Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство образования и науки Российской Федерации

ВЫСШЕЕ УЧЕБНОЕ ЗАВЕДЕНИЕ

«РОССИЙСКИЙ ХИМИКО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМ. Д.И. МЕНДЕЛЕЕВА»

Факультет химико-фармацевтических технологий и биомедицинских препаратов

Кафедра химии и технологии биомедицинских препаратов

ОТЧЁТ

О НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ

Руководитель работы:

Калистратова А.В.

Студент:

Свиридова Д.А.

Москва 2016

Цианиновые красители известны своей флуоресценцией в ближней инфракрасной области, которая необходима для биологических исследований. Красителям данного класса уделяется значительное внимание, так как они играют важную роль в различных областях науки, техники и медицины, таких как, лазерные технологии, фотодинамическая терапия рака, энергия передачи в фотосинтезе, мечение биомолекул для последующей идентификации в клетках и тканях. Структура карбоцианиновых красителей включает два гетероциклических фрагмента, соединенных полиметиновой цепочкой с сопряженными С=С связями (схема 1) [2,3]. В зависимости от длины полиметиновой цепи они имеют различные области поглощения: карбоцианины(лmax~520-560 нм), дикарбоцианины(лmax~ 640-680 нм) и трикарбоцианины(лmax~750-800 нм).

Схема 1. Структура карбоцианинового красителя

Именно трикарбоцианины (n=3)(другой вариант номенклатурного названия - гептаметиновые красители),поглощающие в диапазоне так называемого «терапевтического окна», нашли применения в биологии и медицине в качестве биомаркеров[5-7].Например, индоцианиновый зеленый (ICG) (схема 2) является единственным принятым FDA(Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов)цианиновым красителем, который используется в настоящее время для ангиографии сетчатки глаза в организме человека [1].Он не токсичен и может применяться у пациентов с обнаруженными побочными эффектами ниже 0.15%, с чрезвычайно благоприятным показателем. Такая биосовместимость определяет его как соединение - лидер для поиска путей модификации данной структуры за счет введения функциональных групп, позволяющих присоединять к ним лекарственные препараты и тем самым открывая путь к созданию «drug-delivery» [3].В настоящее же время наибольшее применение цианиновые красители находят в биологии и медицине как флуоресцентные метки и выбор структур для синтеза обусловлен их физико-химическими характеристиками, в частности квантовым выходом флуоресценции, фото- и хемостабильность.

Схема 2. Индоцианиновый зеленый (ICG)

Одним из направлений такой модификации является синтез красителей с конформационно закрепленным полиметиновым линкером, что приводит к увеличению фото- и хемостабильности.

Целью настоящей работы является синтез аналогов кардиогрина с конформационно закрепленным полиметиновым линкером (схема3).

Схема 3

Литературный обзор

Первый синтетический полиметиновый краситель, изображенный насхеме4, был синтезирован в 1856 году и получил название "цианиновый" краситель из-за своего синего цвета[4].

Схема 4

В целом, структурное разнообразие достигается главным образом за счет варьирования длины полиенового линкера, заместителей в полиеновом линкере и заместителей при атоме азота [8]. Для создания флуорофоров биомедицинского назначения необходимо создание красителя с определенными фармакологическими и фотофизическими свойствами. Главными из этих свойств являются: низкое связывание с биомолекулами, достаточная растворимость в воде, низкая токсичность, возбуждение и относительно высокая флуоресценция в ближней ИК-области (700-900 нм - «терапевтическое окно»), химическая и фотохимическая стабильность. Литература по синтезу цианиновых красителей обширна (см., например, [9-12]), но в данной работе ограничимся лишь принципиальными моментами синтеза с примерами структур биологической направленности.

Синтез гетероциклических солей

Ключевой стадией создания цианиновых красителей является взаимодействие четвертичной гетероциклической соли, содержащей активированную метильную группу, способную легко депротонироваться, с соответствующим электрофильным центром. Свойства получающихся цианинов, как например степень их гидрофильности, определяются характером заместителей как при кватернизированном атоме азота гетероцикла, так и наличием гидрофильных групп в ароматических кольцах индоленинового фрагмента (Схема 5). Поэтому создание гетероциклических солей как метиленовых компонент необходимого строения является одним из ключевых этапов формирования целевого карбоцианина. Этот процесс включает два этапа: (а) получение соответствующего азотсодержащего гетероцикла 1 (выбор Y и R1-R3, (cхема 5) и (б) дальнейшее алкилирование гетероциклического атома азотаподходящималкилирующим агентом с получением соли 2 (Схема 5). Выходы в этих процессах обычно препаративные и колеблются от 45 до 80% в зависимости от характера алкилирующего RX[9-11].

Схема 5

Y=C(CH3)2, S;R1,R2,R3=COOH, SO3H;R1,R2=конденсированныйароматическийцикл;X=Hal, OTs, ClO4;R=алкил,арилалкил,-(CH2)nCOOH,-(CH2)nSO3H, -(CH2)nNR2, -(CH2)nP(O)(OH)2

С учетом растворимости в воде образующихся гетероциклических солей 2, особый случай представляют алкилирующие реагенты с гидрофильными функциональными группами, такими как карбоксильная, фосфонатная, сульфо- и аминогруппы. Алкилирование производными щ-бромалкилкарбоновых кислот обычно обеспечивает выходы до 80%, а алкилирование бромалкилфосфонатами протекает с гораздо более низкими выходами, причем снижение выхода связано в большей степени с потерями в процессе выделения целевых солей [13-15]. Удобными алкилирующими реагентами являются сультоны, и образующаяся при этом соль 3 представляет собой цвиттер-ион(схема 6) [16].

Схема 6

Дальнейший синтез цианиновых красителей представляет собой конденсацию соответствующих гетероциклических четверичных солей с карбонильной компонентой, содержащей полиметиновый линкер нужной длины. Большинство сопряженных непредельных диальдегидов представляет собой нестабильные соединения, и используются в синтезе в виде соответствующих производных (ортоформиаты, иминиевые производные и т.д.).

Синтез гептаметиновых цианиновых красителей

Схема 7

Принципиальная схема синтеза ближайших аналогов повторяет схему получения кардиогрина. Этим путем можно получать и несимметричные структуры(Схема 8).

Основной проблемой синтеза гептаметиновых цианинов является выбор электрофильногофункционального фрагмента, способного к конденсации с метильными группами. Найдено, что синтез гептаметиновых красителей с индолениниевым фрагментом может быть основан на конденсации (либо в уксусном ангидриде, либо в присутствии оснований) гидрохлорида дианила глутаконового диальдегида с четвертичными солями замещенных гетероциклов, содержащих активированную метильную группу. Схема синтеза кардиогрина является базовой.Данная синтетическая схема описана много лет назад с хорошими выходами на каждой стадии и приведена на схеме 7.

Схема 8

Синтез трикарбоцианинов сзаместителями, содержащимифосфонатнуюгруппу у атомаазотаиндоленинового фрагмента имел целью увеличить водорастворимостьцианиновых красителей.Был синтезирован ряд красителей, содержащих как -P(O)(OС2Н5)2, так после кислотного гидролиза - P(O)(OH)2 группу в заместителе при атоме азота индоленинового фрагмента(см. схему 9).[21]

Схема 9

Синтез гептаметиновых красителей с конформационно закрепленным полиметиновым линкером

Возможность использования цианиновых красителей в биологии и медицине настолько привлекательна, что число работ в области синтетического дизайна структур постоянно растет [18]. Действительно, может быть несколько подходов к модификации базовой молекулы кардиогрина: модификация полиенового линкера, введение полярных групп в ароматические кольца и в заместители при атоме азота гетероциклического фрагмента для увеличения растворимости в воде, введение в структуру легко модифицируемых функциональных групп, как, например, карбоксильная, аминная, изотиоцианатная; именно эти группы позволяют достаточно просто осуществить ковалентное связывание с самыми различными молекулами и биомакромолекулами.

Введение алициклического фрагмента в полиеновый линкер

При преобразовании неплоской молекулы в сходную по строению, но имеющую более плоскую и/или жесткую структуру, увеличивается сопряжение и квантового выхода флуоресценции. Другими словами, молекулы с более жесткой структурой обладают пониженной подвижностью фрагментов, лучшими условиями сопряжения и более интенсивной флуоресценцией из-за отсутствия потерь энергии при колебаниях и столкновениях. Поэтому введение цикла в полиметиленовый линкер в качестве элемента жесткости выглядит достаточно привлекательным.

На схеме 10 приведены циклические центральные бифункциональные линкеры. Примеры синтезированных цианиновых флуорофоров также приведены на этой же cхеме 10. Эти линкеры используются с разной степенью интенсивности в зависимости от их доступности.

Особенно широкое применение находят хлорсодержащие линкеры 4 и 5 (Схема 10). Прежде всего, эти соединения легко доступны по реакции Вильсмейера [19,20,22-24]. Кроме того, наличие атома хлора в цианиновых системах, способного к реакциям замещения, резко расширяет возможности структурного дизайна.

Схема 10

При рассмотрении этих структур видно, что они обладают большим потенциалом для модификаций, связанных с замещением атома хлора и образованием связей C-O, C-N, C-S и C-C (Схема 11).Отметим, что они и сами могут использоваться как флуорофоры, так как их флуоресценция резко возрастает при связывании с альбуминами. При внутривенном или внутрибрюшинном введении (invivo исследование на мышах) они накапливаются в раковых клетках разных типов рака(флуоресцентный сигнал от раковых клеток превышает в 20 раз сигнал от накопления в здоровой ткани). Сигнал настолько стабилен, что может фиксироваться в опухолях в течение более чем двух недель, в том числе и в послеоперационном материале для последующего гистологического изучения [25]. Кроме того, эти флуорофоры могут найти применение для обнаружения небольших метастатических повреждений и даже циркулирующих опухолевых клеток (фиксация 10 раковых клеток в 1 мл крови) [26].

Схема 11

В качестве примера функционализации центрального фрагмента с образованием новой С-С связи приведем синтез флуорофора 6 (Схема 12), обладающего улучшенными целевыми свойствами в сравнении с кардиогрином и его близкими по структуре аналогами [17]. Однако несмотря на очень высокие выходы (>90%) метод Сузуки требует предварительной защиты таких функциональных групп как NH2 и OH. В некоторых случаях введение защитных групп можно избежать, если использовать модифицированный способ Сузуки-Мяура [27].

Схема 12

Обсуждение результатов

Целью настоящей работы был синтез конформационно закрепленныханалогов кардиогрина,содержащих циклогексеновое кольцо в полиметиновом линкере. Для этого была предложена следующая схема превращений: краситель флуорофор конденсация линкер

Схема 1

Общая схема 2-х стадийного синтеза

Стадия 1: Синтез индолениниевой соли(3) из индоленина (1) и сультона (2)

Схема 2

Первая стадия заключалась в синтезе индолениниевой соли (3) из индоленина (1) и бутансультона (2). Реакцию проводили нагреванием в дихлорбензоле. В результате реакции образовался осадок индолениниевой соли (3). Этот осадок был отфильтрован при пониженном давлении, промыт диэтиловым эфиром и высушен на воздухе. Выход индолениновой соли составил 70% от методики и 71% от теории. Полученная соль 3 была охарактеризована спектром ЯМР 1Н. В спектре присутствуют сигналы ароматических протонов в области 7.7 - 8.4 м.д., сигналы СН2-группы при атоме азота при 4.6 м.д., сигналы трех СН2-групп и СН3-группы в области 2.0 - 3.4 м.д., а также синглет на 6 пронов при 1.75 м.д. двух СН3-групп.

Стадия 2: Синтез симметричногогептаметинового цианинового красителя с конформационно закрепленным полиметиновым линкером (6) и моноанила (5)

Схема 3

Вторая стадия заключалась в конденсации полученной индолениниевой соли (3) с N-[(E)-{2-хлор-3-[(фениламино)метил]циклогекс-2-ен-1-илиден}метил]анилин гидрохлоридом(4) в присутствие ацетата натрия в качестве основания. Смесь, представленную на схеме 15, выдержали при комнатной температуре 6 часов в 25мл ацетонитрила.

В результате образуется смесьисходного дианила циклогексендикарбальдегида (4), продукта моноконденсации - моноанила (5) и красителя (6) - конформационно закрепленного аналога кардиогрина. Для разделения полученной смеси пользовались колоночной хроматографией на силикагеле. Были подобраны подвижные фазы для разделения моноанила (5) и гептаметинового красителя (6). Сначала был выделен избыток дианилациклогексендикарбальдегида (4) в соотношении хлористого метилена и метанола (50:1). Для выделения продукта моноконденсации (5) использовали подвижную фазу от 5:1 до 2:1хлористый метилен : метанол. Для выделения красителя (6) использовали подвижную фазу (1:2)хлористый метилен : метанол. Полученный моноанил (5) и краситель(6)представляют собой ярко окрашенные твердые вещества. Они были охарактеризованы электронными спектрами поглощения. Продукт моноконденсации(5)имеет максимум поглощения лmax=680нм(метанол), краситель (6) лmax=815нм(метанол).

Выход соединения (5) составил38% от теории, а красителя (6) - 30%.

Экспериментальная часть

Синтез 4-(1,1,2-триметил-1H-бензо[e]индол-3-им-3-ил)бутан-1-сульфоната

1 г (0,0046 моль)1,1,2-триметил-1H-бензо[e]индола(1) смешали с 0,7 г (0,005 моль) бутансультона (2) и нагревали при 120?Св 3 мл дихлорбензола в течение 8 часов. К реакционной смесидобавили CH2Cl2(10 мл), образовавшийся осадок соли (4-(1,1,2-триметил-1H-бензо[e]индол-3-им-3-ил)бутан-1-сульфоната) отфильтровали,, промылиCH2Cl2 до обесцвечивания раствора, высушили. Выход 1,23 г (70%). Спектр ЯМР 1H (DMSO-d6, д, м.д.): 1.75 (с, 6H, 2 СН3), 2.02 (уш. с, 2H СН2), 2.50 (уш.с, 3H, СН3), 2.95 (уш. с, 2H СН2), 3.41 (уш. с, 2H СН2), 4.61 (уш.с, 2H, СН2N+), 7.71 - 7.77 (м, 2H, аром.), 8.21 -8.35 (м, 4H, аром).

Синтез 4-(2-((E)-2-((E)-2-хлор-3-((фениламмоний)метилен)циклогекс -1-ен-1-ил)винил)-1,1-диметил-1H-бензо[e]индол-3-им-3-ил)бутан-1-сульфохлорида (6)

0,5 г (0,0014 моль) соли (3) смешали с 0,75 г (0,00315 моль)N-[(E)-{2-хлор-3-[(фениламино)метил]циклогекс-2-ен-1-илиден}метил]анилин гидрохлоридомс 0,23 г (0,0028 моль) ацетата натрия. К полученной сухой смеси добавили 25 мл ацетонитрила и выдержали при комнатной температуре в течение 6 часов. Полученную смесь разделяли колоночной хроматографией. Выход 4-(2-((E)-2-((E)-2-хлор-3-((фениламмоний)метилен)циклогекс-1-ен-1-ил)винил)-1,1-диметил-1H-бензо[e]индол-3-им-3-ил)бутан-1-сульфонат (5) - составил 0.32 г (51% от теоретического), красителя (6)- 0.19 г 30 %.

Выводы

1. Собрана и проанализирована литература по синтезам: 4-(2-((E)-2-((E)-2-хлор-3-((фениламмоний)метилен)циклогекс -1-ен-1-ил)винил)-1,1-диметил-1H-бензо[e]индол-3-им-3-ил)бутан-1-сульфохлорида, индоцианина зеленого.

2. В результате двухстадийного синтеза был получен индоцианин зеленый.

3. Структура полученного соединения доказана методом ЯМР- спектро-скопии и электронным спектром поглощения.

Список литературы

1. R. Weissleder, V. Ntziachristos. Shedding light onto live molecular targets // Nat. Med - 2003 - Vol.9 - №1 - P.123-128.

2. A. Mishra, R. K. Behera, P. K. Behera, B. K. Mishra, G. B. Behera. Cyanines during the 1990s: a review// Chem. Rev. - 2000 - Vol.100 - №6 - P.1973-2012.

3. R. Pandey, N. James, Y. Chen, M. Dobhal. Cyanine dye-based compounds for tumor imaging with and without photodynamic therapy// Top. Geterocycl. Chem. - 2008 - Vol.14 - №27 - P.41-74.

4. V. Ntziachristos, J. Ripoll, L. V. Wang, R. Weissleder. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging// Nat. Biotechnol. - 2005 - Vol.23 - №4 - P.313-320.

5. A. P. Gorka, R. R. Nani, M. J. Schnermann. Cyanine polyene reactivity: scope and biomedical applications// Org. & Biomol. Chem. - 2015 - Vol.13 - №28 - P.7584-7598.

6. S. L. Luo, E. L. Zhang, Y. P. Su, T. M. Cheng, C. M. Shi, Biomaterials. A review of NIR dyes in cancer targeting and imaging
biomaterials// Elsevier - 2011 - Vol.32 - №29 - P.7127-7138.

7. V. J. Pansare, S. Hejazi, W. J. Faenza, R. K. Prud'homme. Review of long-wavelength optical and NIR imaging materials: contrast agents, fluorophores, and multifunctional nano carriers// Chem. Mater. - 2012 - Vol.24 - №5 - P.812-827.

8. T. G. Deligeorgiev, N. I. Gadjev, I. I. Timtcheva, V. A. Maximova, H. E. Katerinopoulos. Synthesis of homodimeric monomethine cyanine dyes as noncovalent nucleic acid labels and their absorption and fluorescence spectral characteristics// Dyes & Pigments - 2000 - Vol.44 - №2 - P.131-136.

9. J. O. Escobedo, O. Rusin, S. Lim, R. M. Strongin. NIR dyes for bioimaging applications// Curr. Opin. Chem. Biol. - 2010 - Vol.14 - №1 - P.64-70.

10. S. A. Hilderbrand, R. Weissleder. Near-infrared fluorescence: application to in vivo molecular imaging// Curr. Opin. Chem. Biol. - 2010 - Vol.14 - №9 - P.71-79.

11. C. Pavlika, N. C. Biswalb, F. C, Gaenzlera, M. D. Mortona, L. T. Kuhnc, K. P. Claffeyd, Q. Zhub, M. B. Smitha. Synthesis and fluorescent characteristics of imidazole-indocyanine green conjugates// Dyes & Pigments - 2011- Vol. 89 - №1 - P.9-15.

12. H. Chen, W. Lin, H. Cui, W. Jiang. Development of unique xanthene-cyanine fused near-infrared fluorescent fluorophores with superior chemical stability for biological fluorescence imaging// Chem. Eur. J. - 2015 - Vol.21 - №2 - P.733-745

14. S. P. Gromov, M. V. Fomina, A. S. Nikiforov, A. I. Vedernikov, L. G. Kuz'mina, J. A. K. Howard. Synthesis of symmetrical cyanine dyes with two N-ammonioalkyl groups// Tetrahedron - 2013 - Vol.69 - №29 - P.5898-5907.

15. M. R. Mazie`res, C. Duprat, J. Bellan, J. G. Wolf. Synthesis and characterisation of new phosphonate labelled cyanines// Dyes & Pigments - 2007 - Vol.74 - №2 - P.404-409.

16. M. Panigrahi, S. Dash, S. Patel, B. K. Mishra. Syntheses of cyanines: a review// Tetrahedron - 2012 - Vol.68 - №3 - P.781-805.

17. D. Su, C. L. Teoh, A. Samanta, N-Y. Kang, S. J. Parka, Y. T. Chang. The development of a highly photostable and chemically stable zwitterionic near-infrared dye for imaging applications// Chem. Commun. - 2015 - Vol.51 - №19 - P.3989-3992.

18. J. O. Escobedo, O. Rusin, S. Lim, R. M. Strongin. NIR dyes for bioimaging applications// Curr. Opin. Chem. Biol. - 2010 - Vol.14 - №1 - P.64-70.

19. G. A. Reynolds, K. H. Drexhage. Stable heptamethine pyrylium dyes that absorb in the infrared// J. Org. Chem. - 1977 - Vol.42 - №5 - P.885-888.

20. С. М. Макин, И. И. Бойко, О. А. Шаврыгина. Исследование аминоформилирования непредельных альдегидов, 2-алкоксиальдегидов, их ацеталей и кетонов алициклического ряда // Журн. Орг. хим. - 1977 - Т.13 - №6 - С.1989-1992.

21. Kuzmin V.A., Golovina G.V., KostyukovA.A., Nekipelova T.D., Podrurina T.A., Kriveleva A.S., Matveeva E.D., Proskurnina M.V., Zefirov N.S. Spectral and Kinetic Parameters of Photoexcited Complexes of Albumin and Indotricarbocyanine Dye with Phosphonate Substituents// High Energy Chemistry - 2016 - Vol.50 - №4 - P.315-316.

22. С. М. Макин, А. И. Помогаев, «Успехи научной фотографии», 1983, 22, 27 23. H. Kim, J. H. Lee, H. Hyun, Y. Ashitate, G. Park, K. Robichaud, E. Lunsford, S. J. Lee, G. Khang, H. S. Choi. Near-Infrared Fluorescence Imaging for Noninvasive Trafficking of Scaffold Degradation// Sci. Rep. - 2013 - Vol.3 - №18 - P.1198-2016.

24. H. Chen, W. Lin, H.Cui, W. Jiang. Development of Unique Xanthene-Cyanine Fused Near-Infrared Fluorescent Fluorophores with Superior Chemical Stability for Biological Fluorescence Imaging// Chem. Eur. J. - 2015 - 21 - №2 - P.733-745.

25. C. Zhang, S. Wang, J. Xiao, X. Tan, Y. Zhu, Y. Su. Aggregation induced emission-based fluorescent nanoparticles: fabrication methodologies and biomedical applications // Biomaterials - 2010 - Vol.31 - №2 - P.191-208.

26. X. Yang, C. Shi, R. Tong, W. Qian, H. E. Zhau, R. Wang. Near Infrared Heptamethine Cyanine Dye-Mediated Cancer Imaging// Clin. Cancer Res. - 2010 - Vol.16 - №10 - P.2833-2844.

27. H. Lee, J. C. Mason, S. Achilefu. Synthesis and Spectral Properties of Near-Infrared Aminophenyl-, Hydroxyphenyl-, and Phenyl-Substituted Heptamethine Cyanines// J. Org. Chem. - 2008 - Vol.73 - №2 - P.723-725.

Приложение

Для соединения 5

Для соединения 6

Размещено на Allbest.ru