Саморобні потрійні нанокомпозити глюкозооксидази / графена / золота для прямої електрохімії та електрокаталізу

Размещено на http://www.allbest.ru/

Саморобні потрійні нанокомпозити глюкозооксидази / графена / золота для прямої електрохімії та електрокаталізу

ВСТУП

Графен з надзвичайно високою рухливістю електронів і великою поверхневою площею, широко використовувався при застосуванні біосенсингу [1-7]. З функціоналізацієї полімерів або наноструктурних матеріалів, може бути поліпшена і диспергованість графена.[8-17]. Наприклад, хитозан [18] був продемонстрований в якості відмінного стабілізатору для графену [19-22]. Можна використати хітозан-модифіковані графенові нано-пластівки що сповільнюють іони цитохрому «С» і дослідити пряму електрохімічну та електрокаталітичну реакцію з поведінкою оксиду азоту [20]. Хитозан також використовувався як відновник для приготування графену замість звичайного відновлювача гідразину гідрату [21]. Також може бути використаний хітозан-фунціоналізований графен для сповільнення утворення глюкозооксидаиу (ГО) електростатичною взаємодією у водному розчині. Полімери із р зв'язками є ще одним видом відмінних стабілізаторів для графена [1,10,13,23]. Полі (діалідиметиламоній хлорид) (ПДДА) функціоналізований графен у поєднанні з кімнатною температурою показує збільшення можливості іммобілізації іону гемоглобіну, що реалізовано електрохімічно та має відмінну електрокаталітичну активність у виявленні азоту[1]. Ніу та інщі. [10 ]Спочатку повідомлялося, що полівінілпіролідон-захищений графен має гарну розчинність у воді. Отримані нанокомпозити на основі графену можуть бути використані для прямої електрохімії глюкозо оксидази, що вказує на потенційне застосування для виготовлення біосенсорів глюкози. З іншого боку, металеві або напівпровідникові наночастинки, що мають відміннну провідність, також були введені в дисперсний полімерний графен [11,13,14,24]. Було повідомлено, що через їхсинергетичну взаємодію графен-CdS нанокомпозит має відмінний електронний обмін з глюкозооксидазою [13]. Тому що наночастинки золота ( AuNPs) можуть забезпечити відповідне мікросередовище для іммобілізації біомолекули і полегшення переносу електронів між іммобілізованими білками та AuNP [13,24,25], вони були використані для приготування нанокомпозиту з полімерно-стабілізованого /диспергованого графену. Нанокомпозити були синтезовані шляхом заміщення ПДДА-захищених AuNP на графен, що отримується шляхом фізичного змішування ультразвуком. Далі використовувалася методика "e layer-by-layer " (LBL) для підготовки альтернативних многошарових графен-AuNP та глюкозооксидази. Пряма електрохімія іммобілізованого глюкозооксидази і біосенсинг для глюкози були досліджені.

1. ЕКСПЕРЕМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

1.1 Реагенти

Глюкозооксидаза і полідіалідиметиламоній хлорид були придбані в «Sigma-Aldrich Chemical Co.» та гідразин гідрат був придбаний в «Co. (Nanjing, China)». Оксид графіту був отриманий в «Nanjing XFNANO Materials Tech Co. Ltd. (Nanjing, China)». Всі інші хімікати були аналітичного сорту і використовувались без подальшої очистки. Розчин фосфатного буферу (РФБ) одержували з NaH2PO4 та Na2HPO4. У цьому дослідженні використовувалась подвійна дистиляція.

1.2 Синтез графенових нанопластин (ГН)

Дисперсія глюкозооксидази була отримана ультразвуком оксиду графіту у воді. Отриману коричневу суміш центрифугували при 3000 об / хв протягом 30 хв, щоб видалити будь-який неочищений окис графіту. Залишки солей і кислот були повністю видалені шляхом діалізу. Потім 4 мл готового суспензії сполучали з 36 мл N, N-диметил-формідом (ДМФ). Сальвометричне відновлення проводилося при 80 ° С за допомогою моногідрату гідразину (0,1 мл) що використувалил в якості відновника [26]. Через 12 годин суспензію центрифугували та промивали дистильованим ДМФ до видалення надлишку моногідрату гідразину. В кінці графен помістили в сушильну шафу на 24 години.

1.3 Синтез захищених ПДДА AuNP та підготовки ГН-AuNP Нанокомпозитів

Захищені ПДДА AuNP були синтезовані відповідно до процедури Що описана у роботі Ченом та ін. [27]. Як правило, 250 µL ПДДА (4мас.% У воді), 40мл води, 200 µL 0,5М NaOH та100 µL HAuCl4 (10 мг мл1) додавали у колбу с круглим дном. Після ретельного перемішування протягом 2 хв змішаний розчин підтримували при температурі 100 ° С, доки червоний розчин не змінив колір. Отриманий колоїдний розчин з AuNP зберігали у коричневій пляшці при 4 ° С. Спектр поглинання ультрафіолетових променів AuNP був центрований при 521 нм, що відповідає попереднім повідомленням добре-розсіяних речовин, що були дослідженні в роботі [27]. Зображення TEM показали, що розмір частинок AuNP складає приблизно 12,5 нм. ПДДА-захищені AuNP (2,0 мл) потім центрифугували при 13000 об / хв для видалення надлишкового вільного ПДДА з колоїдного золота. Осад передисперсували в 2,0 мл води. Після цього додавали 1,0 мг графена , а остаточну однорідну суспензію графену-AuNP отримали шляхом обробки ультразвуком протягом 2 годин.

1.4 Отримання багатошарових (ГО-ГН-AuNPs) на склоподібному вуглецевому електроді

Склоподібний вуглецевий електрод (СВЕ, діаметр 3 мм) був відполірований до дзеркала з 1,0, 0,3, 0,05 µm глиноземної суспензії, в подальшому знімаючи в 1: 1 азотній кислоті ацетон та воду. Потім 3 µL обробленої суспензії ГН-AuNP розміщують на СВЕ і дають висохнути при кімнатній температурі. Потім 3 µL розчину глюкозооксидази (1мг/мл в 0,1мл/л рН 7,0 РФБ) був нанесений на плівку нанокомпозитів ГН-AuNP який сушили при кімнатній температурі. Після чого йогопотім промивають фосфатно-сольовим буфером (РФБ) (0,1 моль/л, рН 7,0) три рази. Перераховані вище процедури були повторені, щоб отримати зміни СВЕ з різними шарами AuNPs-графену та глюкозо оксидази (схема.1).

Схема.1 Схематична діаграма пошарового процесу

1.5 Апарат

графеновий нанопластина глюкоза електрод

Знімки трансмісійних електронних мікроскопів (ТЕМ) були отримані за допомогою JEM-2100 (FE-TEM, JEOL, Японія) що працює при 200 кВ. Перед вимірюваннями 10 µL зразка, диспергованого у воді, осаджують на мідну сітку і сушать у вакуумі протягом ночі. Всі електрохімічні вимірювання проводилися на CHI832B електрохімічній робочій станції (Shanghai Chenhua Instruments, Китай) з тривимірною системою, що містить платиновий електрод як допоміжний, насичений каломельний електрод (НКЕ) як електрод порівняння і модифікований СВЕ як робочий електрод у склоподібній клітці, що містить 5 мл 0,1 моль/л РФБ (рН 7,0) при кімнатній температурі (25±1°С). Перед електрохімічним вимірюванням всі водні розчини деоксигенували, шляхом перемішування в надлегкому азоті протягом 10 хв і підтримували в атмосфері азоту під час вимірювань.

2. РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ

2.1 Характеристики графену і графену- AuNP нанокомпозитів

Морфологія графену і ГН- AuNP була проаналізована за допомогою ТЕМ. Графенові наносфери були зморщені випадковими складками і завернутими кутами (рис.1А). Після покриття захищеними ПДДА, AuNP, ГН- AuNP наночастинками, можна побачити що деякі з них закріпилися на поверхні графену (Рис.1В),що вказує на ефективний р-р зв'язок між ПДДА і графеном. ГН-AuNPs нанокомпозити демонструють сильний абсорціонний пік при 521 нм, що було майже таким самим в розчині AuNP. Це свідчить про відсутність агрегації AuNP. Крім того, дисперсії були стабільними при зберіганні до 2 місяців.

Рис.1 Зображення TEM- ГН (A) и AuNPs-ГН (B).

2.2 Пряма електрохімія глюкозооксидази

На рис.2А показані циклічні вольтоаперограмми (ЦВ) графену, глюкозооксидази-AuNPs та глюкозооксидази-ГН-AuNPs модифікованих електродів в 0,1 молі/ л азотно-насиченому розчину фосфатного буферу при 50 мВ/См. Графеновий модифікований електрод не показав будь яких оксисно-відновних піків, приспукаючи що утворена графенова плівка є електрохімічно інертною (Рис.2А крива а).

Рис. 2. (А) циклічні вольтамперограми (a) ГН / ВСЕ, (b) ГО-AuNP / ВСЕ та (c) ГО-ГН-AuNP / ВСЕ при рН 7,0 РФБ зі швидкістю сканування 50 мВ/См; (В) циклічні вольтамперомографи (ГО-ГН- AuNP)n, зібраних на ВСЕ в (рН 7,0) при швидкості сканування 50 мВ/См. Кількість шарів для (ГО-ГН-AuNP)n збільшується від 1 до 6.

Цікаво, що пари чітко визначених редокс-піків спостерігалися після того, як були побудовані багатошарові глюкозооксидазні-ГН-AuNP композити, підтверджуючи, що відповідь була викликана прямим перенесенням електронів глюкозооксидази. (Рис.2А крива с). Формальний потенціал (E0') розраховано шляхом усереднення катодного та анодного пікових потенціалів як - 0.452 В (порівняно з електродом порівняння), тим часом сепарація від піку до піку була приблизно 33 мВ та співвідношення катодного та анодного інтенсивності струмів приблизно складала 1.1 В, що чітко вказує на зворотну передачу двох-електроного процесу. Модифікований електрод глюкозооксидази- AuNPs також показав редокс-піки глюкозооксидази (рис. 2А, крива б). Проте пікових струмів було набагато менше, ніж в багатошаровій системі глюкозооксидаза-ГН-AuNP, що підтверджує сильну взаємодію між глюкозооксидазою і ГН-AuNP. ПДДА - позитивний заряджений полімер, показує високу сумістність з негативним зарядом глюкозооксидази (з низькою ізоелектричною точністю 4,93) при нейтральному рН. Таким чином, глюкозооксидаза може бути легко зібрана на ГН-AuNPs через електростатичні взаємодії і виставляли більші пікові струми в циклічних вольтамперограмах, ніж у аналогів. Пікові струми в багатошарових електродах, залежать від іх кількості на вуглецево-скляному електроді (рис.2В). На рис. 2В показана лінійна залежність між катодним піковим струмом і кількістю нанесених шарів на електрод, що свідчить про рівномірне зростання ГН-AuNPs у глюкозооксидазі. Коли кількість нанесених шарів була збільшена до 6, катодний струм зменшувався і потенціал змістився у негативну сторону. Це може бути пов'язано з повільним переносом електронів, що викликана глибиною збільшених шарів. Вплив швидкості сканування на вольтамперометричну відповідь (Глюкозооксидази-ГН-AuNPs) 5 / ВСЕ також вивчали, що наведену на рис.3. Як катодні, так і анодні пікові струми збільшувалися зі збільшенням швидкості сканування від 10 до 150 мВ/См , що вказує на поверхневий контроль електродного процесу прямого переносу електрона. Значення розділення пік-пік в 10, 25, 50, 75, 100, 125 і 150 мВ/См становили 30, 32, 33, 34, 35,39 і 42 мВ, відповідно. Графік константи швидкості перенесення електронів (ks, оцінений за методом Лавірона [28]) при різній швидкості сканування показана на рис.3В.

Рисунок 3. (А) Циклічні вольтамперограми (ГО-ГН-AuNP)5 / ВСЕ у 0,1 моль/л РФБ (рН 7,0) при різній швидкості сканування (знизу до верху: 10, 25, 50, 75, 100, 125 , і 150 мВ/См); і B) ділянки анодного і катодного пікових струмів (ks) у порівнянні зі швидкістю сканування (v).

Збільшення ks зі збільшенням швидкості сканування зобачало швидке транспортування елекронів між іммобілізованою глюкозооксидазою і поверхнею електроду.

Ks 3,25 См при 100 мВ/См було вище, ніж спостерігалося у глюкозооксидазі, що була імобілізована на вуглецевій нанотрубці с багатошаровим покриття (1,08 См) [29], графен-хитозан (1,78 См) [31] і AuNPs (1,30 См) модифікований електрод. Потенціал окисно-відновного піку зміщувався в негативну сторону при збільшенні рН в діапазоні 5,5-8,4 (рис. 4А). Лінійне рівняння регресії E0' (V) = -0.151-0.043 pH з лінійним коефіцієнтом кореляції 0,999. Нахил від лінійної ділянки формального потенціалу або рН (рис 4В) становив приблизно 43,0 мВ / рН. Результат супрожувався процесом перенесення електронів глюкозооксидази за участю двох протонів та двох електронів [34].

Рис. 4. Циклічні вольтамперограми (ГО-ГН-AuNP)5 / ВСЕ в 0,1 моль/л РФБ при різному рН (зліва направо: 5,5, 6,2, 7,0, 8,0 і 8,4) та (B) формальні потенціали як функція рН при швидкості сканування 50 мВ/См.

Отримані (ГО-ГН-AuNPs) 5-модифікованих вуглецево-скляних електродів були майже однакові після послідовного промивання 20 циклів і зберіганні при 4°С протягом 2 тижнів. За таких умов зберігання і експлуатації залишається приблизно 93% катодного пікового струму глюкозооксидази на модифікованому електроді, що свідчить про відмінну стійкість модифікованого ВСЕ.

2.3 Виявлення глюкози

У присутності кисню глюкозооксидаза може каталізувати з глюкози в глюконолакт і H2O2, в результаті концентрацію глюкози можна побічно визначити шляхом вимірювання виділення H2O2 у реакції [34].

Каталітична здатність глюкози в( глюкозооксидазі-графені -AuNPs)n/ВСЕ збільшувалася з зростанням кількості шарів (глюкозооксидазі-графені -AuNPs) n/ВСЕ (рис.5).

Рис. 5 Крива залежності конценраціїї (ГО-ГН-AuNP)n/ВСЕ 0,1 моль/л від (рН 7,0).

Амперометричні реакції (ГО-ГН-AuNP)5/ВСE з послідовними добавками глюкози до РФБ (рН 7,0) при 0,6 В показані на рис.6А. Поточна реакція біосенсора зменшилася разом із концентрацією глюкози. (глюокозооксидази-графену-AuNP) 5 / ВСE досягало 95% стаціонарного струму через 2 с, що свідчить про швидку електрокаталітичну реакцію. Відповідь на концентрацію глюкози (вставка на Фіг.6А) показав лінійний діапазон від 0,02 до 2,26 ммоль/л з коефіцієнтом кореляції 0,999 та чутливістю 3.844 лА ммоль/л см2. Межа виявлення 4,10 лмоля L1 була отримана в співвідношенні сигналу до шуму від 3.

Рис. 6. (А) Амперометричні реакції (ГО-ГР-АuNP) 5 / при 0,6 В на послідовних доповнень глюкози до насиченого повітрям PBS (рН 7,0) при перемішуванні.

Відтворюваність виробництва для трьох електродів дала РСД. 4,5% для визначення 0,2 ммоль/л глюкози, що свідчить про те, що біосенсор мав гарну повторюваність. Амперометрична реакція нарешті досягла максимального значення при високій концентрації глюкози, що показав типова кінетична поведінка « Міхаеліс-Ментен». Показник кінетики реакції ферменту-субстрату, був використаний для оцінки біологічної активності іммобілізованих ферментів. Значення kappm можна обчислити з рівняння Lineweaver-Burk: де Iss - це cтаціонарний струм реакції після додавання глюкози, Imax - максимальний струм, виміряний при додаванні надлишку глюкози, |S| - концентрація глюкози. kappm розраховувався нахилом та перехопленням для ділянок зворотно-поступальної частини поточного стану та концентрації глюкози (Рис.6В). У цій роботі kappm (ГО-ГН-AuNP)5/ВСЕ електрод становить 0,038 ммоль/л , що менше, ніж для полі (метиленового синього), легованого нанокомпозиту кремнію (0,50 ммоль/л) [35]. Нанокомпозит графен-CdS (1,6 ммоль/л) [14] і графен-хітозан (4,4 ммоль) [15] модифікований електрод. Менший kappm показує, що ферментний електрод має вищу афінність та ферментативну активність для глюкози.

Цей глюкозний біосенсор був нарешті застосований для виявлення реального цукру в крові з трьох свіжих зразків сироватки, що подається добровольцями. Кожну 50 µL зразків сироватки розводили PФБ до 5 мл. За допомогою методу стандартного додавання, глюкоза в реальній крові трьох зразків оцінювалась відповідно 7,1, 5,8 і 4,5, а значення відновлення були значними (табл. 1).

Табл. 1 ГО-ГН-AuNP біосенсор для виявлення глюкози в зразках крові людини.

ВИСНОВОК

У цій роботі нанокомпозити з ГН-AuNP були успішно синтезовані та застосовані для іммобілізації глюкозооксидази, та глюкозної біосензографії. Глюкозооксидаза може бути легко зібрана на ГН-AuNP через електропровідну взаємодію. що дозволило побудувати багатошаровий датчик ГО за допомогою альтернативної сполуки ГН-AuNP та ГО на поверхні електроду. Через відмінні електронні властивості та біосумісність, що наділені нанокомпозитами ГН-AuNPs, іммобілізований ГО добре підтримував його біологічну активність і безпосередню здатність до переносу електронів. Біосенсор мав гарну стабільність і відтворюваність, що зробило запропоновані нанокомпозити перспективною платформою для іммобілізації біомолекул і виготовлення відповідних біосенсорів.

Размещено на Allbest.ru