Синтез, строение, свойства и биологическая активность новых производных ароиламидинов и N-арилбензамидинов

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

14.04.02-Фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Синтез, строение, свойства и биологическая активность новых производных ароиламидинов и N-арилбензамидинов

Куваева Елена Владимировна

Санкт-Петербург - 2013

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации на кафедре органической химии.

Научный руководитель: Яковлев Игорь Павлович

доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты: Куклин Владимир Николаевич

доктор фармацевтических наук, профессор

кафедры фармацевтической химии

ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России

Смирнова Ирина Геннадьевна

кандидат фармацевтических наук,

директор СПб ГУЗ «Северо-Западный центр по

контролю качества лекарственных средств»

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Пермская государственная фармацевтическая академия Министерства здравоохранения Российской Федерации (614990, г.Пермь, ул. Полевая, 2)

Защита состоится «15» октября 2013 г. в 16-00 часов на заседании диссертационного совета Д.208.088.01 при ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 14, лит.А).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (197227, Санкт-Петербург, пр-т Испытателей, д.14).

Автореферат разослан «____» __________ 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета Д 208.088.01,

кандидат фармацевтических наук, доцент Марченко Наталья Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Амидины обладают высокой биологической активностью. Амидиновый фрагмент (обычно в составе гетероцикла) входит в структуру многих лекарственных препаратов, например, нафтизина, галазолина, фентоламина, хлордиазепоксида. Многие из амидинов гидросульфонатов используются в химиотерапии.

Производное ацетамидина (фенокаин) широко используется в офтальмологической практике в качестве местного анестезирующего средства. Циклические амидины, выделенные из плодового тела «американского гриба» известны как антибактериальные и антигельминтные средства. Так же известно, что структурные аналоги циклических амидинов обладают противопротозойной, антидепрессантной и антигипертензивной активностью.

В то же время методы получения амидинов, известные из литературы, не носят систематического характера, а результаты изучения их строения, на наш взгляд, нельзя считать строго обоснованными, что является несомненным пробелом в изучении этой интересной группы органических соединений, тем более, что многие из них являются исходными веществами в синтезе гетероциклических соединений, таких, например, как гидрок-сипиримидины, имидазолы.

Поэтому разработка эффективных методов получения таких соединений, изучение их строения, свойств и биологической активности, установление связи «строение-свойства-биологическая активность» являются актуальными.

Цель и задачи исследования

Целью работы является разработка эффективных методов получения ароиламидинов, N-арилбензамидинов и их гидрохлоридов, изучение их строения, свойств и биологической активности.

Для этого надо было решить следующие основные задачи:

Изучить реакции арилнитрилов с аммиаком и ариламинами как метод получения ароиламидинов и N-арилбензамидинов.

Осуществить синтез ранее неописанных N-арилбензамидинов гидрохлоридов. ароиламидин реакция биоактивность программа

Доказать строение синтезированных соединений с помощью современных методов анализа: ИК, УФ, ЯМР спектроскопии, масс-спектрометрии, рентгеноструктурного анализа (РСА).

Установить потенциал биоактивности полученных соединений путем компьютерного анализа с помощью программы PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances) и оригинальной программы докинга FlexX.

Провести изучение некоторых видов биологической активности синтезированных веществ и определить их острую токсичность. Установить взаимосвязь «строение - биологическая активность».

Разработать методики качественного и количественного определения полученных биологически активных веществ.

Научная новизна

Получен ряд новых производных ароиламидинов, N-арилбензамидинов и их гидрохлоридов. Доказано их строение, исследованы свойства и биологическая активность.

Впервые показано, что:

Ароиламидинов гидрохлориды удобно получать взаимодействием арилнитрилов с абсолютным этиловым спиртом и сухим хлороводородом в среде безводного бензола или эфира с последующей обработкой полученных промежуточных имидоэфиров спиртовым раствором аммиака.

Возможность и направление реакции бензонитрила с ариламинами определяется электронной природой заместителя в молекулах последних и является термодинамически контролируемой реакцией, позволяющей получать N-арилбензамидины с максимальным выходом при t0=1800С.

Острая токсичность ароиламидинов, N-арилбензамидинов и их гидрохлоридов (LD50=10ч2650 мг/кг) существенно зависит от электронной природы заместителя в арильном фрагменте.

Полученные соединения проявляют выраженное антимикробное, противовоспалительное и анальгезирующее действие. N-4-Нитрофенилбензамидин обладает антикоагулянтной активностью.

Практическая значимость

Разработаны эффективные методы получения новых производных ароиламидинов, N-арилбензамидинов и их гидрохлоридов. Среди них обнаружена новая группа малотоксичных антимикробных, противовоспалительных и анальгезирующих веществ. Предложены методики стандартизации наиболее перспективного с точки зрения биологической активности - N-4-нитрофенилбензамидина.

Апробация работы

Результаты работы представлены на VI Международной научно-практической конференции «Vedecky pokrok na rozmezi tisicileti - 2010» (Прага, 2010); Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Актуальные проблемы органической химии» (Казань, 2010); Научно-практической конференции, посвященной 65-летию факультета промышленной технологии лекарств (Санкт-Петербург, 2010); Научной конференции студентов и аспирантов (Санкт-Петербург, 2011); VII Международной научно-практической конференции «Nauka i inowacja - 2011» (Перемышль, 2011); Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего» (Санкт-Петербург, 2011); Всероссийской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии» (Санкт-Петербург, 2011); Научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию Пермской государственной фармацевтической академии «Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации» (Пермь, 2011); II-ой Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего» (Санкт-Петербург, 2012); IV Съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012); III-ой Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего» (Санкт-Петербург, 2013).

Публикации

Основное содержание диссертации представлено в 19 публикациях, в том числе 2 патента, 2 статьи в журналах, входящих в перечень рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, рекомендованный ВАК РФ.

Связь задач исследования с планом фармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России «Получение и изучение фармакологического действия биологически активных веществ (БАВ) с целью создания инновационных лекарственных средств» (номер государственной регистрации НИР;01201252027).

Основные положения, выносимые на защиту:

Разработка методов синтеза ароиламидинов, N-арилбензамидинов и их гидрохлоридов.

Доказательство строения синтезированных соединений с помощью современных методов анализа: ИК, УФ, ЯМР спектроскопии, масс-спектрометрии, РСА.

Изучение острой токсичности, антимикробной, противогрибковой, противовоспалительной, анальгезирующей и антикоагулянтной активностей полученных ароиламидинов, N-арилбензамидинов и их гидрохлоридов.

Методики стандартизации субстанции N-4-нитрофенилбензамидина.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 144 страницах машинописного текста, включает 36 таблиц, иллюстрирована 66 рисунками и состоит из введения, обзора литературы по теме исследования и 4 глав собственных исследований, экспериментальной части, заключения, списка литературы и приложений. Список литературы включает 117 источников, в том числе 88 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение

Во введении приведены актуальность, цель и задачи исследования, его научная и практическая значимость.

Глава 1 Обзор литературы

В обзоре литературы обсуждаются методы получения различных амидинов и их производных. Особое внимание уделено изучению строения, свойствам и биологической активности этих соединений.

Глава 2 Синтез и строение ароиламидинов, N-арилбензамидинов и их гидрохлоридов

2.1 Синтез ароиламидинов гидрохлоридов

Ранее (Платэ, 1949) было показано, что имидоэфиры взаимодействуют со спиртовым раствором аммиака с образованием соответствующих амидинов гидрохлоридов.

В ходе проведенных нами исследований было установлено, что синтез ароиламидинов гидрохлоридов (III а-д) необходимо проводить при точных мольных соотношениях абсолютного этилового спирта и сухого хлороводорода, иначе синтезируемые имидоэфиры не кристаллизуются. Большое значение при проведении обсуждаемой реакции необходимо придавать подбору растворителя, так как исходные нитрилы (I в-д) являются твердыми кристаллическими соединениями. Использовать в качестве растворителя абсолютный этиловый спирт не желательно, при его избытке происходит растворение получаемых имидоэфиров (II в-д), и в дальнейшем выделить их из реакционной массы не возможно. В связи с этим в качестве растворителей нами были использованы бензол или эфир (рисунок 1).

Рисунок 1 - Схема синтеза ароиламидинов гидрохлоридов

2.2 Синтез N-арилбензамидинов

N-арилбензамидины (V а-л) были получены обработкой ариламинов (IV а-л) бензонитрилом (Iа) в присутствии безводного хлорида алюминия (рисунок 2).

Рисунок 2 - Схема синтеза N-арилбензамидинов

Оказалось, что строение ариламинов влияет не только на выход амидинов, но иногда и на возможность их получения. Так, наличие нитрогруппы в о-положении анилина настолько понижает его реакционную способность, что ожидаемый амидин получить не удается.

Минимальная температура, при которой возможно получение монозамещенных

N-арилбензамидинов (V а-л) составляет 1500С. Максимальные выходы продуктов (67-97%) были получены при температуре 1800С. Увеличение температуры свыше 2000С приводит к получению смеси монозамещенных N-арилбензамидинов (V а-л) и побочных продуктов N,N'-дизамещенных амидинов (VI а-з, к, л) (рисунок 3).

Рисунок 3 - Схема синтеза N-арилбензамидинов и N,N'-диарилбензамидинов

Так, если реакцию бензонитрила (Iа) с ариламинами (IV а-л) проводить при t0= 2300С соотношение полученных N-арилбензамидинов (V а-л) и побочных продуктов N,N'-ди-арилбензамидинов (VI а-з, к, л) составляет 80% и 20% соответственно. Повышение температуры до 2500С приводит к увеличению выхода N,N'-диарилбензамидинов до 50%, а увеличение температуры свыше 2700С приводит к осмолению реакционной массы.

Смесь амидинов была разделена на колонке с силикагелем (гексан/этилацетат - 9:1).

2.3 Синтез N-арилбензамидинов гидрохлоридов

Низкая растворимость полученных N-арилбензамидинов в воде и большинстве органических растворителей является существенным недостатком этих соединений с позиции создания новых лекарств. Наиболее эффективным преодолением этого является изменение баланса липофильно-гидрофильных свойств путем введения в их молекулы различных заместителей, изменяющих биологическую активность веществ, их транспорт и биодоступность в организме или получение солей, обладающих более высокой растворимостью, чем соответствующие N-арилбензамидины.

Нами было установлено, что N-арилбензамидины гидрохлориды (VII а-л) можно получить при пропускании сухого хлороводорода через суспензию N-арилбензамидинов (V а-л) в абсолютном этиловом спирте (рисунок 4).

Рисунок 4 - Схема синтеза N-арилбензамидинов гидрохлоридов

2.4 Строение полученных амидинов и их солей

Строение полученных веществ доказано нами с помощью методов ЯМР 1Н, 13C,

15N-HSQC, ИК спектроскопии, РСА. Индивидуальность - методом ТСХ, состав - методом элементного анализа и масс-спектрометрией.

2.4.1 Строение ароиламидинов гидрохлоридов

Наиболее характеристичными сигналами в спектрах ЯМР 1Н растворов соединений (III а-д) в ДМСО-d6 являются сигналы протонов групп =NH2+ и -NH2 (9.29-9.90 м.д.), протонов ароматического кольца (7.25-8.38 м.д.).

Так, например, в спектре ЯМР 1Н раствора соединения (IIIб) в ДМСО-d6 (рисунок 5) наблюдаются сигналы протонов СН3-группы (2.36 м.д.), сигналы протонов групп =NH2+ и -NH2 (9.49 и 9.30 м.д.), сигналы протонов ароматических колец (7.37-7.80 м.д.).

Рисунок 5 - Спектр ЯМР 1Н раствора 4-метилбензамидина гидрохлорида (IIIб) в ДМСО- d6

В спектрах ЯМР 13С соединений (III а-д) в ДМСО-d6 наблюдаются сигналы атома углерода СН3-группы (21.56 м.д.), сигналы атомов углерода бензольного кольца (123.17-136.01 м.д.) и сигнал атома углерода амидинового фрагмента (165.92-166.54 м.д.).

Для ИК спектров ароиламидинов гидрохлоридов (III а-д) характерны полосы поглощения при 1675-1680 см-1, обусловленные валентными колебаниями связей С=N, полосы поглощения в области 3050-3400 см-1, обусловленные валентными колебаниями связей

N-H в группах -NH2 и =NH.

2.4.2 Строение N-арилбензамидинов и их солей

Потенциально N-арилбензамидины и их гидрохлориды могут существовать в двух таутомерных формах (А, Б).

Авторы работ (ZhouL., ZhangY. // Synth.Commun. 1998. V. 28. P. 3249; Wang J., Xu F., Cai T., Shen Q.// Org. Lett. 2008. V. 20. P. 445-448) отдают предпочтение таутомеру Б без достаточных, на наш взгляд, оснований. Для превращения таутомера Б в таутомер А используется катализатор сложного строения.

Спектры ЯМР 1Н N-арилбензамидинов (V а-л) в ДМСО-d6 позволяют говорить о том, что эти соединения существуют преимущественно в N-арилимино-аминной таутомерной форме, так как в спектрах присутствует уширенный сигнал в области ~5.88-6.73 м.д., который можно отнести к протонам группы NH2.

На рисунке 6 представлен спектр ЯМР 1Н N-4-метилфенилбензамидина (Vж) в ДМСО-d6, в котором наблюдаются сигналы протонов СН3-группы (2.28 м.д.), сигналы протонов ароматических колец (6.75-7.97 м.д.). Наличие одного уширенного сигнала при 6.20 м.д. с интегральной интенсивностью ~2Н может быть связано с тем, что это соединение в растворе ДМСО-d6 существует в преобладающей таутомерной форме А.

Рисунок 6 - Спектр ЯМР 1Н раствора N-4-метилфенилбензамидина (Vж) в ДМСО- d6

Для более строгого доказательства строения N-арилбензамидинов (V а-л) в растворах нами была использована двумерная корреляционная спектроскопия 15N-HSQC (рисунок 7), которая также свидетельствует о том, что соединения (V а-л) существуют в основном в таутомерной форме А. В спектре 15N-HSQC N-4-метилфенилбензамидина (Vж) наблюдается всего один корреляционный пик между сигналом атома азота 15N и сигналом связанных с этим атомом протонов в соответствующих спектрах ЯМР 1Н.

Рисунок 7 - Спектр 15N-HSQC раствора N-4-метилфенилбензамидина (Vж) в ДМСО-d6

Основным отличием спектров ЯМР 1Н N-арилбензамидинов гидрохлоридов (VII а-л) в ДМСО-d6 от спектров N-арилбензамидинов (V а-л) является присутствие в слабом поле трех сигналов в области ~8.66-12.36 м.д., протонов групп =NH, -NH и протонов HCl.

На рисунке 8 представлен спектр ЯМР 1Н N-4-метоксифенилбензамидина гидрохлорида (VIIк) в ДМСО-d6, в котором наблюдаются сигналы протонов ОСН3-группы (3.82 м.д.), сигналы протонов ароматических колец (7.11-7.97 м.д.). Наличие трех сигналов при 8.82 м.д., 9.84 м.д. и 11.58 м.д. с интегральной интенсивностью ~1Н может быть связано с тем, что это соединение в растворе ДМСО-d6 имеет преобладающую N-ариламино-иминную протонированную форму (Б).

Рисунок 8 - Спектр ЯМР 1Н раствора гидрохлорида N-4-метоксифенилбензамидина (VIIк) в ДМСО- d6

В спектрах ЯМР 13С соединений (V а-л, VII а-л) в ДМСО-d6 помимо сигналов атомов углерода бензольных колец в области ~114.07-151.78 м.д., сигналов атомов углерода метильных и метокси групп (~16.98-17.98 и 55.59-55.98 м.д.) в слабом поле при ~151.15-163.92 м.д. наблюдаются сигналы атомов углерода амидинового фрагмента -С=N(-N), а также сигналы атомов углерода карбоксильной группы в области ~154.14-156.65 м.д.

Строение полученных N-арилбензамидинов (V а-л) и N-арилбензамидинов гидрохлоридов (VII а-л) в кристаллическом состоянии было однозначно доказано монокристальным рентгеноструктурным анализом (рисунок 9, 10). Полученные результаты свидетельствуют о том, что N-арилбензамидины существуют в N-арилимино-аминой таутомерной форме (А), тогда как структура соответствующих солей (VII а-л) больше соответствует протонированной форме (Б). В ходе проведенных исследований были определены величины длин связей, валентных и торсионных углов.

Рисунок 9 - Молекулярное строение N-4-нитрофенилбензамидина (Vи)

Рисунок 10 - Молекулярное строение N-4-метилфенилбензамидина гидрохлорида(VIIж)

В ИК спектрах амидинов (V а-л, VII а-л) наблюдается полоса поглощения при 1600-1680 см-1, обусловленная валентными колебаниями связи С=N, а также полосы поглощения, характерные для валентных колебаний связей N-H в группах -NH2 , -NH-Ar и в группе =NH в области 3200-3550 cм-1.

Глава 3 Биологическая активность полученных соединений

3.1 Острая токсичность

Изучение острой токсичности синтезированных амидинов и их гидрохлоридов проводилось на белых мышах-самцах массой 16-20 г. Расчет средней летальной дозы (LD50) проводили с помощью пробит-анализа по методу Миллера-Тейтнера. Установлено, что острая токсичность N-арилбензамидинов (V а, г, ж, и, л) существенно зависит от электронной природы заместителя в четвертом положении арильного фрагмента. Увеличение акцепторного характера заместителя резко уменьшает токсичность синтезированных

N-арилбензамидинов (LD50 = 10-2642 мг/кг), что линейно связано с уменьшением констант основности для этих соединений (рисунок 11).

Рисунок 11 - Зависимость LD50 от рКа N-арилбензамидинов (V а, г, ж, и, л)

Таблица 1 - Токсичность амидинов и их солей

Соединение	LD50
Формула	R	№
	NO2	V и	2642
	COOH	V л	750
	Br	V г	245
	H	V а	76,2
	CH3	V ж	10
	NO2	VII и	480
	H	VII а	152
	CH3	VII ж	50
	NO2	III г	224
	H	III а	589
	CH3	III б	186

Аналогично, но не так существенно, под влиянием заместителей меняется острая токсичность полученных солей N-арилбензамидинов ( VII а, и, ж). Токсичность ароиламидинов гидрохлоридов увеличивается при введение в структуру соединения как донорных, так и акцепторных заместителей (таблица 1).

Антимикробная, фунгицидная и фунгистатическая активности ароиламидинов, N-арилбензамидинов и их гидрохлоридов

Минимальные подавляющие концентрации (МПК) определяли методом серийных разведений в жидкой питательной среде - мясопептонном бульоне (МПБ) с последующим высевом на агаризованные среды. В качестве тест-микроорганизмов были выбраны грамположительные бактерии Staphylococcus aureus штамм P 209 и грамотрицательные бактерии Escherichia coli ATCC 25922. Штаммы тест-организмов были выбраны в соответствии с рекомендациями ГФ XI.

Минимальные подавляющие концентрации ароиламидинов гидрохлоридов и N-арил-бензамидинов находятся на уровне или ниже широко используемых на практике антибиотиков (аминогликозиды 0.2-3.2 мкг/мл (E. coli) и 0.1-1.6 мкг/мл (St. aureus)); фторхинолоны 0.016-0.500 мкг/мл (E. coli) и 0.06-0.52 мкг/мл (St. aureus)), что может представлять несомненный интерес, так как токсичность некоторых полученных нами веществ ниже представленных препаратов сравнения (рисунок 12).

Из результатов, представленных на рисунке 12 видно, что наличие акцепторного заместителя в 4 положении арильного фрагмента амидинов приводит к повышению антимикробной активности.

N-Арилбензамидины гидрохлориды не проявляют выраженной антимикробной активности (МПК >100 мкг/мл).

Для определения фунгицидной и фунгистатической активности синтезированных амидинов исследовали их влияние в различных концентрациях на активные штаммы микромицетов. Из полученных результатов была выявлена достоверная стимуляция роста Penicillium expansum: N-4-метилфенилбензамидин (Vж) в принятой концентрации, 4-нитро-бензамидина гидрохлорид (IIIг) во всех концентрациях, 4-метилбензамидина гидрохлорид (IIIб) в принятой концентрации. Был отмечен фунгистатический эффект для микромицета Aspergillus niger: N-4-нитрофенилбензамидин (Vи) во всех концентрациях, N-4-метил-фенилбензамидин (Vж) в удвоенной концентрации, 4-нитробензамидина гидрохлорид (IIIг) в принятой и удвоенной концентрациях, 4-метилбензамидина гидрохлорид (IIIб) - во всех концентрациях.

Фунгицидный эффект отсутствует для всех веществ и доз.



Рисунок 12 - Антимикробная активность синтезированных амидинов

3.3 Противовоспалительная активность

Противовоспалительную активность исследовали на скрининговой модели -- формалиновый отек лапы у крыс.

Исследуемый нативный раствор вводили крысам внутрибрюшинно в виде водного раствора ароиламидинов гидрохлоридов (III а, б, г) или в виде суспензии в ДМСО : вода (1:5) N-арилбензамидинов (V а, и) в дозе 1/10 от LD50 ( от 7.62 до 264.20 мг/кг). Препарат сравнения - диклофенак - вводили в дозе 25 мг/кг.

Полученные соединения обладают выраженной противовоспалительной активностью (рисунок 13). Большой интерес представляют амидины, которые имеют низкую токсичность и высокую активность по сравнению с препаратом сравнения (диклофенак).

Рисунок 13 - Противовоспалительная активность ароиламидинов

гидрохлоридов (III а, б, г) и N-арилбензамидинов (V а, и) в дозе 1/10 от LD50

3.4 Анальгезирующая активность

Для экспериментальной оценки анальгезирующей активности исследуемых ароиламидинов гидрохлоридов (IIIа, б, г), N-арилбензамидинов (V а, и, л) и N-арилбензамидинов гидрохлоридов (VII а, и) использовали модель генерации уксуснокислых «корчей» у мышей-самцов. Суспензию исследуемого соединения в дозе 1/10 и 1/50 от LD50 (от 3.81 до 264.20 мг/кг) вводили внутрибрюшинно и через 40 минут внутрибрюшинно вводили 0.2 мл 3 %-го раствора уксусной кислоты. Наблюдали за животными 20 минут. В ходе эксперимента регистрировали время начала судорог и количество судорог за временной интервал. Препаратом сравнения являлся метамизол натрия (100 мг/кг).

Из полученных результатов (рисунок 14) следует, что анальгезирующей активностью обладают бензамидина гидрохлорид (IIIа), 4-метилбензамидина гидрохлорид (IIIб) и

N-4-нитрофенилбензамидин (Vи), которые уменьшали число судорог у животных на 86.5%-64.9% по сравнению с контролем. Таким образом, данные соединения обладает выраженным анальгезирующим действием, так как уменьшение количества судорог находится на уровне или чуть ниже препарата сравнения метамизола натрия.



Рисунок 14 - Анальгезирующая активность амидинов и их гидрохлоридов

3.5 Антикоагулянтная активность

Виртуальный скрининг антикоагулянтной активности синтезированных соединений осуществлялся при помощи оригинальной программы докинга FlexX. Для белков с известной трехмерной структурой и низкомолекулярных молекул лигандов FlexX точно и быстро предсказывает геометрию белок-лиганд.

В результате вычислительного эксперимента было установлено, что только N-4-нитрофенилбензамидин (Vи) обладает антикоагулянтной активностью.

Несмотря на близкое сходство химической структуры соединений в их взаимодействиях с белком имеются существенные различия (рисунок 15). Связывание

N-4-нитрофенилбензамидина (Vи) в активном центре фермента происходит за счет взаимодействия с боковыми цепями аминокислотных остатков Trp 60A, Trp 60D и образования водородной связи с Gly 216 в «S3 кармане фермента», что характерно для многих известных ингибиторов тромбина. Напротив, связывание других соединений (на рисунке 15 рассмотрено на примере N-3-нитрофенилбензамидина (Vз)) происходит за счет иных групп, ранее не описанных в литературе как характерных для известных ингибиторов. Из чего можно сделать вывод, что остальные бензамидины не будут проявлять активность по отношению к тромбину.

Рисунок 15 - Антикоагулянтная активность N-4-нитрофенилбензамидина (Vи) иN-3-нитрофенилбензамидина (Vз)

Для экспериментального подтверждения теоретических результатов нами была проверена величина протромбинового времени, характеризующая свертываемость крови у интактных лабораторных крыс после многократного (5-дневного) введения исследуемых соединений. Было установлено, что из всего ряда соединений только N-4-нитро-фенилбензамидин проявляет (Vи) антикоагулянтную активность, что полностью согласуется с результатами виртуального скрининга.

Глава 4 Методы стандартизации N-4-нитрофенилбензамидина (Vи)

Для наиболее перспективного соединения с точки зрения биологической активности N-4-нитрофенилбензамидина (Vи) были разработаны методики оценки качества и количественного определения. N-4-Нитрофенилбензамидин - коричнево-красный порошок, умеренно растворим в хлористоводородной кислоте разведенной 10%, мало растворим в этаноле 96%, н-гексане и ацетоне, практически не растворим в воде Для определения подлинности вещества (Vи) можно использовать качественную реакцию диазотирования с последующим азосочетанием, а также методы ТСХ, УФ, ИК и ЯМР 1Н спектроскопии. Отсутствие посторонних примесей целесообразно контролировать с помощью ТСХ и ГЖХ. Количественное определение проводили методами потенциометрического титрования и УФ спектрофотометрии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основные итоги диссертационной работы сводятся к следующим основным положениям:

Разработаны новые технологичные методы синтеза ароиламидинов, N-арил-бензамидинов и их гидрохлоридов.

Ароиламидинов гидрохлориды удобно получать взаимодействием арилнитрилов с этиловым спиртом и сухим хлороводородом в безводном бензоле или эфире с последующей обработкой промежуточных имидоэфиров спиртовым раствором аммиака.

Возможность и направление реакции бензонитрила с ариламинами определяется электронной природой заместителя в молекулах последних и является термодинамически контролируемой реакцией, позволяющей получать N-арилбензамидины с максимальным выходом при t0=1800С.

N-Арилбензамидинов гидрохлориды целесообразно получать взаимодействием суспензии N-арилбензамидинов в абсолютном этиловом спирте с сухим хлороводородом.

По данным ЯМР 1Н, 13С, 15N-HSQC спектрам, РСА N-арилбензамидины существуют в N-арилимино-амино таутомерноной форме, а их гидрохлориды в N-ариламино-иминной таутомерной форме.

Острая токсичность полученных N-арилбензамидинов и их солей существенно зависит от электронной природы заместителя в четвертом положении арильного фрагмента. Увеличение электроноакцепторного характера заместителя уменьшает токсичность синтезированных соединений. Токсичность ароиламидинов гидрохлоридов увеличивается при введении в их структуру как донорных, так и акцепторных заместителей.

Полученные амидины и их соли проявляют выраженные антимикробное, противовоспалительное и анальгезирующие действия. N-4-Нитрофенилбензамидин обладает антикоагулянтной активностью.

Разработаны методы стандартизации N-4-нитрофенилбензамидина.

Результаты данного диссертационного исследования могут быть рекомендованы для внедрения в учебный процесс в курс органической химии для студентов 2 и 3 курсов фармацевтического факультета и факультета промышленной технологии лекарств.

Перспективы дальнейшей разработки темы диссертационного исследования включают в себя следующие основные научно-исследовательские направления, имеющие важное практическое значение: создание лекарственных средств на основе наиболее перспективного с точки зрения биологической активности N-4-нитрофенилбензамидина. Изучение острой токсичности и биологической активности N,N'-диарилбензамидинов. Использование полученных амидинов как синтонов в синтезе новых биологически активных производных гидроксипиримидинов и имидазолов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Патент №2480452 РФ. Способ получения N-4-нитрофенилбензамидина.

Патент №2481104 РФ. Антимикробное, противовоспалительное и анальгезирующее средство на основе N-4-нитрофенилбензамидина.

Куваева, Е.В. Особенности синтеза N-арилбензамидинов / Е.В. Куваева, Е.В. Федорова, И.П. Яковлев, Е.Н. Кириллова, Г.В. Ксенофонтова, В.И. Захаров // Известия Санкт-Петербургского государственного технологического института (технологического университета). - Санкт-Петербург, 2012. - № 14(40). - С. 58-61.

Куваева, Е.В. Компьютерный прогноз и экспериментальная проверка биологической активности новых производных N-арилбензамидинов / Е.В. Куваева, Е.В. Федорова, А.В. Бурякина, Д.Д. Ваулина, Г.В. Ксенофонтова, Т.Л. Семакова // Материалы IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». - Казань, 2012. - С. 105-106.

Куваева, Е.В. Влияние строения N-арилбензамидинов на антимикробную активность / Е.В. Куваева, Е.В. Федорова, С.В. Гурина, И.П. Яковлев, А.Э. Потапова // Материалы IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». - Казань, 2012. - С. 106.

Куваева, Е.В. Синтез и противовоспалительная активность производных пиримидин-4,6-дионов / Е.В. Куваева // Материалы II-ой Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего». - Санкт-Петербург, 2012. - Ч.III - С.15-16.

Куваева, Е.В. Установление связи строения-свойства-биологическая активность

N-арилбензамидинов / Е.В. Куваева, Е.В. Федорова, А.Э. Потапова, М.В. Сопова, И.П. Яковлев // Материалы научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию Пермской государственной фармацевтической академии «Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации». - Пермь, 2011. - С.106-107.

Федорова, Е.В.Установление связи строения-свойства-биологическая активность некоторых 4,6-дигидроксипиримидинов / Е.В. Федорова, Е.В. Куваева, Т.Л. Семакова, Г.В. Ксенофонтова, А.Г. Козьмина // Материалы научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию Пермской государственной фармацевтической академии «Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации». - Пермь, 2011. - С.165-167.

Куваева, Е.В. Синтез и строение гидрохлоридов ароиламидинов и N-арил-бензамидинов / Е.В. Куваева, Е.В. Федорова, В.В. Зайцев, И.П. Яковлев, В.И. Захаров, Т.Л. Семакова // Журнал органической химии. - Санкт-Петербург, 2011. - Т.48. - С. 221-225.

Куваева, Е.В. Влияние температуры на синтез N-арилбензамидинов / Е.В. Куваева, Е.В. Федорова, Е.Н. Кириллова, В.В. Зайцев // Тезисы докладов Российская научная конференция с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии». - Санкт-Петербург, 2011. - С.18.

Куваева, Е.В. Синтез моно- и дизамещенных N-арилбензамидинов / Е.В. Куваева // Материалы Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего». - Санкт-Петербург, 2011. - С.137-138.

Федорова, Е.В. Кислотные свойства некоторых 4,6-дигидроксипиримидинов / Е.В. Федорова, Е.В. Куваева, Г.М. Алексеева, Г.В. Ксенофонтова // Материалы VII Международной научно-практической конференции «Naukaiinowacja- 2011». - Перемышль, 2011. - С.43-45.

Куваева, Е.В. Изучение основных свойств N-арилбензамидинов / Е.В. Куваева, Е.В. Федорова, В.Ф. Апраксин, И.П. Яковлев, Т.Л. Семакова // Материалы VII Международной научно-практической конференции «Naukaiinowacja- 2011». - Перемышль, 2011. - С.45-47.

Куваева, Е.В. Синтез и строение замещенных бензамидинов и N-арил-бензамидинов / Е.В. Куваева // Тезисы докладов научной конференции студентов и аспирантов. - Санкт-Петербург, 2010. - С.45-46.

Куваева, Е.В. Амидины. Синтез и строение / Е.В. Куваева, Е.В. Федорова, И.П. Яковлев, Г.В. Ксенофонтова, Т.Л. Семакова // Материалы научно-практической конференции, посвященной 65-летию факультета промышленной технологии лекарств. - Санкт-Петербург, 2010. - С.102-105.

Куваева, Е.В. Синтез новых производных пиримидин-4,6-дионов / Е.В. Куваева, Е.В. Федорова, А.Г. Козьмина, И.П. Яковлев // Материалы всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Актуальные проблемы органической химии». - Казань, 2010. С.99-100.

Федорова, Е.В.Особенности синтеза и строения ариламидинов и N-ариламидинов / Е.В. Федорова, Е.В. Куваева, Г.В. Ксенофонтова, В.В. Зайцев // Материалы всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Актуальные проблемы органической химии». - Казань, 2010. С.131-132.

Федорова, Е.В. Амидины в синтезе пиримидин-4,6-дионов / Е.В. Федорова, Е.В. Куваева, Г.В. Ксенофонтова, М.В. Сопова, В.В. Зайцев, А.С. Сибирякова // Материалы VI Международной научно-практической конференции «Vedeckypokroknarozmezitisicileti- 2010». - Прага, 2010. - С.64-66.

Куваева, Е.В. Амидины. Синтез и строение / Е.В. Куваева, Е.В. Федорова, А.Г. Козьмина, И.П. Яковлев, Ю.В. Клейменова, О.В. Морозова // Материалы VI Международной научно-практической конференции «Vedeckypokroknarozmezitisicileti- 2010». - Прага, 2010. - С.66-68.

Размещено на Allbest.ru