Стабильность препарата иммобилизованной инулазы при эксплуатации в реакторе периодического действия

Размещено на http://www.allbest.ru/

Стабильность препарата иммобилизованной инулазы при эксплуатации в реакторе периодического действия

Кожокина О.М.

Аннотация

С помощью модифицированного глутаральдегидного метода осуществлена иммобилизация инулазы из Aspergillus awamori на анионите АВ-26. Выявлено, что эксплуатация препарата в течение 2 лет в реакторе периодического действия сопровождается увеличением его активности на ~30%. Через 3 года активность фермента снижается на ~40%; спустя 4 года применения приближается к нулю.

Ключевые слова: иммобилизованная инулаза, анионит, реактор периодического действия.

Актуальность проблемы. Изучение особенностей протекания реакции гидролиза инулина при различных технологических режимах, исследование возможностей длительного использования иммобилизованных ферментов и выявление происходящих при этом изменений в состоянии макромолекул катализатора приобретают в настоящее время особую значимость для разработок новых промышленных линий получения фруктозы [1]. Фруктоза необходима для производства продуктов диетического питания для больных сахарным диабетом, а также с целью профилактики данного заболевания.

Результаты исследований. Известно, что химические методы иммобилизации имеют ряд преимуществ перед адсорбционными. Они способствуют повышению устойчивости фермента к денатурации, обеспечивая стабильную связь, позволяющую эксплуатировать катализатор в течение длительного времени [2]. В качестве носителей удобно использовать ионообменные смолы, так как они полностью соответствуют требованиям безопасности.

С помощью модифицированного глутаральдегидного метода была осуществлена иммобилизация инулазы (2,1-в-D-фруктанфруктаногидролазы, КФ 3.2.1.7) из Aspergillus awamori BKMF 2250 на ионообменной смоле АВ-26. гидролиз инулин макромолекула

Показано, что ковалентно связанный с ионитом фермент сохраняет 78% от активности свободной инулазы; содержание белка составляет 2,2 мг/г препарата.

При ковалентной иммобилизации на анионите происходит фиксация третичной структуры путем взаимодействия между активными группами носителя и фермента, что сопровождается повышением жесткости третичной структуры.

С помощью метода ИК-спектроскопии показано, что спектр иммобилизованной инулазы характеризуется наличием полосы поглощения в области амид II с максимумом при 1510 см-1.это может свидетельствовать о том, что процесс иммобилизации осуществляется за счет амидных групп концевых и основных аминокислот молекулы фермента.

При образовании комплекса инулаза-анионит происходит сужение полосы поглощения при 3200-3493 см-1, которое характерно колебаниям аминогрупп ионообменника АВ-26.

Смещение полосы поглощения в области 1621-1650 см-1 показывает, что происходит растяжение С=О связи при модификации носителя с глутаровымдиальдегидом. Вклад в деформацию связи С=О также вносит образование ковалентной связи между амидными группами фермента и альдегидными группировками модифицированного носителя, о чем свидетельствуют деформационные изменения связи N-H в области 3290-3300 см-1.

Также имеет место поглощение при 1612 см-1 и 1560 см-1, которые характеризуют деформационные колебания NH-групп в имидазольном цикле и СОО-групп в радикалах глутаминовой и аспарагиновой кислот.

Анализ содержания типов вторичной структуры указывает на повышение упорядоченности структуры иммобилизованной инулазы. Обнаружено, что протяженность нерегулярных участков уменьшается в 2 раза, в 3 раза увеличивается длина в-слоев, а количество б-спиралей становится в 2 раза меньше.

Таким образом установлено, что иммобилизация инулазы на анионите АВ-26 способствует стабилизации ферментного препарата. Это позволяет предположить возможность длительного использования для осуществления реакции гидролиза инулина.

Показано, что эксплуатация препарата иммобилизованной инулазы в течение 2 лет в реакторе периодического действия (лабораторные условия) c целью гидролиза инулина до фруктозы сопровождается увеличением каталитической активности фермента на ?30%. Вероятно, наблюдаемый эффект обусловлен ослаблением диффузионных затруднений доступа молекул субстрата к функциональным группам активного центра инулазы, что связано с частичным разрушением структуры носителя, изменением степени пористости ионита.

После 3 лет эксплуатации в реакторе периодического действия активность иммобилизованной инулазы снизилась на ?40% от исходной, после 4 лет использования препарат характеризовался наличием остаточной биокаталитической способности. Очевидно, происходит практически полный разрыв ковалентных связей между молекулами фермента и матрицей носителя, т.е. разрушение иммобилизованного препарата как такового.

Вывод

Иммобилизация инулазы модифицированным глутаральдегидным методом позволяет использовать ферментный препарат в реакторе периодического действия многократно; срок хранения препарата - 3 года.

Список литературы

1. Шкутина И.В. Гидролиз инулина с помощью гетерогенных биокатализаторов / И.В. Шкутина, О.Ф. Стоянова, В.Ф. Селеменев // Химия растительного сырья. - 2012. - № 2. - С. 27-31.

2. Шкутина И.В. Влияние ионной формы полиамфолита АНКБ-2 на иммобилизацию ферментов / И.В. Шкутина, О.Ф. Стоянова, В.В. Лунина // Сорбционые и хроматографические процессы. - 2009. - Т.9, вып. 2. - С. 247-253.

Размещено на Allbest.ru