Физико химические методы контроля качества аминокислот

Размещено на http://www.allbest.ru/

Федеральное государственное бюджетное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский химико-фармацевтический университет» Министерства здравоохранения Российской федерации

Фармацевтический факультет

Кафедра управления и экономики фармации

КУРСОВАЯ РАБОТА

по теме :

Физико химические методы контроля качества аминокислот

Работу выполнил :

Студентка 5 курса 433 группы

Э.К. Рания

База практики:

аптека Алфидрдаус, Кенитра, ул. Мед 5, 322

Санкт-Петербург 2018 год



Содержание

Введение

1. Оптические методы

1.1Поляриметрия

1.2Спектрофотометрия в УФ-области

1.3Прямая спектрофотометрия в видимой области и фотоколориметрия

1.4ИК-спектроскопия

1.5ЯМР-спектроскопия

1.6Масс-спектрометрический анализ АК

2. Хроматографические методы

2.1 Газожидкостная хроматография (ГЖХ)

2.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

2.3 Ионообменная хроматография

2.4 Тонкослойная хроматография (ТСХ)

Заключение

Список литературы



Введение

Аминокислоты (АК) - это гетерофункциональные органические соединения, в состав молекулы которых входят карбоксильная и аминогруппы. Чаще всего под этим названием подразумевают б-АК вследствие их исключительного значения как составляющей части биополимеров - белков. В природе встречается более 70 АК, почти все они, а исключением пролина и оксипролина, имеют структуру типа RCH(NH₂)CO₂H

АК являются весьма сложным объектом для химического анализа. Это обусловлено, во-первых, наличием в молекулах гидрофобных (неполярные углеводородные фрагменты) и гидрофильных (карбокси-, амино-, гидрокси- и меркапто-) группировок. Во-вторых, амфотерный характер АК за счет наличия в структуре основных и кислотных функций приводит к возникновению в нейтральных растворах АК цвиттер-иона. Поэтому при анализе АК необходимо учитывать величину изоэлектрической точки (рН растворов). И наконец, все природные АК, кроме глицина, ввиду своего хирального строения могут существовать в виде различных энантиомеров.

Современное здравоохранение использует ряд лекарственных средств (ЛС) и препаратов (ЛП), созданных на основе АК и содержащих очищенную сумму АК, пептидов, белков. Аминокислотный анализ является хорошо изученным и в то же время развивающимся разделом современной аналитической химии. Определение АК в продуктах питания, напитках и ЛП имеет большое значение для контроля технологии производства, оценки качества сырья и готовой продукции, выявления фальсификатов. В последнее время актуально определение D-изомеров АК в пищевых продуктах и ЛП. Это связано с тем, что влияние на здоровье человека D-изомеров АК изучено мало, но их небольшие количества могут появляться в пищевых продуктах при термической обработке, а в ЛП - при использовании синтетических АК.

Следует отметить, что в настоящее время единые подходы к определению АК в различных объектах фармацевтического анализа отсутствуют. На основании вышеизложенного актуальной задачей фармации является разработка доступных и удобных методов анализа АК в различных объектах.

Цель работы - сравнительный анализ основных методов контроля качества АК, входящих в состав как комбинированных, так и монокомпонентных ЛП, лекарственного растительного сырья, биологически активных добавок, полипептидов и белков, а также рассмотрение возможности применения нефармакопейных методов для определения АК в объектах фармацевтического назначения.

Особенности физико-химических методов анализа

Физико-химические методы анализа, основаны на зависимости физических свойств вещества от его природы, причем аналитический сигнал представляет собой величину физического свойства, функционально связанную с концентрацией или массой определяемого компонента.

Физико-химические методы приобретают все большее значение для целей объективной идентификации и количественного определения лекарственных веществ. Получивший распространение в различных отраслях недеструктивный анализ (без разрушения анализируемого объекта) играет важную роль и в фармацевтическом анализе. Для его выполнения пригодны многие физико-химические методы, в частности оптические, ЯМР-, ПМР-, УФ- и ИК- спектроскопия, ГЖХ, ВЭЖХ и др.

В фармацевтическом анализе наиболее широко используют физико-химические методы, которые могут быть классифицированы на следующие группы: оптические методы; методы, основанные на поглощении излучения; методы, основанные на испускании излучения; методы, основанные на использовании магнитного поля; электрохимические методы; методы разделения; термические методы.

Большинство перечисленных методов (за исключением оптических, электрохимических и термических) широко применяют для установления химической структуры органических соединений.

Физико-химические методы анализа имеют ряд преимуществ перед классическими химическими методами. Они основаны на использовании как физических, так и химических свойств веществ и в большинстве случаев отличаются экспрессностью, избирательностью, высокой чувствительностью, возможностью унификации и автоматизации.[3]



1 Оптические методы

1.1 Поляриметрия

Все АК, за исключением глицина, оптически активны благодаря хиральному строению. Величина удельного вращения АК в водных и солянокислых растворах (таблица 2) нормируется в частных ФС отечественных и зарубежных фармакопей .

Таблица 2.

Величина удельного вращения некоторых АК в водных и солянокислых растворах[4]

№ п/п	АК	Раствор	Величина удельного вращения, °
1	Аргинин	8% раствор в разв. HCl	От +25,5 до +28,5
2	Аргинина гидрохлорид	8% раствор в разв. HCl	От +21 до +23,5
3	Аспарагина моногидрат	10% раствор в разв. HCl	От +33,7 до +36
4	Глутаминовая кислота	10% раствор в 1 М HCl	От +30,5 до +32,5
5	Лизина ацетат	10% водный раствор	От +8,5 до +10

1.2 Спектрофотометрия в УФ-области

В области видимого спектра растворы протеиногенных АК практически не поглощают, а в УФ-области для ароматических АК (триптофана, фенилаланина, тирозина) можно наблюдать относительно высокое поглощение в диапазоне 240-300 нм. На этом основании разработаны экспресс-методы их количественного определения, отличающиеся простотой. Однако вследствие того, что максимумы светопоглощения этих АК близки, в процессе количественного определения отдельных ароматических АК возможны ошибки анализа. Поэтому в большинстве случаев данный метод анализа является предварительным и требует дополнительного исследования с помощью ВЭЖХ, ГЖХ и аминокислотных анализаторов. Слабое поглощение цистина, которое объясняется наличием дисульфидной группы, обнаруживается при 240 нм. Высокая молярная экстинкция тирозина при 280 нм используется для определения содержания белка в растворах.

В работе описан простой и точный спектрофотометрический метод анализа цистина (примеси цистеина в ЛП), основанный на способности его солянокислых растворов к светопоглощению при длине волны 250 нм. При изучении аналитических возможностей метода установлено, что цистеин в этой области не поглощает и не мешает определению цистина.

Выбор оптимальных условий количественного анализа АК заключается в определении влияния рН, времени установления равновесия при образовании раствора АК в интервале концентрации, в котором соблюдается закон светопоглощения. Спектры поглощения растворов тирозина при разных значениях pH представлены на рисунке 3.

Рисунок 3. Спектры поглощения растворов тирозина при разных значениях pH



1.3 Прямая спектрофотометрия в видимой области и фотоколориметрия

Для анализа АК также широко используют методы, основанные на реакции с нингидрином . Данная реакция впервые была открыта Руманом. Позднее установлено, что нингидрин специфичен к алифатическим или алициклическим первичным аминогруппам. Вторичные, третичные и четвертичные амины, амиды и аминозамещенные ароматические соединения дают слабую реакцию или не дают вовсе.

Исключение - пролин, который образует с нингидрином окраску желтого цвета, как считают некоторые исследователи, благодаря раскрытию цикла.

Под руководством Т.И. Ярыгиной исследованы спектры поглощения продуктов реакции АК с нингидрином, полученных при pH 6,4. Предложены методики количественного определения аминалона в субстанции и в таблетках, кислоты аминокапроновой для инъекций, фенибута в таблетках. Методика характеризуется высокой точностью и простотой исполнения, не требуют применения дорогостоящего оборудования. Спектральные характеристики продуктов реакции АК с нингидрином представлены в таблице 3.[10]

Таблица 3.

Примеры характеристик спектров поглощения продуктов реакции б-АК с 0,2% раствором нингидрина в ацетоне

№ п/п	АК	Максимумы поглощения, нм
		УФ-область	Видимая область
1	Аланин	231, 251	401, 567
2	Аргинин	232, 256	400, 561
3	Аспарагин	231, 256	400, 568
4	Аспарагиновая кислота	230, 256	400, 564
5	Валин	230, 257	400, 560

В литературе описана методика количественной оценки цистеина в биологических жидкостях, основанная на его окислительно-восстановительной реакции с солями железа (III) в присутствии 1,10-фенантролина с последующим спектрофотометрическим определением продукта реакции. Методика характеризуется высокой точностью определения и простотой исполнения.

С целью определения суммарного содержания АК в сыворотке крови авторами предложен спектрофотометрический метод количественной оценки продукта реакции АК с о-фталевым альдегидом. Продукт реакции определяют спектрофотометрически в присутствии меркаптоэтанола при длине волны 340 нм. Методика характеризуется высокой чувствительностью и позволяет количественно определить все б-АК, за исключением цистина, пролина и оксипролина.

По ГОСТу колориметрический метод определения содержания триптофана с п-диметиламинобензальдегидом заключается в расщеплении пептидных связей белка в щелочном растворе гидроокиси бария при нагревании и последующем окрашивании освобожденного индольного кольца триптофана п-диметиламинобензальдегидом. В сильнокислой среде в присутствии нитрита натрия образуется голубая окраска, интенсивность которой измеряется на фотоэлектроколориметре.

1.4 ИК-спектроскопия

В ИК-спектрах АК отсутствуют полосы нормальных валентных колебаний в области 3300-3500 см¹, наблюдается поглощение при 3070 см^-1, которое можно отнести к H₃N⁺-группе (рисунок 4). Эта полоса наблюдается также в спектрах гидрохлоридов АК.

Кроме того, две характеристические полосы H₃N⁺-группы находятся в области 1500-1600 см^-1. АК и их соли показывают типичное для СОО^- поглощение при 1560-1600 см^-1. Карбонильное поглощение СООН-группы при 1700-1730 см^-1 у гидрохлоридов АК сдвинуто на 20 см^-1 в коротковолновую область. [6]

Рисунок 4. ИК-спектр L-аланина

Непрерывный ряд полос находится в интервале 2500-3030 см^-1. В таблице 4 приведены примеры полосы поглощения, характерные для АК.

Таблица 4.

Отнесение характеристических частот поглощения в ИК-спектрах АК

Содержащие NH2-группы АК	Частота колебаний, см-1	Сила колебаний	Тип колебаний
	3130-3030	н N-H, ср.	Валентные колебания H3N+
	1660-1610	д N-H, сл.	Деформац. колебания H3N+, аминокислотная полоса I
	1550-1485	д N-H, ср.	Деформац. колебания H3N+, аминокислотная полоса II
Дикарбоновые б-АК	1755-1720	с.	Валентные колебания C=O в СООН
Дикарбоновые АК	1730-1700	с.	Валентные колебания C=O в СООН
	1230-1215	с.	Колебания с участием связи С-О-С
Все АК	1600-1560 2760-2530 2140-2080 1335-1300	с. сл. сл. ср.	Колебания -COO-

1.5 ЯМР-спектроскопия

¹Н-ЯМР-спектроскопические исследования АК показали, что химический сдвиг протонов АК, а также константы протон-протонного взаимодействия зависят от заряженного состояния молекулы. В графическом изображении зависимость химического сдвига от pH имеет вид типичной кривой титрования. В качестве растворителей для ЯМР-спектроскопии АК, пептидов и белков служит обычно вода или D₂O, а в качестве внутреннего стандарта применяют тетраметилсилан, гексаметилдисилоксан и 2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфонат (ДСС).

В случае ¹³С-ЯМР-спектроскопии, которая применяется для выяснения строения неизвестных соединений и для аналитической характеристики простых производных АК и пептидов, резонансные пики свободных АК лежат для карбоксильных групп между -168 и -183 м.д., для б-углеродного атома - между -40 и -65 м.д., для в-углеродного атома - между -17 и -70 м.д. и для г- и д-углеродных атомов - между -17 и -50 м.д. Сигналы атомов углерода ароматических и гетероароматических колец находятся между -110 и -140 м.д. На рисунке 5 приведен ¹³С-ЯМР-спектр аспарагиновой кислоты.[3]



Рисунок 5. ¹³С-ЯМР-спектр аспарагиновой кислоты

В полипептидах и белках индивидуальные сигналы сдвигаются и перекрываются из-за взаимодействия отдельных аминокислотных остатков. Это затрудняет количественное отнесение сигналов к определенным группам.

1.6 Масс-спектрометрический анализ АК

Для б-АК характерно разложение на стабилизированные мезомерией иминиевые ионы и относительно устойчивый радикал -СООН и радикал боковой цепи. Дальнейшее фрагментирование зависит от строения боковой цепи. В связи с трудной летучестью АК проба вносится в ионный источник масс-спектрометра при 10^-4-10^-5 Па и 100-150 °С. Благоприятно введение летучих производных АК, которые применяются и для газовой хроматографии.

В работе а провели разделение и идентификацию основных АК в виде N-[(6-хинолиниламино)карбонил]-производных (ХАК) методом ВЭЖХ-МС. Из приведенных масс-спектров (рисунок 7) видно, что при ионизации в условиях положительного электроспрея и 20 В на конусе источника ионизации ХАК-производных АК, кроме протонированного молекулярного иона, образуются также двузарядные ионы. АК аргинин дает двузарядный ион m/z 173, что может являться следствием протонирования NHCNH₂NH-группы.

Двузарядные ионы также образуются, вероятно, вследствие присутствия нескольких ХАК-заместителей, в спектре ХАК-производного лизина (m/z 244). Также двузарядный ион возникает в спектре гистидина (m/z 163). Кроме того, в масс-спектрах производных основных АК образуются дополнительные фрагменты: [МН₂-171]⁺ для лизина (m/z 317), аргинина (m/z 175) и гистидина (m/z 156).

Рисунок 7. Масс-спектры, полученные в максимуме хроматографического пика ХАК-производных АК

Масс-спектроскопия приобрела особое значение при анализе аминокислотных последовательностей белков. Можно легко определять отдельные АК, так как благодаря высокой интенсивности молекулярных пиков из-за малого фрагментирования и относительно слабого межмолекулярного взаимодействия получают спектры высокого разрешения.[8]



2. Хроматографические методы

2.1 Газожидкостная хроматография (ГЖХ)

За последние десятилетия достигнуты значительные успехи в области ГЖХ АК. Предложен метод ГЖХ с использованием микронабивных колонок, позволяющий за сравнительно короткое время разделять практически полностью 17 важных в биологическом отношении б-АК.

Разработана методика определения АК с помощью ГЖХ в образцах сыворотки, плазмы, мочи и спинномозговой жидкости, основанная на получении 2,3,4,5,6-пентафторбензоил-изобутиловых эфиров с последующим разделением на колонке из полидиметилсилоксана в режиме программирования температуры от 140 °С до 250 °С с пламенно-ионизационным детектором. Время хроматографического разделения составляет 28 мин. В результате исследований удалось разделить 27 АК.

ГХ в сочетании с масс-спектрометрией предоставляет идеальные возможности для обнаружения неизвестных АК и пептидных структур. Существенный недостаток ГХ состоит в том, что для анализа нельзя непосредственно использовать труднолетучие АК. Сначала их нужно перевести в летучие соединения путем получения подходящих производных или с помощью реакций разложения. Наилучшим оказалось одновременное замещение амино- и карбоксильной функций АК. В таблице 5 приведены производные АК, для которых удалось полное разделение или получены достаточно удовлетворительные результаты. Продукты распада, такие как альдегиды, амины, аминоспирты, нитрилы, гидроксикислоты и др., до сих пор не удалось однозначно идентифицировать .



Таблица 5.

Производные АК для газохроматографического определения

№ п/п	Аминофункция	Карбоксильная функция	Неподвижная фаза
1	Ацетил	Пропиловый эфир	Карбовакс 20-МХ
2	Трифторацетил (ТФА)	Метиловый эфир	ХЕ-60/QE-1/MS-200
		Бутиловый эфир	Апизон М
3	Гептафторбутирил (ГФБ)	Метиловый эфир	ПЭГ/адипат/апиезон
		Пропиловый эфир	OV-1
		Изоамиловый эфир	SE-30
4	Триметилсилил (ТМС)	Триметилсилиловый эфир (ТМС-эфир)	OV-11
5	Динитрофенил (ДНФ)	Метиловый эфир	SE-30

На рисунке 8 приведены результаты газохроматографического разделения 20 протеиногенных АК в виде N-гептафторбутирилпропиловых эфиров. Получение производных осуществлялось взаимодействием с ангидридом гептафтормасляной кислоты.[11]

поляриметрия хроматография ионнообменный

Рисунок 8. ГХ-разделение 20 протеиногенных АК в виде N-гептафторбутирилпропиловых эфиров [12]



2.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

В последнее время для анализа АК в различных объектах широко используется ВЭЖХ, характеризующаяся высокой точностью определения и большой производительностью . Несмотря на многообразие методик ВЭЖХ в анализе АК, наиболее экспрессным и доступным является обращенно-фазовый вариант ВЭЖХ со спектрофотометрическим или флуориметрическим детектированием. Для успешного разделения и детектирования АК переводят в гидрофобные и поглощающие свет производные, т.е. проводят дериватизацию. Основными требованиями к выбору дериватизирующего агента являются быстрота и образование стабильных производных. Различают пред- и послеколоночную дериватизацию.

В предколоночной дериватизации (до аналитического разделения) реакцию обычно проводят вручную во флаконах перед введением в хроматограф или данный процесс может быть автоматизирован.

В послеколоночной дериватизации реакцию проводят автоматически путем добавления реагента после разделения АК. Этот метод обычно требует меньшей подготовки пробы и процедур по очистке, имеет меньше помех от реагентов, используемых для дериватизации, а получаемые результаты в целом более воспроизводимы . В качестве реагентов для дериватизации применяют орто-фталевый альдегид, нафталин-2,3-дикарбоксиальдегид, 9-флуоренилметилхлороформиат и другие. Реакция таких дериватизирующих реагентов, как 7-хлор-4-нитробензоксадиазол (NBD-Cl) и 4-фтор-7-нитро-2,1,3-бензоксадиазол (NBD-F), с АК приводит к образованию весьма стабильных флуоресцирующих продуктов (рисунок 9). Условия хроматографического разделения АК, описанные в научной литературе, обобщены в таблице 6.[7]



Рисунок 9. Схема образования дериватов из АК и (NBD-Cl) или (NBD-F), где Х=Cl или F

Метод ВЭЖХ широко используется не только для разделения суммы, идентификации и количественного определения различных АК, но и для разделения стереоизомеров АК в различных объектах. Значительное количество зарубежных публикаций посвящено исследованиям по подбору условий (таблица 6) для решения данной задачи с применением метода ВЭЖХ . Так, в работе были проведены разделение смеси стандартных образцов стериоизомеров 14 АК (рисунок 10).



Рисунок 10. ВЭЖХ-хроматограмма смеси стандартных образцов стериоизомеров АК (внутренний стандарт L-гомо-аргинин). Реагенты, использованные для дериватизации: о-фталевый альдегид/N-изобутил-L-цистеин [4]

Таблица 6.

Условия хроматографического разделения АК[13]

№ п/п	Определяемое соединение	Условия дериватизации	Характеристика хроматографической системы	Детекция	Объекты анализа
1	Оксипролин	Образец + буферный раствор с рН 8,0 + NBD-Cl 5 мг/мл, при 60 °С - 5 мин.	Shimpack CLC-C18. 150Ч4,6 мм. Элюент: фосфатный буфер (0,05 М с рН 2,4) - метанол (35:65).	лex=470 нм, лem=530 нм	Мясо
		Образец + боратный буферный раствор с рН 9,5 + NBD-F, при комн. температуре - 40 мин.	Cadenza CD-C18. 250Ч4,6 мм. Градиентный режим. Элюент А: вода - ацетонитрил - 2-пропанол - трифторуксусная кислота (90:10:0,8:0,08). Элюент В: вода - ацетонитрил - 2-пропанол - трифторуксусная кислота (ТФУК) (90:10:5:0,08). Элюент С: вода - ацетонитрил (90:10). Элюент D: вода - ацетонитрил - ТФУК (90:10:0,08).		Вода, энергетические напитки
2	АК	Образец + фенилизотиоцианат.	Элюент: метанол и фосфатный буферный раствор с pH 5,5.	254 нм	-
3	Стереоизомеры триптофана	Образец + боратный буферный раствор с рН 9,5 + о-фталевый альдегид и 1-тио-в-D-глюкозы тетраацетат, при комн. температуре - 6 мин.	Superspher 60 PR-8e Purospher PR-18e. 125Ч4,0 мм. Элюент: метанол и ацетонитрил.	лex=325 нм, лem=420	Смеси свободных АК и гидролизаты белков
4	АК	Образец + боратный буферный раствор с рН 8,0 + NBD-Cl, при 70 °С - 30 мин.	Phenomenex C18 250Ч4,6 мм. Элюент: ацетонитрил - азотная кислота (рН 3,0).	лex=470 нм, лem=530 нм	Моллюски
			Shimpack CLC-ODS 150Ч4,6 мм. Элюент: метанол - фосфатный буфер (0,05 М с рН 2,8), содержащий 1 мл/л триэтиламина (72:28).
5	АК	Образец + боратный буферный раствор с рН 9,5 + NBD-F, при комн. температуре - 20 мин.	Ultrasphere ODS 250Ч4,6 мм (предколонка 45Ч4,6 мм). Градиентный режим. Элюент А: 0,1% водный раствор ТФУК. Элюент В: 0,1% раствор ТФУК в смеси ацетонитрил - вода (3:1).	лex=470 нм, лem=530 нм	Плазма крови



2.3 Ионообменная хроматография

Широкое распространение в анализе АК получили аминокислотные анализаторы (АКА). Данный метод анализа основан на разделении АК с помощью ионообменной хроматографии с последующим фотоколориметрическим определением продуктов реакции с нингидрином. б-АК, имеющие первичную аминогруппу, образуют с нингидрином продукт пурпурной окраски, интенсивность которой измеряется при длине волны 570 нм, а вторичные амины (пролин и оксипролин) с нингидрином образуют продукты желтой окраски, интенсивность которой определяют при длине волны 440 нм. Результаты регистрируют в форме пиков абсорбции света элюатом из колонны по окончании цветной реакции. Причем величина пика прямо пропорциональна концентрации данного вещества в растворе.

Метод характеризуется высокой точностью определения, производительностью, а также возможностью получения данных о количественной оценке как суммарного содержания АК, так и каждой АК в отдельности. Главным недостатком данного метода анализа является высокая стоимость оборудования, что делает его недоступным для большинства лабораторий.[12]

2.4 Тонкослойная хроматография (ТСХ)

Несмотря на широкое внедрение методов ГЖХ и ВЭЖХ, анализ АК с помощью ТСХ в настоящее время используется также довольно широко. Наиболее часто для проявления хроматограмм используют свежеприготовленные спиртовые и ацетоновые 0,2-2% растворы нингидрина, однако в анализе отдельных АК нередко применяют более специфичные реагенты. Так, разработан хроматоденситометрический экспресс-метод анализа в культуральных жидкостях триптофана, в котором используется 4-диметиламинобензальдегид, избирательный к индольному кольцу, в виде 0,5% этанолового раствора с добавлением 5% кислоты серной концентрированной.

Основной задачей при разработке новых методик анализа является выбор систем растворителей, обеспечивающих разделение всех исследуемых АК. При изучении аминокислотного состава различных объектов используются в основном подвижные фазы, представленные в таблице 7. Анализируя данные таблицы 7, можно сделать заключение о том, что наилучшее разделение зон АК на хроматограммах наблюдается при использовании подвижных фаз в диапазоне полярностей от 4,5 до 6,0.

Таблица 7.

Элюенты, используемые в литературе для разделения и определения АК

№ п/п	Состав растворителей	Соотношение	Полярность по Снайдеру
1	н-пропанол - вода	(70:30)	5,57
2	хлороформ - метанол - 10% раствор аммиака	(40:40:20)	-
3	н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода	(40:10:5)	4,78
4	н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода	(40:10:10)	5,13
5	н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода	(40:10:20)	5,69
6	н-бутанол - диэтиловый эфир - ледяная уксусная кислота - вода	(9:6:3:1)	4,22
7	96% этанол - концентрированный аммиак	(16:4,5)	-

Так, разработана методика количественного определения L-лизина, L-гомосерина и б-треонина в культуральных жидкостях методом хроматоденситометрии. Сканирование пятен осуществляли на денситометре при длине волны 500 нм.[1]

В качестве неподвижной фазы используют стандартные носители, такие как силикагель, оксид алюминия, порошок целлюлозы, ионообменники на основе целлюлозы, полиамиды, а также полиакриламидный и декстрановый гели.

При определении очень малых количеств АК применяют проявление ТСХ-пластинки флуорескамином. После элюирования подходящим растворителем наблюдают флуоресценцию при 366 нм. Предел обнаружения метода при проявлении с помощью производного флуорескамина - 10 пмоль.

Особенно легко и быстро удается разделить смесь АК с помощью комбинации двумерного разделения, например тонкослойного электрофореза на целлюлозе и хроматографии (метод «отпечатков пальцев»). Сначала проводят электрофорез (низковольтный электрофорез без охлаждения, 20 В/см, муравьиная кислота), а затем хроматографируют во втором направлении, например с элюентом состава н-бутанол - метанол - пиридин - муравьиная кислота - вода (33:43:9,6:0,4:20).

Известен способ разделения 15 основных АК из 20 основных АК биологических жидкостей с помощью двумерной ТСХ на силикагеле фирмы Whatman (США) с последовательным использованием двух систем растворителей: н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:5) и фенол - вода (15:1). Этот способ разделения АК является наиболее эффективным из известных аналогов, но длительным по времени (>7 ч).

Разработана методика качественного и количественного определения 14 несвязанных аминокислот в моче человека в условиях восходящей двумерной ТСХ на пластинках «Армсорб» (таблица 8). Установлено, что наилучшее разделение и наибольшие различия в подвижности различных по строению и свойствам АК получены при использовании следующих смесей растворителей: в первом направлении смесь гептан - дихлорэтан - уксусная кислота (20:30:30); во втором (перпендикулярном) направлении смесь бутанол - уксусная кислота - вода (80:20:20) .[14,15]



Таблица 8.

Коэффициенты подвижности R_f АК, полученные в условиях восходящей двумерной ТСХ на пластинках «Армсорб»

АК	Rf	АК	Rf
Метионин	0,14	Аргинин	0,12
Гистидин	0,18	Триптофан	0,50
Глутамин	0,17	Глутамин	0,33
Аланин	0,30	Глицин	0,37

Разработанный способ определения ацилированных жирными кислотами АК, заключающийся в двукратном хроматографировании в системе гексан - диэтиловый эфир [(1,5-2):1], а затем в системе гексан - диэтиловый эфир - ацетон (1:1:0,6), с последующим обнаружением зон в УФ-свете.

Метод ТСХ характеризуется высокой точностью определения, не требует использования дорогостоящего оборудования. Однако применение данного метода ограничено длительностью проведения анализа (в течение нескольких суток). Кроме того, продукт реакции АК с нингидрином нестабилен во времени. Поэтому при количественном определении АК методом ТСХ, основанным на фотоколориметрии продукта реакции, следует учитывать временной фактор. В настоящее время метод ТСХ используют для предварительного анализа, более полные сведения о компонентном составе АК в исследуемых объектах получают при использовании ГЖХ, ВЭЖХ, АКА.[2]



Заключение

В работе проведен анализ и систематизация известных в настоящее время методов определения АК в различных объектах. Титриметрические методы (продолжающие оставаться самыми доступными и точными) рекомендованы нормативной документацией и широко используются для количественного определения АК в фармацевтических субстанциях или однокомпонентных ЛП АК.

УФ-спектрофотометрия, ИК-спектроскопия, спектроскопия ЯМР (высокоинформативные методы, используемые в основном для анализа АК в субстанциях или монопрепаратах) не могут быть использованы в анализе многокомпонентных смесей АК без предварительного разделения. Однако они дают представление только о суммарном содержании АК в пересчете на какую-либо АК, без достоверной информации о присутствии индивидуальных АК в объекте.

Метод поляриметрии дает важную информацию при анализе субстанции АК, но не пригоден для анализа суммы изомеров оптически активных веществ без их предварительного разделения.

Хроматографические методы используются для одновременного разделения, идентификации и количественного определения АК (методы БХ, ТСХ, ГХ, ВЭЖХ, ионообменной хроматографии). В настоящее время они занимают лидирующие позиции по частоте использования и количеству публикаций.

В ряде случаев идентифицировать все зоны на хроматограммах методом ТСХ затруднительно, т.к. зоны некоторых АК имеют близкие значения R_f. Для ТСХ всего спектра известных АК до сих пор не подобраны универсальные условия разделения (сорбент и система растворителей).

Для определения аминокислотного состава различных объектов в России до последнего времени рекомендовали использовать АКА на основе ионообменной хроматографии, что для подавляющего большинства аналитических лабораторий было невыполнимо ввиду отсутствия современных АКА отечественного производства.

Масс-спектрометрический анализ - один из самых точных и информативных методов исследования АК в составе сложных многокомпонентных растительных объектов, позволяющий решить все задачи за одну аналитическую процедуру. Однако широкое применение данного метода остается все еще невозможным из-за высокой стоимости оборудования, вспомогательных реактивов, трудности в эксплуатации прибора, а следовательно, и значительной себестоимости одного анализа. Все это не позволяет рекомендовать его для включения в нормативную документацию, методики которой должны удовлетворять требованиям рутинного анализа.



Список литературы

1. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. - Пятигорск, 2003. - 720 с.

2. Фармацевтическая химия. /Под ред. А.П. Арзамасцева. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005, 640с.

3. Максютина Н.П., Каган Ф.Е., Кириченко Л.А., Митченко Ф.А. Методы анализа лекарств. - Киев: Здоровье - 224 с.

4. Кулешова М.И. Гусева Л.Н., Сивицкая О.К. Анализ лекарственных форм, изготовляемых в аптеке. - М.: Медицина - 288 с.

5. Пономарев В.Д. Аналитическая химия. В двух частях. - М.: Высш. шк.

6. Шаршунова М., Шварц В., Михалец Ч. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии. В двух частях. - М.: Мир. - 624 с.

7. Журнал «Фарматека» за последние годы.

8. Физико-химические методы анализа. Учебное пособие для студентов фармацевтического факультета / Под ред. В.А. Карташова. - Барнаул. -- 60 с.

9. Анализ лекарственных форм в аптечных условиях. Методические разработки для студентов 5 курса по фармацевтической химии. - 2016. - 100 с.

10. Федеральный закон РФ «О лекарственных средствах»

11. Руководство к лабораторным занятиям по фармацевтической химии. /Под ред. А.П. Арзамасцева. - М.: Медицина, 320 с.

12. «Химико-фармацевтический журнал» 2017 г.- 35с.

13. Дэвени Т., Гергей Я.Аминокислоты, пептиды и белки - 368 с.

14. Джеймс А. Шейман. Фармацевтическая химия. 2004.

15. Граник В.Г.Основы медицинской химии. 2001.

Размещено на Allbest.ru