Размещено на http://www.allbest.ru/

Тема: Група речовин, що ізолюються з біологічного матеріалу полярними розчинниками

План лекції

1. Загальна характеристика групи. Фізичні і хімічні властивості речовини

2. Сучасні загальні і окремі методи ізолювання речовин групи з біологічного

матеріалу.Поділ групи на підгрупи

3. Фактори, що впливають на ефективність ізолювання речовин

4. Методи очищення витяжок від домішок і концентрування виділених речовин

1. Загальна характеристика групи. Фізичні і хімічні властивості речовин

До групи речовин, які ізолюються з 6іологічного матеріалу полярними розчинниками (водою, спиртом) відносяться лікарські речовини рослинного походження (алкалоїди) і синтетичні препарати (саліцилова кислота і її похідні, барбітурати, похідні піразолону, фенотіазину, 1,4-6енздиазепіну й ін.). Лікарські препарати мають різну дію на організм (наркотичні і ненаркотичні анальгетики, нейролептики, спазмолітики, анестетики, снотворні речовини й ін. ) лікарський речовина біологічний ізолювання

«Лікарські» отрути займають одне з перших місць серед токсичних речовин по кількості смертельних отруєнь, що обумовлено:

· приступністю препаратів в аптечній мережі, рослинах;

· передозуванням лікарських препаратів;

· самолікуванням хворих;

· індивідуальною непереносимістю окремих препаратів;

· сполученням з алкоголем і іншими лікарськими препаратами, що сповільнює

· метаболізм, потенціює токсичну дію речовин;

· явищами наркоманії і токсикоманії;

· випадками суїциду.

За фізико-хімічними властивостями «лікарські» отрути - це переважно білі або жовтуваті кристалічні порошки, які характеризуються різною розчинністю, кислотно-основними властивостями.

У полярних розчинниках - воді, спирті - добре розчинні солі речовин кислого й основного характеру (солі алкалоїдів, імідольна форма барбітуратів), що утворюють заряджені йони в розчинах.

В органічних розчинниках - хлороформ, ефір - добре розчинні лікарські речовини в нейонізованій формі (основи алкалоїдів, імідна форма барбітуратів).

Окремі «лікарські» отрути володіють властивістю леткості (похідні піридину і піперидину).

«Лікарські» отрути попадають в організм:

· через рот (таблетки, порошки, частини рослин);

· дихальні шляхи (нікотин, анабазин - при палінні; кокаїн - при явищі «кокаїнізму»);

· можуть бути введені парентерально, ректально.

Всмоктування, розподіл і локалізація отрут залежить від їхніх фізико-хімічних властивостей:

· речовини кислого характеру (саліцилова кислота, барбітурати) всмоктуються в шлунку (рН = 1);

· речовини основного характеру (алкалоїди, похідні фенотіазину, пара-амінобензойної кислоти) всмоктуються в тонкому кишечнику (рН = 5,07-7,07);

· нікотин і анабазин всмоктуються через слизові оболонки рота, в легенях.

Метаболізм «лікарських отрут» протікає головним чином в печінці. Розподіл і локалізація препаратів залежать від складу і функціональних особливостей органів і тканин. Добре розчинні в ліпідах токсичні речовини (барбітурати, похідні фенотіазину) легко проникають через мембрани клітин, швидко розподіляються в багатих ліпідами органах і тканинах, які добре забезпечуються кров'ю - у головному і кістковому мозку.

Локалізація ліків також залежить від характеру отруєння. При гострому отруєнні - в шлунку, кишковику, печінці, нирках, при хронічному - в головному, кістковому мозку.

Виводяться лікарські препарати в нативному вигляді й у вигляді метаболітів нирками, кишковиком і легенями.

Оскільки отрути поширюються в органах і тканинах нерівномірно, знання їх властивостей і поводження в організмі має велике значення для правильного вибору об'єктів хіміко-токсикологічного аналізу.

2. Сучасні загальні і окремі методи ізолювання речовин групи з біологічного матеріалу. Поділ групи на підгрупи

Для ізолювання «лікарських» отрут з біологічного матеріалу використовують загальні і окремі методи. До загальних методів ізолювання відносяться: екстракція водою (метод Васильєвої А.А. ) чи спиртом (метод Стаса-Отто), підкисленими оксалатною кислотою; екстракція амфіфільними розчинниками - ацетонітрилом (метод Сшедзинського) чи ацетоном (метод Карташова В.A.).

Широко впроваджені в практику хіміко-токсикологічного аналізу ліків методи екстракції підкисленими оксалатною кислотою, водою або спиртом; методи екстракції амфіфільними розчинниками є перспективними .

Ізолювання отрут екстракцій полярними розчинниками включає наступні етапи:

1. Підготовка зразка до дослідження: здрібнення органів трупа за допомогою ножиців, м'ясорубки, гомогенізатора.

2. Взяття наважки (1-100 в залежності від складу отруйної речовини в об'єкті і чутливості методів дослідження).

3. 2-3-х разова екстракція отрути підкисленним розчинником або без підкислення.

4. Об'єднання, проціджування і центрифугування екстракту.

5. Екстракція отрут з кислої водяної фази органічними розчинниками - одержання «кислого» хлороформного витягу.

6. Екстракція отрут з лужної водяної фази органічними розчинниками - одержання «лужного» хлороформного витягу.

При використанні в якості екстрагенту етанолу передбачене осадження білків абсолютним етанолом з концентрованої спиртової витяжки з наступним фільтруванням витягу і розведенням водою.

При використанні в якості екстрагенту ацетонітрилу передбачене висолювання отрут, для чого ацетонітрильна витяжка розводиться розчином натрій сульфату перед ектракцією отрут неполярними або малополярними розчинниками (гексаном, ефіром, хлороформом).

При використанні в якості екстрагенту ацетону домішки екстрагуються гексаном після розведення ацетонової витяжки розчином хлористоводневої кислоти. «Лікарські» отрути екстрагуються хлороформом або ефіром в присутності висолювача - натрій хлориду або натрій сульфату.

Метод Васильєвої А.А. не прийнятний для аналізу біологічного матеріалу, який піддався гнильним змінам, в зв'язку з утворенням стійких емульсій на стадії екстракції речовин з водяної витяжки органічним розчинником і недостатнім очищенням екстрактів.

Зазначений метод мало придатний для аналізу барбітуратів і інших речовин, погано розчинних в підкисленній воді. Від цих недоліків звільнені методи Стаса-Отго, Сшедзинського і Карташова В.А. Однак метод ізолювання подкисленною водою дешевший і безпечніший, ніж методи ізолювання «лікарських» отрут органічними екстрагентами і широко застосовується при дослідженні об'єктів, що не знаходяться на стадії гнильних змін.

Окремі методи ізолювання використовують при цілеспрямованому хіміко-токсикологічному аналізі на визначену хімічну групу отрут або індивідуальні речовини, враховуючи їхні фізико-хімічні особливості.

Для ізолювання барбітуратів з біологічних об'єктів використовують метод П. Валова (екстракція водяним розчином гідроксиду натрію) і метод Попової В.І. (екстракція водою, підкисленною сульфатною кислотою з наступним очищенням екстрактів від домішок методом гель-хроматографії).

Для ізолювання алкалоїдів використовують метод Крамаренко В.Ф. - екстракція водою, подкисленною сульфатною кислотою.

Для ізолювання препаратів, похідних фенотіазину, використовують: методи Саломатіна Є.М. - модифікація методу Стаса-Отто (екстракція спиртом, підкисленним оксалатною кислотою) і модифікація метода Сшедзинського (екстракція ацетонітрилом, підкисленним хлористоводневою кислотою).

Для ізолювання метаболітів похідних 1,4-бенздіазепіну застосовується метод Ізотова Б. П. - екстракція бензофенонів сумішшю хлороформу і пентанолу (9:1) з гідролізату.

При використанні загальних методів ізолювання всі «лікарські» отрути поділяються на дві підгрупи:

· Речовини, які екстрагуються органічним розчинником з кислого водяного середовища - «кислий» хлороформний витяг. В «кислий» хлороформний витяг попадають речовини кислого (саліцилова кислота і її похідні, барбітурати), нейтрального (парацетамол), слабоосновного характеру (алкалоїди, похідні пурину, індолу) і, частково, середньої основності (похідні піразолону, 1,4-бенздіазепіну), що не дають стійких солей з кислотами.

· Речовини, які екстрагуються органічним розчинником з лужного водяного середовища - «лужний» хлороформний витяг. В «лужний» хлороформний витяг попадають речовини основного характеру (алкалоїди, синтетичні препарати, похідні фенотіазину, 1,4-бенздиазепіну, піразолону, пара-амінобензойної кислоти).

3. Фактори, що впливають на ефективність ізолювання речовин

Ефективність екстракції "лікарських" отрут з біологічного об'єкту залежить від ряду факторів, що впливають на кожну зі стадій ізолювання на ступінь екстракції отрути і супутніх домішок.

Вибір умов ізолювання визначається кількісним співвідношенням отрути і домішок, тому що значний вміст домішок супроводжується многостадійним очищенням і втратою анализуючої токсичної речовини.

При загальних і окремих методах ізолювання процес екстракції отрути проводиться:

І - в системі mвepде тіло - рідина, тобто екстракція отрути з біологічного об'єкту,

II - в системі рідина - рідина, тобто екстракція отрути з отриманої водної витяжки в органічний розчинник.

Процес екстракції отрути з біологічного матеріалу багатостадійний і основними стадіями цього процесу є:

· Проникнення екстрагенту в клітини і тканини трупного матеріалу й в інші об'єкти, в яких знаходиться досліджувана речовина.

· Розчинення отрути і домішок в екстрагенті або взаємодія з екстрагентом в клітинах і тканинах біологічного матеріалу.

· Перенесення розчинених отрут і домішок через оболонки клітин у міжклітинний простір і змішування витягнутих з клітин речовин з основною масою екстрагенту.

Фактори, що впливають на ступінь ізолювання «лікарських» отрут з біологічного матеріалу:

1. Ступінь здрібнення біологічного матеріалу.

2. Значення рН середовища.

3. Природа і властивості рідин, які використовуються для ізолювання отрут.

4. Природа кислоти, яка використовується для підкислення екстрагенту.

5. Йонна сила розчинів.

1. При збільшенні ступеня здрібнення біологічного матеріалу при використанні ножиців ( шматочки 0,3-0,5см); м'ясорубки ( шматочки 0,05-0,1см); гомогенізатора (шматочки розміром близько 0,01см) зростає ступінь ізолювання, як отрути так і домішок, що вимагає багатостадійного очищення витяжки з можливою втратою аналізованої речовини.

Гарний результат по здрібненню біологічного матеріалу дає заморожування об'єкту з наступним відтаєнням, при цьому відбувається розрив клітин і звільнення їхнього вмісту для екстракції.

2. Оптимальним значенням рН середовища, при якому максимально руйнуються зв'язки «лікарська» отрута - білок і отрути екстрагуються розчинниками, є значення рН 2-3. Вибір рН середовища зумовлений ізоелектричною точкою білкових речовин, який залежить від їхньої природи.

Білкові речовини є амфотерними сполуками. В залежності від рН середовища вони можуть дисоціювати як кислоти і як основи. При визначеному значенні рН середовища (ізоелектрична точка) число позитивних і негативних зарядів в білку стає однаковим. В цьому випадку сумарний заряд білка буде рівним нулю і білок стає нерухомим в електричному полі.

Ізоелектрична точка альбуміну відповідає рН 4,8; в-глобуліну -5,2; б-глобуліну - 6,4; фібриногену - 5,4. При рН вище ізоелектричної точки білки мають негативний заряд, при рН нижче ізоелектричної точки - позитивний заряд.

В живому організмі є необхідні умови (рН крові 7,35 - 7,40, рН середовища в тканинах і органах 6,8 - 7,2) для взаємодії «лікарських» отрут і білків.

Створення рН 2-3 при екстракції «лікарських» отрут водою з біологічного об'єкту збільшує і кількість білкових домішок у витяжці, що зумовлено підвищенням гідратації молекул білків, пептидів, амінокислот, пігментів і покращенням їх розчинності у воді.

3. Природа рідин, які використовуються для ізолювання отрут, зумовлює їх властивості:

· Проникати в клітини і тканини біологічного матеріалу.

· Розчиняти отруйні речовини, їх метаболіти, а також їх солі.

· Розчиняти як можна менші кількості домішок, що переходять з біологічного матеріалу у витяжки.

При попаданні отруйної речовини в організм людини, він проникає всередину клітин, розподіляється в позаклітинній рідині і жировій тканині. Якщо після настання смерті отруйна речовина виявилася всередині клітин, то для витягу екстрагент проникає в клітину через клітинну мембрану і змішується з внутрішньоклітинною рідиною.

Враховуючи, що до складу плазмотичної мембрани клітини входять білки і ліпіди, велике значення має здатність розчинників змішуватися з водою і ліпідами тканин, органів, тобто гідро-ліпофільні властивості, залежно від яких розчинники поділяються на три групи:

1. Гідрофільні розчинники, що змішуються з водою і не змішуються з ліпідами (високополярні розчинники - водні розчини кислот, основ, буферні розчини).

2. Ліпофільні розчинники, що змішуються з ліпідами і не змішуються з водою (малополярні розчинники - хлороформ, ефір, бензол, гексан і ін.).

3. Амфіфільні розчинники, що змішуються як з водою, так і з ліпідами тканини (метанол, етанол, ацетонітрил, ацетон і ін.).

Отже, через клітинну мембрану найлегше проникають амфіфільні розчинники, тому що мають спорідненість і до гідрофільної (білкової), і до гідрофобної (ліпідної) ділянок мембрани. Однак, амфіфільні екстаргенти будуть розчиняти білкові і жирові ділянки мембрани, а також вміст клітини, що значно збільшить кількість домішок у витяжках.

Лікарські речовини кислотного й основного характеру в залежності від рН середовища можуть знаходитися в тканинах йонізованій і в нейонізованій (молекулярній) формі - ліпофільні й амфіфільні розчинники.

Розчинність отрут залежить від діелектричної проникності розчинників. При зниженні діелектричної проникності екстрагентів сили притягання між молекулами отруйних речовин зростають, що погіршує їхню розчинність.

4. Природа кислоти, яка використовується для підкислення екстрагенту, впливає на ступінь ізолювання алкалоїдів і синтетичних лікарських сполук основного характеру з біологічного матеріалу, що зумовлено різною розчинністю солей азотистих основ з різними кислотами.

Наприклад, для ізолювання сильних основ - алкалоїдів, використовують воду, підкислену сульфатною кислотою, яка утворює добре розчинні солі.

5. На збільшення розчинності отруйних речовин впливає іонна сила розчинів, яка залежить від концентрації електролітів у цих розчинах - ефект всолювання.

Фактори, що впливають на ступінь екстракції речовин з водних витяжок органічними розчинниками:

* Природа речовини, яка екстрагується.

* Значення рН середовища.

* Природа екстpaгенту.

* Температура.

* Наявність висолювачів.

* Співвідношення об'ємів водної й органічної фаз.

* Числа повторних екстракцій.

Кількість екстрагованої речовини залежить від дисоціації її у водній фазі.

При екстракції недисоційовані молекули переходять в органічну фазу, а йони, що добре гідратовані молекулами води, залишаються у водній фазі.

При зміні рН водної фази змінюється співвідношення йонізованої і молекулярної форм «лікарських» отрут у водній витяжці, що впливає на екстракцію речовин у нейонізованій формі органічними розчинниками.

Вибір оптимальних умов екстракції: рН середовища, природи органічного розчинника - залежать від фізико-хімічних властивостей отруйних речовин. Наприклад, максимальна кількість кокаїну ексграгується з водної фази хлороформом при рН 7,0 - 8,5 (80 - 83 %), мінімальна кількість - диетиловим ефіром при рН 8,0 - 8,5 (57 - 62 %).

Зміна температури впливає:

· На константу розподілу речовини, яка екстрагується. При зміні температури неоднаково змінюється розчинність отрут і домішок у водній і органічній фазах, а також змінюється взаємна розчинність фаз.

· На зміну дисоціації й асоціації речовин у відповідній фазі.

· На зміну кількості співекстрактивних домішок. Оптимальною температурою для проведення процесу екстракції отрут є 25⁰С тому, що при збільшенні температури зростає кількість домішок.

Hаявність висолювачів (NaCl, Na₂SO₄ , (NH₄)₂SO₄) також збільшує ступінь екстракції отрут і домішок.

Розрахунок ступеня екстракції, константи розподілу і числа повторних екстракцій, необхідних для практично повного витягу досліджуваних речовин з розчинів проводиться за допомогою формул:

* Число повторних екстракцій ( m )

де С_В - початкова концентрація речовини у водному розчині (моль/л);

[A_m]_B - концентрація речовини, що залишилася, у водному розчині після m

екстракцій (моль/л);

P₀ - константа розподілу;

r - відношення об'єму водної фази до об'єму органічного розчинника

(V_B/V₀).

* Ступінь екстракції (R):

* Константа розподілу (P₀):

4. Методи очищення витяжок від домішок і концентрування виділених речовин

Для очищення аналізованих сполук від співекстрактивних речовин (білки, жири, пігменти й ін.) використовують різні методи:

· Фільтрування і центрифугування.

· Осадження білків різними реактивами і прийомами.

· Екстракція.

· Хроматографія - на папері, колонці, в тонких шарах сорбенту (ТСХ-метод), гель-хроматографія.

· Електрофорез.

· Дистиляція з водяною парою.

· Возгонка.

· Діаліз.

Фільтрування і центрифугування. Фільтрування дозволяє очистити витяжки від механічних забруднень (дрібних часточок біологічного матеріалу). Однак при фільтруванні витяжок можлива адсорбція отрути на фільтрі і часткова її втрата, а також неповне очищення витяжки від домішок, обмежене діаметром пор фільтра. Ці недоліки ліквідуються центрифугванням.

Осадження білків різними реактивами зумовлено утворенням малорозчинних у воді комплексів (фосфорновольфрамова, фосфорномолібденова, вольфрамова, трихлороцтова, метафосфорна кислоти) або коагуляцією білків (етанол, ацетон).

Для осадження білків використовуються різні прийоми: нагрівання, висолювання, зміна рН середовища.

· При підвищенні температури більше 40⁰С відбувається денатурація білків, знижується їхня розчинність.

· Ефективність висолювання як методу очищення витяжки залежить від концентрації і природи електролітів. При низьких концентраціях електроліти (Na₂SO₄; NaCl; (NH₄)₂SО₄ підвищують розчинність білків, що пояснюється зміною ступеня дисоціації іонізованих (-СООН; -ОН; -SH) груп білків. Підвищення концентрації солей (насичені розчини) приводить до перерозподілу молекул води в гідратних оболонках білків і введених іонів Na⁺; Сl^?О; SO₄^2- ; NН₄⁺, що знижує розчинність білків.

· Осадження білків з витяжок можливо при зміні рН середовища до значення, що відповідає ізоелектричній точці білка, при якому білок не несе сумарного заряду. Результатом досягнення зазначеного рН розчину є відсутність електростатичного відштовхування молекул білків, що сприяє утворенню осаду.

· Недоліком методів очищення витяжок при осадженні білків є здатність осадів домішок адсорбувати на своїй поверхні аналізовані отрути, що може бути однією з причин їх втрат у ході дослідження.

В основі екстракційного методу очищення лежить закон розподілу речовин між розчинниками, які незмішуються, а також їх здатність розчинятися в органічних розчинниках, а солей, які вони утворять - у воді. Метод простий, доступний і ефективний.

Кодеїн - основа Кодеїну гідрохлорид - сіль

(при рН 9-10 - (при рН 2-3 -

екстрагент отрути - хлороформ екстрагент солі - вода

екстрагент домішок - вода) екстрагент домішок - хлороформ)

Схема екстракційного очищення отрут основного характеру

Для екстракції домішок з витяжок необхідне встановлення відповідного значення рН середовища і застосування відповідного розчинника. При неправильному виборі цих факторів разом з домішками можуть екстрагуватися і аналізовані отрути.

Барбітал - імідна форма Барбітал натрію - імідольна форма

(при рН 2-3 - (при рН 9-10 -

екстрагент отрути - хлороформ екстрагент отрути - вода

екстрагент домішок - вода) екстракт домішок - хлороформ)

Схема екстракційного очищення отрут кислого характеру

В основі ТСХ-методу лежить розподіл отрути між рідкою і твердою фазою, нанесеної на тверду підкладку. Вибирають системи, у яких домішки залишаються на старті або рухаються разом із фронтом розчинника. Метод простий, доступний, дозволяє не тільки зробити очищення отрут від домішок, але й одночасно виконати їх визначення.

Для очищення екстрактів, отриманих з об'єктів, що знаходяться на стадії гнильних змін, ефективне використання сполучення екстракційного методу і методу тонкошарової хроматографії.

В основі електрофорезу на папері лежить розподіл речовин на папері, вміщеному в електроліт, під дією електричного поля. Йони досліджуваної суміші рухаються до електроду протилежного знака. По своїй ефективності метод наближається до ТСХ-методу, але вимагає спеціального устаткування.

Очищення екстрактів за допомогою гель-хроматографії основане на різній поведінці молекул стосовно пор гелю: малі молекули отрути проникають у пори і затримуються в них, великі молекули домішок обходять пори або уримаються на поверхні гелю. Метод гель-хроматографії застосовується для очищення водних витяжок. Він трудомісткий, але ефективний.

Дистиляція з водяною парою і метод возгонки засновані на леткості окремих представників досліджуваної групи отрут (алкалоїди похідні піридину і піперидина, барбитурати). Цей метод простий, але його використання раціональне при аналізі тільки великих кількостей отрут, що буває вкрай рідко при проведенні хіміко-токсикологічних досліджень.

Метод діалізу заснований на застосуванні напівпроникних мембран, через пори яких здатні проходити йони, невеликі молекули органічних речовин у той час, як великі молекули (білки, пептиди й ін.) залишаються по іншу сторону мембран. Метод має обмежене застосування для очищення речовин досліджуваної групи отрут, тому що він тривалий, можливі значні втрати аналізованих сполук.

Для проведення аналізу екстрактів їх необхідно сконцентрувати (працювати з великими об'ємами незручно).

Існують різні методи концентрування екстрактів:

* екстракційний,

* упарювання під вакуумом,

* адсорбція отрут твердим сорбентом з наступною десорбцією.

Вибір методу очищення залежить від стану об'єкту і методу ізолювання аналізованої отрути з біологічного матеріалу.

До складу методів ізолювання входять окремі етапи очищення, але вони не можуть забезпечити повне видалення домішок.

№ п/п	Група отрут, які ізолюються	Методи ізолювання	Методи очистки від домішок, які входять до складу методу
1	2	3	4
1	„Лікарські отрути”	· Водою, підкисленою оксалатною кислотою (метод А.А.Васильєвої)	· Проціджування; · Центрифугування
2	„Лікарські отрути”	· Спиртом, підкисленим оксалатною кислотою (метод Стаса-Отто)	· Упарювання витяжки до густоти сиропу · Осадження білків спиртом · Фільтрування
1	2	3	4
3	„Лікарські отрути”	· Ацетоном (метод Карташова)	· Центрифугування · Фільтрування · Екстракція домішок гексаном (рН 2-3)
4	Алкалоїди	· Водою, підкисленою сульфатною кислотою (метод В.Ф.Крамаренко)	· Проціджування; · Центрифугування · Висолювання домішок з допомогою (NH4)2SO4 · Екстракція домішок ефіром (рН 2-2,5)
5	Похідні барбітурової кислоти	· Водою, підлужненою натрій гідроксидом (метод П.Валова)	· Проціджування; · Центрифугування · Осадження білків вольфраматом натрію · Екстракція домішок ефіром (рН 2)
		· Водою, підкисленою сульфатною кислотою (метод В.І.Попової)	· Проціджування; · Центрифугування · Гель-хроматографія
6	Похідні фенотіазину	· Спиртом, підкисленим оксалатною кислотою (модифікація методу Стаса-Отто по Є.М.Саломатіну)	· Упарювання витяжки до густоти сиропу · Осадження білків спиртом · Фільтрування · Екстракція домішок ефіром (рН 2-3)
		· Ацетонітрилом, підкисленим хлористоводневою кислотою (модифікація методу Сшедзинського по Є.М.Саломатіну)	· Фільтрування · Висолювання домішок з допомогою Nа2SO4 · Екстракція домішок ефіром (рН 2-3)
7	Похідні 1,4-бенздіазепіну	· Ізолювання метаболітів похідних 1,4-бенздіазепіну (метод Б.Н.Ізотова)	· Деструкція тканин органів для проведення кислотного гідролізу · Центрифугування · Фільтрування

Тому після ізолювання отрут полярними розчинниками для очищення витяжок використовуються вищевказані методи, серед яких найбільш часто застосовують методи екстракційного очищення і тонкошарової хроматографії або їх сполучення.

Размещено на Allbest.ru