по условиям экспериментов, пептидов было рассчитано отношение интенсивностей пиков, соответствующих немеченым и меченым пептидам. Результаты этого модельного эксперимента продемонстрировали высокую воспроизводимость и низкую ошибку (см. Рис.6-7).

Среднее отклонение от единицы (пропорции смешивания меченого и немеченого образцов) составило порядка 4,5% (см. рис. 6-7). Эта величина определяет погрешность разработанного метода.

Также в ходе статистической обработки экспериментов было выявлено отсутствие зависимости между степенью мечения и длиной пептида (продукта белкового гидролиза ферментом трипсином), степенью мечения и кислотностью N-концевой аминокислоты (в обоих случаях не выявлено никакой связи этих двух параметров пептидов со степенью мечения; коэффициенты корреляции в обоих случаях около нуля).

Рис. 6. Степень мечения пептидов в двух идентичных LC-MS-экспериментах (на каждой оси - отношение немеченого к меченому после корректировки; точка - один и тот же пептид в обоих экспериментах), минимальное и максимальное значения по осям: -1.0 до 3.0, соответственно

Рис. 7. Степень мечения пептидов в двух идентичных LC-MS-экспериментах (на каждой оси - отношение немеченого к меченому после корректировки; точка - один и тот же пептид в обоих экспериментах), минимальное и максимальное значения по осям: 0.8 до 1.2, соответственно

4. Описание подхода к совмещению атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии с целью идентификации белков при сверхмалых концентрациях

Это исследование было выполнено в процессе поиска методов обнаружения и идентификации белков в растворах при концентрациях, при которых их не удается обнаружить стандартными методами хромато-масс-спектрометрии.

Нами был опробован подход последовательного применения методов атомно-силовой микроскопии (АСМ) и масс-спектрометрии. Кремниевую пластину с иммобилизованным на ее поверхности антителом погружали в раствор, содержащий исследуемый белок, который антитело захватывало. АСМ использовался для обнаружения образующихся на поверхности комплексов белок-антитело, а масс-спектрометрия использовалась для идентификации белка, для чего белок удалялся с поверхности, проводился гидролиз ферментом трипсин с последующим концентрированием образца; и измерялись масс-спектры на времяпролетном приборе при ионизации методом десорбции и ионизации из матрицы.

Задачей исследования являлось снижение порога обнаружения белковых молекул, до концентраций порядка 10-12M (стандартные методы LC-MS позволяют добиться чувствительности в ~10-9M). При этом требуется обеспечить высокую эффективность гидролиза при сравнительно низкой концентрации белка.

Десорбирование белковых молекул для их последующего гидролиза и идентификации методами масс-спектрометрического анализа осуществлялся путем ультразвукового воздействия, в ходе которого белки отсоединяются от поверхности и переходят в жидкую фазу. Это отличает предложенный способ от других методов, где ультразвуковое воздействие используется для повышения скорости гидролиза.

В результате экспериментов была продемонстрирована возможность идентификации белка BSA (бычьего сывороточного альбумина) при концентрациях ~10-12M, что позволяет сделать вывод о возможности снижения порога детектирования и идентификации белков при применении методов АСМ в сочетании с масс-спектрометрией.

Заключение

1. Создана база данных точных массово-временных меток пептидов протеома мочи человека, которая содержит более 3000 записей для триптических пептидов. База содержит 39 впервые обнаруженных в моче человека генных продуктов.

2. Продемонстрирована возможность использования базы данных для быстрого поиска и идентификации белков без применения методов фрагментации - идентификация производится по точной массе пептидов и временам их удерживания в хроматографической колонке.

3. Разработана процедура количественного анализа содержания белков в физиологических жидкостях человека на основе методов точной массово-временной метки, изотопного мечения кислородом-18 и гипотетической аминокислоты «аверагин» (для коррекции накладывающихся углеродных изотопных распределений).

4. Разработана процедура масс-спектрометрической идентификации белков, обнаруженных методом атомно-силовой микроскопии, которая в перспективе позволит понизить порог обнаружения низкокопийных белков.

Литература

1. Dmitry Avtonomov, Ilya Agron, Eugene Nikolaev. A New Approach to Deisotoping of Complex Isotopically Resolved Spectra. 58th Amer. Soc. Mass Spectrom. Annual Conf. on Mass Spectrometry & Allied Topics, Salt Lake City, UT, USA, 2010.

2. Ilya A. Agron, Dmitriy M. Avtonomov, Eugene Nikolaev. Implementation of 18O labelling for urine proteome quantification using accurate mass tag retention time data base. 58th Amer. Soc. Mass Spectrom. Annual Conf. on Mass Spectrometry & Allied Topics, Salt Lake City, UT, USA, 2010.

3. Ilya A Agron, Dmitriy M. Avtonomov, Eugene Nikolaev. Approach for Isotopic Distribution Deconvolution in Mass Spectra of Peptide Compounds. 8th Annual World Congress of Human Proteome Organization, Toronto, Canada, September 26-30, 2009.

4. A Bugrova, T Shevchenko, A Kononikhin, A Zhiryakova, I Popov, N Khristenko, I Agron, D Avtonomov, G Kalamkarov, E Nikolaev. Development of the Platform for Comparative Analysis of the Tear Proteome based on the AMT Approach. 8th Annual World Congress of Human Proteome Organization, Toronto, Canada, September 26-30, 2009.

5. Dmitriy M. Avtonomov, Ilya A. Agron, Eugene N. Nikolaev. On the usage of information about the number of carbon atoms in peptides for protein identification. 57th Amer. Soc. Mass Spectrom. Annual Conf. on Mass Spectrometry & Allied Topics, Philadelphia, PA, USA, June, 2009.

6. E. Nikolaev, A. Kononikhin, V. Zgoda, S. Moshkovskiy, O. Harybin, I. Popov, D.Avtonomov, I. Agron, V. Kurova, O. Demina, S. Varfolomeev. Development and usage of accurate mass and time tag approach in mass spectrometry for chromato-mass-spectrometric analysis of urinary proteome. Fundamental Sciences - Medicine. Conference materials, Moscow.: «Slovo», p. 168-169, 2006.

7. Avtonomov DM, Popov IA, Kononikhin AS, Agron IA, Moshkovskiy SA, Larina IM, Zamulaeva IA, Varfolomeev SB, Archakov AI, Nikolaev EN. Creation of an accurate mass and time tags database for human urinary proteome and retention time normalization inside it. 3rd international school-conference “Mass spectrometry in chemical physics, biophysics and ecology”, Zvenigorod (Moscow region), Russia, October 2010.

8. Evgenij N Nikolaev, IA Popov, AS Kononikhin, IA Agron, DM Avtonomov, SA Moshkovsky, IM Larina, IA Zamulaeva, C Masselon, AI Archakov. Accurate Mass Tag Retention Time Database for Urine Proteome. 8th Annual World Congress of Human Proteome Organization, Toronto, Canada, September 26-30, 2009.

9. D.M. Avtonomov, I.A. Agron, A.S. Kononikhin, I.A. Popov, E.N. Nikolaev. “A New Method for Normalization of the Peptide Retention Times in Chromatographic/Mass Spectrometric Experiments”. Bioorganic chemistry (Moscow), 2011, Vol. 37, No. 2, pp. 146-150.

10. I.A. Agron, D. Avtonomov, A.S. Kononikhin, I.A. Popov, S.A. Moshkovskii, E.N. Nikolaev. “Accurate Mass Tag Retention Time Database for Urine Proteome Analysis by Chromatography-Mass Spectrometry”. Biochemistry (Moscow), 2010, Vol. 75, No. 5, pp. 636-641.

11. Avtonomov D.M., Agron I.A., Kononikhin A.S., Nikolaev E.N. “Creation of Accurate Mass and Time tags database for quantitative and qualitative approaches in human urinary proteome research utilizing isotopic labeling”. Trudy MFTI, No.1, 2009.

12. И.А. Агрон, Д.М. Автономов, А.С. Кононихин, И.А. Попов, С.А. Мельник, С.А. Мошковский, Е.Н. Николаев «Комбинация подходов точной массово-временной метки и мечения изотопом кислорода 18O для количественного анализа протеома мочи человека» ТРУДЫ МФТИ. 2011. Том 3, № 3, страницы 3-10.

13. Патент #2419796 (заявка №2009144132 от 30.09.09), Способ проведения ферментативного гидролиза белков, иммобилизованных на подложке сканирующего микроскопа, авторы: И.А. Агрон, МФТИ (ГУ).

Размещено на Allbest.ru