Научная новизна

Практическая значимость

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на конференциях и конгрессах различного уровня: межвузовской научно-практической конференции «Вузы и регион» (Пермь, 2003), Российской научно-практической конференции «Рациональное использование лекарств» (Пермь, 2004), Всероссийской научно-практической конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции», (Пятигорск, 2005), XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва,2007), международной научно-практической конференции «Здоровье и образование», (Палермо - Пермь, 2007), региональной конференции молодых ученых с международным участием «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии» (Екатеринбург-Пермь, 2007), российской научно-практической конференции, посвященной 70-летию ПГФА «Достижения и перспективы в области создания новых лекарственных средств» (Пермь, 2007), международной конференции «Техническая химия. От теории к практике» (Пермь, 2008), научно-практической конференции «Современное состояние и пути оптимизации лекарственного обеспечения населения» (Пермь, 2008).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 12 на-учных работ: 1 статья в издании, рекомендуемом ВАК, 6 статей и 5 тезисов докладов конференций различного уровня. Подана 1 заявка на выдачу патента РФ.

Исследована противомикробная активность (ПМА) 270 соединений, синтезированных сотрудниками ПГФА на кафедрах органической химии, физической и коллоидной химии, фармацевтической химии очного факультета; в лаборатории медицинской химии Научно-образовательного центра ПГФА, в лаборатории «Окислительного катализа в расплавленных электролитах» Института технической химии УрО РАН, г. Пермь.

Изучение бактериостатического действия по отношению к тест-штаммам микроорганизмов проведено стандартным методом серийных разведений в жидкой питательной среде. Критерием отбора соединений для углублённого изучения являются значения минимальных подавляющих концентраций (МПК) ис-пользуемых в настоящее время и аналогичных по антимикробному эффекту препа-ратов. В качестве препаратов сравнения использованы диоксидин, хлоргексидин, флуконазол.

Таблица 1 Результаты скрининга противомикробной активности соединений

Таблица 2 Противомикробная активность и величина дипольного момента производных амидов 5-бром(йод)антраниловой кислоты

* - расчеты не проводили

Квантово-химический расчет молекул в данном ряду показывает, что ПМА проявляется только для соединений 1б, 1д, 1ж, углы отклонения плоскости моле-кулы которых мало отличаются от 180°. Приведенные в таблице 2 результаты расчета показывают, что с возрастанием дипольного момента с 4,725 Д до 7,785 Д противомикробное действие усиливается в 64 раза. антраниловый микроорганизм азотсодержащий

Среди 2-ариламино-1,4-диарил-2-бутен-1,4-дионов нами установлено, что существенное влияние на проявление ПМА оказывает сочетание п-толильных заместителей в 1-м и 4-м положениях молекулы с 2,4-дихлорфенильным радикалом во 2-м положении (соединение 2ё) (таблица 3).

Таблица 3 Противомикробная активность 2-ариламино-1,4-диарил-2-бутен-1,4-дионов

Среди производных ацилпировиноградных кислот наибольшее количество активных соединений выявлено в рядах енаминопроизводных АПК и их амидов (таблица 1).

Результаты проведенных нами исследований (таблица 4) показывают, что на проявление ПМА в ряду енаминопроизводных АПК влияет заместитель в енаминогруппе: наличие тимольного радикала приводит к увеличению активности по отношению к тест-штаммам от 32 до 128 раз (соединения 4ё-л). Среди енгидразинопроизводных арилпировиноградных кислот наиболее активны соеди-нения 5р и 5с, содержащие в енгидразинной группе о-гидроксифенилкарбонильный фрагмент.

Таблица 4 Противомикробная активность и величина дипольного момента енамино- и енгидразинопроизводных ацилпировиноградных кислот

* - расчеты не проводили

Квантово-химический расчет соединений 4в, 4ё, 4ж, 5с, 5ц обнаружил неплоское строение молекул. Однако прослеживается аналогичная производным 5-галогенантраниловой кислоты зависимость активности от величины дипольного момента: наиболее активно соединение 4ё, для которого дипольный момент равен 6,950 Д (таблица 4).

Впервые проведенные исследования ПМА в ряду метиловых эфиров 4-арил-2-ариламино-4-оксо-2-бутеновых кислот (таблица 5) выявили одно соединение (6а), обладающее бактериостатическим действием по отношению к S. aureus, E. сoli на уровне диоксидина, что обусловлено сочетанием двух фенильных радикалов во 2-м и 4-м положениях молекулы. Наблюдается уменьшение активности в 2 раза соединений 6е, 6з, имеющих в енаминогруппе 4-хлор(фтор)фенильный радикал. Замена арильного заместителя R¹ на гетерильный (6п, 6р) не влияет на проявление активности.

Таблица 5 Противомикробная активность и величина дипольного момента енаминопроизводных метиловых эфиров ацилпировиноградных кислот

* - расчеты не проводили

Данные квантово-химического расчета молекул в ряду метиловых эфиров 4-арил-2-ариламино-4-оксо-2-бутеновых кислот свидетельствуют, что соединения, имеющие плоское строение, малоактивны (6р, 6ш), а соединения, в которых плоскости ароматических колец расположены под некоторым углом (6а, 6е), проявляют более высокую ПМА. При этом с увеличением дипольного момента с 3,700 Д до 5,531 Д, соответственно, ПМА усиливается в 2 раза (таблица 5).

Среди комплексных солей гетериламидов АПК с ионами металлов установлено влияние на рост тест-штаммов S. аureus и E. сoli хелатов магния и марганца (II), которые обладают бактериостатическим действием на уровне диоксидина. Как следует из таблицы 6, проявлению ПМА способствует наличие тиазольного цикла в амидной группе молекул соединений 7а-7г. Полученные нами результаты согласуются с выявленной ранее и описанной в литературе связью ПМА металлохелатов гетериламидов АПК с характером гетероцикла.

Таблица 6 Противомикробная активность хелатных солей гетериламидов ацилпировиноградных кислот с ионами металлов

Представленные в таблице 7 данные по скринингу производных енамино-амидов 4-арил-2-енамино-4-оксо-2-бутеновых кислот (соединения 8аб-8аё) пока-зывают, что исследованные вещества превосходят по активности препарат сравнения. Установлено, что бактериостатическое действие указанных соединений обусловлено наличием N,N-диэтиламиноэтильного заместителя в енаминогруппе и фрагментов тимола, 2,6-ксилидина, мезитилена в амидном звене молекулы АПК (соединения 8аг-8аё), что, в свою очередь, делает их более активными, чем опи-санные ранее ариламиды бензоилпировиноградной кислоты. Нами впервые изучена противомикробная активность замещенных амидов 2-(2ґ(4)-бром(хлор)фенилами-но)-5,5-диметил-4-оксо-2-гексеновых кислот. Обнаружено, что бактериостатиче-ское действие зависит от природы галогена в фениламиногруппе во 2-м положении углеродной цепи: более выраженную ПМА имеют соединения 8ы, 8ю с 2,4-ди-хлорфенильным радикалом в отличие от 2- и 4(2,4)-бром(дибром)фениламино-производных (8б, 8л, 8н, 8т, 8у).

Таблица 7 Противомикробная активность и величина дипольного момента енаминопроизводных амидов ацилпировиноградных кислот

* - расчеты не проводили

Квантово-химический расчет молекул в ряду енаминопроизводных амидов АПК показывает неплоское строение молекул соединений 8б-8ад. Наиболее активно вещество 8ад, имеющее дипольный момент 14,120 Д и в пространственном строении угол между кольцами заместителей R¹ и R² в пределах 120° (таблица 7). В случае енаминопроизводных амидов АПК, имеющих третичный бутильный ради-кал в 4-м положении молекулы (8б, 8т, 8ы, 8я), картина меняется на противоположную: противомикробная активность усиливается при уменьшении величины дипольного момента молекул соответственно от 7,419 Д до 5,717 Д. Вероятно, такая зависимость обусловлена разными механизмами бактериостатического действия на стенку микробной клетки ароматических и трет-бутильных енамино-производных амидов АПК.

Таким образом, результаты скрининговых исследований среди производных ацилпировиноградных кислот показывают, что наиболее активными по отношению к тест-штаммам S. aureus, E. сoli являются амиды 4-арил-2-енамино-4-оксо-2-бутеновых кислот, не уступающие активности препарата сравнения - диоксидина. Противомикробное действие исследовавнных соединений обусловлено наличием N,N-диэтиламиноэтильного заместителя в енаминогруппе и фрагментов тимола, 2,6-ксилидина, мезитилена в амидном звене молекулы. Превосходит действие диоксидина в отношении обоих тест-штаммов и 5,5-диметил-2-[N-(4'-гидрокси-2'-изопропил-5'-метилфенил)амино]-4-оксо-2-гексеновая кислота. По-видимому, ме-тильные группы, расположенные в заместителях при С₂ и С₄ атомах молекулы и в амидном звене 4-арил-2-енамино-4-оксо-2-бутеновых кислот, и образование внут-римолекулярной водородной связи между атомом водорода аминогруппы и атомом кислорода оксогруппы в 4-м положении молекулы способствуют более прочному взаимодействию функциональных групп данных соединений со стенкой микроб-ной клетки. Полученные нами результаты в целом согласуются с проведенными ранее исследованиями и свидетельствуют о перспективности поиска противомикробных соединений среди производных ацилпировиноградных кислот.

В группе гетероциклических соединений с одним атомом азота производные 1-, 4-, 5-замещенных 3-гидрокси-3-пиррол-2-онов обладают слабым бактериостатическим действием. Соединения, проявляющие выраженную ПМА, содержат ряды моно- и дикватернизованных производных 1,2-ди-3(4)-пиридилэтанов и 1,2-ди-3(4)-пиридилэтиленов (таблица 1). Результаты скрининговых исследований в дан-ных рядах представлены в таблице 8.

цис-форма

Таблица 8 Противомикробная активность кватернизованных производных 1,2-ди-3(4)-пиридилэтанов и 1,2-ди-3(4)-пиридилэтиленов

Обнаружено, что природа аниона солей не влияет на проявление ПМА. Монокватернизованные производные 1,2-ди-3(4)-пиридилэтанов(этиленов) в боль-шей степени угнетают рост тест-штаммов, чем дикватернизованные. Повышает активность наличие двойной связи в мостике, соединяющем пиридиновые циклы: наиболее активны 1,2-ди-3(4)-пиридилэтилены (13д-13ж). Кроме того, бактерио-статическое действие зависит от длины углеродной цепи алкильного радикала у атома азота: максимальную активность проявляют соединения, содержащие 12-16 атомов углерода в радикале (13а, 13д, 13ё, 13ж), что согласуется с результатами проведенных ранее исследований в рядах моно- и бисчетвертичных аммониевых солей. Таким образом, кватернизация одного пиридинового цикла алкильным заместителем, повышающим липофильность молекулы, способствует усилению противомикробного действия в отличие от описанных 2,4,6-замещенных фениль-ным радикалом солей N-Nґ-алкиленбиспиридиния.

Среди гетероциклических соединений с двумя гетероатомами ряды произ-водных 3-замещенных 3,4-дигидро-2Н-1,4-бензоксазин-2-онов и 3,4-дигидро-2Н-1,4-бензотиазин-2-онов содержат соединения, обладающие выраженным бакте-риостатическим действием (таблица 1). Как показывают приведенные в таблице 9 данные наших исследований, в ряду 3-замещенных 3,4-дигидро-2Н-1,4-бензок-сазин-2-онов проявлению ПМА способствует наличие объемного б-нафтильного фрагмента в 3-ем положении бензоксазинового цикла в отличие от менее активных 6-этилсульфонил-3-ацилметилен- и 3-ароилметилен-3,4-дигидро-2Н-1,4-бензокса-зин-2-онов, изученных и описанных ранее. Присутствие электроноакцепторной нитрогруппы в положениях 5 или 6 бензоксазина (соединения 16д-е) приводит к снижению бактериостатического действия. Уменьшение активности происходит при наличии в ацильном фрагменте бензоксазина арильного радикала (16б, 16в) или тиенильного и фурильного циклов (16ё, ж).

Представленные в таблице 9 результаты скрининга среди 3,4-дигидро-2Н-1,4-бензотиазин-2-онов выявили соединения 17а-б, 17д, угнетающие рост S. аureus на уровне диоксидина. Установлено, что наиболее активны соединения, имеющие фурильный (17д) и м-замещенный фенильный радикалы в положении 3 цикла бензотиазина (17а-б).

По результатам квантово-химического расчета молекул для 3-замещен-ных 3,4-дигидро-2Н-1,4-бензоксазин-2-онов сохраняется выявленная в других ря-дах соединений закономерность. Как видно из таблицы 9, для сравнимых по строению соединений 16б и 16в, 16д и 16е возрастание дипольного момента от 6,666 Д до 8,296 Д и от 3,732 Д до 6,710 Д соответственно приводит к усилению активности. Некоторое отличие соединения 16г объясняется отсутствием нитро-группы, положение которой существенно влияет на проявление действия. Однако, если сравнивать 16г и 16е, то связь ПМА с дипольным моментом молекул аналогична.

16б-ж 17а-д

Таблица 9 Противомикробная активность и величина дипольного момента производных 3,4-дигидро-2Н-1,4-бензоксазин-2-онов и 3,4-дигидро-2Н-1,4-бензотиазин-2-онов

* - расчеты не проводили

В ряду производных 5-гетерилэтилпирроло[3,4-с]пиразола нами выявлено, что бактериостатическое действие указанных производных зависит от характера гетероцикла при атоме азота пиррольного кольца (таблица 10). Соединения 18а, 18в, содержащие 2-морфолилэтильный фрагмент, задерживают рост обоих тест-штаммов в концентрации 1000-125 мкг/мл. Замена морфолинового цикла на индольный, реализованная в структуре 18г, приводит к усилению ПМА по отношению к S. aureus и E. coli в 16 раз.

Таблица 10 Противомикробная активность и величина дипольного момента производных 5-гетерилэтилпирроло[3,4-с]пиразола

Проведенный квантово-химический расчет молекул соединений 18а, 18в, 18г показывает, что при увеличении дипольного момента с 6,180 Д до 15,080 Д бактериостатическое действие усиливается (таблица 10).

Таким образом, изучение качественной зависимости противомикробной активности соединений от их химической структуры позволило выявить следующие закономерности. Установлено, что в ряду замещенных амидов 4-арил-2-алкилами-но-4-оксо-2-бутеновых кислот значительное влияние на проявляемое действие оказывает сочетание диэтиламиноэтильного радикала в енаминогруппе и ароматических заместителей в амидном звене молекулы. В ряду ква-тернизованных 1,2-ди-3(4)-пиридилэтиленов противомикробная активность обусловлена одним ониевым центром в молекуле и определенным соотношением липо-фильных и липофобных частей их структуры. В ряду производных 3,4-дигидро-2Н-1,4-бензоксазин-2-онов наиболее выраженному проявлению бактериостатического действия способствует наличие в 3-ем положении бензоксазинового цикла объемного б-нафтильного фрагмента.

Структура активных соединений представлена ниже.

2ё 4ё 8 аг, ад, ае, аё

R¹=Cl (8aг, 8aд, 8aё), СН₃ (8ае)

R²= 2,6-(СН₃)₂С₆Н₃ (8aг), 2,4,6-(СН₃)₃С₆Н₂ (8aд), 4-НО-2-i-С₃Н₇-5-СН₃С₆Н₂ (8aе, 8aё)

13д, 13ж 16г

Анализ противомикробной активности исследованных соединений в рядах амидов 5-галогенантраниловой кислоты, эфиров и амидов АПК, гетероциклических азотсодержащих соединений и величин дипольных моментов молекул показывает, что между ними имеется зависимость: с увеличением дипольного момента молекулы бактериостатическое действие изученных соединений усиливается, а для енаминопроизводных амидов ацилпировиноградных кислот, имеющих третичный бутильный радикал в 4-м положении молекулы, активность снижается. Установлено, что влияние дипольного момента молекул исследованных соединений на величину lg 1/МПК не имеет строго линейного характера. В целом, результаты наших исследований согласуются с данными других авторов о влиянии дипольного момента молекул химических веществ на их фармакологическую активность.

Исследования противомикробного действия активных соединений

Широта спектра противомикробного действия изучена по отношению к пяти музейным штаммам: S. epidermidis АТСС 14990, B. subtilis АТСС 6633, B. cereus АТСС 8035, P. aeruginosa АТСС 9027, C. albicans АТСС 24433 коллекции Всероссийского музея патогенных микроорганизмов. Как следует из полученных результатов, представленных в таблице 11, более чувствительны к действию изученных соединений грамположительные микроорганизмы. Нами установлено, что наиболее активными в отношении грамположительных неспорообразующих бактерий являются: по отношению к S. aureus - все соединения (МПК составляет 0,5-7,8 мкг/мл); по отношению к S. epidermidis соответственно - 4ё, 8ад, 8ае, 13д, 13ж (МПК находится в диапазоне 2,0-7,8 мкг/мл). Тормозят рост грамположительных спорообразующих бактерий при МПК от 2,0 до 7,8 мкг/мл следующие субстанции: по отношению к B. cereus - 13д (МПК = 2,0-3,9 мкг/мл), 4ё, 8аё и 13ж (МПК составляет 3,9-7,8 мкг/мл), 8ад и 8ае (МПК = 7,8-15,6 мкг/мл); по отношению к B. subtilis - 13д (МПК 2,0-3,9 мкг/мл), 4ё (МПК = 3,9-7,8 мкг/мл), 8ад (МПК находится в интервале 7,8-15,6 мкг/мл). Наиболее активны по отношению к грамотрицательному микроорганизму E. coli соединения 13ж (МПК составляет 0,5-2,0 мкг/мл), 2ё (МПК находится в диапазоне 2,0-3,9 мкг/мл), 4ё, 8аё и 13д (МПК составляет 7,8-15,6 мкг/мл). В отношении P. aeruginosa незначительную активность проявляют соединения 8аё, 8ае, 13ж и 16г, что сравнимо с действием диоксидина. Рост C. albicans в концентрации 3,9-7,8 мкг/мл угнетают соединения 13д и 13ж. Более слабым противогрибковым действием обладают соединения 2ё и 8ад.

Таблица 11 Противомикробная активность соединений по отношению к музейным штаммам

^* - Указаны пределы колебаний МПК [Пушкина Т.В., 1995]

^** - Указаны пределы колебаний МПК [Галынкин В.А., 2003]

^***- Указаны пределы колебаний МПК [Rex J.Y, Walsh T.J., 2000]

Таким образом, большинство соединений проявляет высокую активность по отношению к S. aureus, E. сoli и S. epidermidis, не уступая препаратам сравнения. Наиболее выраженным бактериостатическим действием к большинству изученных штаммов микроорганизмов обладают соединения 4ё, 8ад, 13д и 13ж. Соединение 4ё угнетает рост грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов: S. aureus, E. сoli, S. epidermidis, B. сereus, B. subtilis в МПК от 3,9 до 7,8 мкг/мл, что превосходит активность диоксидина. Высокая активность соединения 8ад (енами-ноамид АПК) проявляется в отношении стафилококков (МПК = 3,9-15,6 мкг/мл) и бактерий рода Bacillus (МПК составляет 7,8-15,6 мкг/мл). Соединения 13д и 13ж (монокватернизованные 1,2-ди-3(4)-пиридилэтилены) угнетают рост изучаемых штаммов, за исключением P. aeruginosa (МПК = 1000 мкг/мл), в пределах 0,5-31 мкг/мл, что свидетельствует об их превосходстве над препаратами сравнения. При этом монокватернизованные 1,2-ди-3(4)-пиридилэтилены активны и в отношении штаммов грибов рода Candida в концентрации 3,9-7,8 мкг/мл, что превышает фунгистатическое действие хлоргексидина и флуконазола и подчеркивает перспективность применения данных соединений в качестве биоцидных агентов.

Несомненный интерес представляет оценка противомикробной активности соединений в отношении резистентных штаммов, обладающих большей вирулентностью по сравнению с музейными. Клинические резистентные штаммы предоставлены бактериологической лабораторией ДГКБ №13 г. Екатеринбурга. Нами изучено бактериостатическое действие соединений по отношению к метициллинчувствительным (MS) и метициллинрезистентным (MR) штаммам S. aureus и S. epidermidis, которые устойчивы к действию всех в-лактамных антибиотиков, макролидов, тетрациклинов, линкозамидов, а также по отношению к двум штаммам E.сoli: 1, устойчив к действию цефазолина, гентамицина, тобрамицина, и 2, устойчив к ампициллину, цефотаксиму. Результаты исследований представлены в таблице 12.

Таблица 12 Минимальные подавляющие концентрации соединений по отношению к клиническим штаммам, мкг/мл

Выявлено, что соединения активны по отношению к коагулазоположительным и коагулазоотрицательным стафилококкам. Штаммы грамотрицательных микроорганизмов не чувствительны к действию данных соединений за исключением монокватернизованных 1,2-ди-3(4)-пиридилэтиленов, МПК которых состав-ляет 62-500 мкг/мл. В отношении метициллинчувствительных штаммов S. аureus и S. epidermidis МПК соединений 4ё, 8ад и 8аё находится на уровне средних значений (15,6-62 мкг/мл), а соединений 13д и 13ж - на высоком (3,9 - 7,8 мкг/мл). Соединение 4ё угнетает рост S. epidermidis в концентрации 3,9-7,8 мкг/мл. По отношению к MRSA енаминоамиды АПК (8ад, 8аё) и монокватернизованные 1,2-ди-3(4)-пиридилэтилены (13д и 13ж), как следовало ожидать, менее активны, при этом МПК находится в диапазоне от 15,6 до 62 мкг/мл соответственно. В отношении MR S. еpidermidis МПК, равную 7,8-15,6 мкг/мл, имеют соединения 4ё и 13ж; более слабым бактериостатическим действием обладают соединения 8ад, 8аё, 13д (МПК = 15,6-31 мкг/мл). Таким образом, наибольшее влияние на рост клинических штаммов оказывают монокватернизованные 1,2-ди-3(4)-пиридилэтилены.

В целом, выраженным бактериостатическим действием против большинства изученных штаммов микроорганизмов обладают енаминопроизводные амидов ацилпировиноградных кислот и монокватернизованные 1,2-ди-3(4)-пиридилэтилены, что свидетельствует о перспективности синтеза и поиска противомикробных соединений среди производных указанных рядов. Представители первого, угнетая рост грамположительных микроорганизмов, имеют высокий потенциал возможного использования в качестве средств терапии инфекций, вызванных S. аureus. Соединения второго ряда проявляют одновременно антибактериальную и противогрибковую активность и могут найти применение в медицинской практике в качестве кожных антисептиков или дезинфектантов. Для доклинического исследования можно рекомендовать N-(2ґ,4ґ,6ґ-триметилфенил)амид 2-(в-Nґ,Nґ-ди-этиламиноэтиламино)-4-оксо-4-(4ґ-хлорфенил)-2-бутеновой кислоты (8ад) и хлорид 1-[N-цетил-4-пиридиний]-2-(4ґ-пиридил)этилена (13ж).

Изучение острой токсичности активных соединений

Острая токсичность соединений (LD50) определена на мышах при внутрибрюшинном введении на кафедре физиологии ПГФА. В таблице 13 приведены данные этой серии опытов. Установлено, что соединения 2ё, 4ё, 8аг-8аё имеют LD50 в интервале от 564 мг/кг до >2000 мг/кг, хлорид 1-[N-цетил-3-пири-диний]-2-(3ґ-пиридил)этилена (13д) - 300 мг/кг, а 3-нафтилметилен-3,4-дигидро-1,4-бензоксазин-2-он (16г) - > 5000 мг/кг.

Таблица 13 Острая токсичность активных соединений, мг/кг