Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ТЕХНІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ УКРАЇНИ

«КИЇВСЬКИЙ ПОЛІТЕХНІЧНИЙ ІНСТИТУТ ІМЕНІ ІГОРЯ СІКОРСЬКИГО»

ХІМІКО-ТЕХНОЛОГІЧНИЙ ФАКУЛЬТЕТ

КАФЕДРА ФІЗИЧНОЇ ХІМІЇ

КУРСОВА РОБОТА

з курсу

«МЕТОДИ РОЗДІЛЕННЯ ТА ІДЕНТИФІКАЦІЇ СПОЛУК»

на тему:

«ЕЛЕКТРОМІГРАЦІЙНІ МЕТОДИ РОЗДІЛЕННЯ СПОЛУК»

Студента ІІІ-го курсу ХТФ групи ХД-41

Шендрика Андрія Миколайовича

Київ 2016

РЕФЕРАТ

Курсова робота «Електроміграційні методи розділення сполук» описує найпоширеніші методи розділення сумішей сполук з використанням електричного поля, що мають назву електрофоретичні методи розділення.

У роботі описано різновиди електрофорезу, притаманні їм особливості та випадки їх використання. Наведено принципові схеми приладів для різних видів електрофорезу, а також перечислені основні типи сполук та сумішей, які можна розділяти цим методом. Наведені склади найпоширеніших буферних розчинів, в середовищі яких проводять розділення, а також носії, на яких проводять це розділення.

Курсова робота містить 7 рисунків та 3 таблиці.

Ключові слова: електрофорез, електрофоретична рухливість, заряджені частинки, буферні розчини.

РЕФЕРАТ

Курсовая работа «Електромиграционные методы разделения соединений» описывает распространенные методы разделения смесей соединений с использованием электрического поля, которые называются электрофоретические методы разделения.

В работе описано разновидности электрофореза, присущие им особенности и случаи их использования. Приведены принципиальные схемы приборов для различных видов электрофореза, а также перечислены основные типы соединений и смесей, которые можно разделять этим методом. Приведенные составы распространенных буферных растворов, в среде которых проводят разделение, а также носители, на которых проводят это разделение.

Курсовая работа содержит 7 рисунков и 3 таблицы.

Ключевые слова: электрофорез, электрофоретическая подвижность, заряженные частицы, буферные растворы.

ABSTRACT

Coursework «Electromigration methods of separating compounds» describes the most abundant methods for separation of the compound mixtures using electric field, which are called electrophoretic separation methods.

The paper describes different types of electrophoresis, inherent characteristics and use cases. Principal schemes of the devices for different kinds of the electrophoresis are given, as well as the list of the main types of the compounds and mixtures, which can be separated using this method. The paper gives the composition the most common buffer solutions, which are used for separation. Also, the carriers for the separation are listed.

The paper consists of 7 images and 3 charts.

Keywords: electrophoresis, electrophoretic mobility, charged particles, buffer solutions.

ЗАВДАННЯ НА КУРСОВУ РОБОТУ

Завданням курсової роботи постало описати методи розділення, аналізу та ідентифікації речовин методами, що базуються на взаємодії речовини з електричним полем; перечислити типи сполук, які можна таким методом аналізувати; описати особливості апаратури, за допомогою якої проводять це розділення; вказати випадки використання цих методів.

Графік виконання курсової роботи

Тиждень семестру	Назва етапу роботи	Навчальний час на СРС
4	Отримання теми та завдання
4-5	Підбор та вивчення літератури	6
6-7	Виконання розділу 1	6
8-13	Виконання розділу 2	18
14	Подання курсової роботи на перевірку
15	Захист курсової роботи	6

ЗМІСТ

• ВСТУП
• РОЗДІЛ 1. СПОЛУКИ, ЯКІ МОЖНА РОЗДІЛЯТИ ЗА ДОПОМОГОЮ ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ
• РОЗДІЛ 2. АПАРАТУРНЕ ОФОРМЛЕННЯ ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ
• 2.1 Загальні закони електрофорезу
• 2.2 Безперервний електрофорез у вільному потоці
• 2.3 Зонний електрофорез на папері
• 2.4 Зонний електрофорез на ацетатцелюлозній мембрані
• 2.5 Тонкошаровий електрофорез
• 2.6 Гель-електрофорез
• 2.7 Гель-електрофорез при градієнті концентрації поліакриламіду
• 2.8 Дискретних гелевий електрофорез
• 2.9 Теорія ізоелектричного фракціонування
• 2.10 Капілярний електрофорез
• ВИСНОВКИ
• СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

ВСТУП

Усі методи аналізу та розділення сумішей базуються на певній властивості, що є спільною для усіх компонентів суміші, але для кожного компонента проявляє себе в різній мірі. Однією з таких властивостей є взаємодія із електричним полем, під впливом якого молекули речовини починають рухатися у напрямку протилежного заряду [1].

Ця властивість ввійшла в основу такого методу, як електрофорез.

Вперше явище електрофорезу та електроосмосу дуло відкрито Фрідріхом Рейсом у 1809-му році, при досліджені електролізу глини. Він помітив, що маленькі частинки глинозему рухаються у електричному полі до аноду. Проте мала розповсюдженість робіт Рейса та пожежа, що зруйнувала більшу частину його напрацювань відправили це явище у тимчасове сорокарічне забуття аж до середини ХІХ століття, коли роботу у цій області розпочав Відеман, відкрив зв'язок між швидкістю руху часток та прикладеним струмом [5].

Спочатку електрофорез використовувався в основному для аналізу неорганічних речовин (комплексів металів, золів, емульсій тощо), але згодом набув поширення і у органічній хімії, що пов'язано із розвитком органічної та біоорганічної хімії.

На сьогодні, електрофорез - це невід'ємний метод у аналізі сумішей біологічного походження (білки, ДНК, РНК, їхні часткові гідролізати, амінокислоти тощо).

Інколи властивість речовини взаємодіяти з електричним полем входить в основу гібридних методів розділення, у яких поруч із властивістю взаємодії з електричним полем використовується інша властивість, що збільшує селективність та ефективність розділення.

РОЗДІЛ 1. СПОЛУКИ, ЯКІ МОЖНА РОЗДІЛЯТИ ЗА ДОПОМОГОЮ ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ

Із електричним полем може взаємодіяти лише частинка, що має заряд, тому за допомогою електрофорезу можна розділяти лише заряджені частинки. До них відносять:

- іони неорганічного походження (К⁺, Са²⁺, АІ³⁺, РО₄^3-, NO₃^-тощо);

- заряджені комплекси ( [Fe(PhOH)₆]³⁺, [TiO(H₂O₂)]⁺, [Cu(NH₃)₄]²⁺тощо);

- органічні сполуки, що містять кислотні або основні групи ( -СОО^-, SO₃^-, -NH₃⁺, =NH₂⁺, ?NH⁺, R₄N⁺тощо)

- феноли (Ar-O^-);

- гетероциклічні сполуки нітрогену (піридин, пурин, пірол тощо);

- білки та їх гідролізати із сумарним ненульовим зарядом;

- фрагменти ДНК та РНК;

- ензими;

- золі та емульсії;

- органели клітин;

Особливу увагу слід приділити слабким електролітам та амфотерним сполукам, заряд яких залежить від кислотності середовища.

Фенол, наприклад, має К_д=1*10^-10, тому фенолят-іони будуть утворюватися лише у сильно лужному середовищі (рН>10).

Амфотерні сполуки характеризуються ізоелектричною точкою - це значення рН, за якого сумарний заряд молекули рівний нулю; при нижчому рН молекула набуває позитивного заряду, а за вищого - негативного. Для лейцину, наприклад, рІ=6,0, а для аргініну рІ=10,8. Для амфотерних сполук кислотність середовища при розділенні має на декілька пунктів відрізнятися від ізоелектричної точки.

РОЗДІЛ 2. АПАРАТУРНЕ ОФОРМЛЕННЯ ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ

2.1 Загальні закони електрофорезу

Іони, колоїдні частинки та частинки великого діаметру піддають впливу постійного однорідного електричного поля з напруженістю Е (В/см). Середовище, що оточує ці частинки , також однорідне за складом і характеризується однією і тією ж величиною рН. Заряджені частинки рухаються у електричному полі в напрямку протилежного заряду. У цьому випадку швидкість ідеалізованої сферичної частинки виражається формулою:

v=zE/6рзr, (2.1.1)

де z- величина заряду частинки, E- напруженість поля, з - в'язкість середовища, r-- радіус частинки. Опір руху частинки пропорційний в'язкості середовища з та радіусу частинки r [1].

Електрофоретична рухливість виражається як відношення швидкості руху частинки до напруженості поля:

u=v/E (2.1.2)

Величину Е у рівнянні (2.1.2) можна виразити через вимірювальні величини:

E=j/qx, (2.1.3)

де q -- площа перерізу електрофоретичної комірки, x - електропровідність, j--густина струму. Швидкість дорівнює відстані s, яку проходить частинка за одиницю часу.

v=s/t (2.1.4)

u=sqx/tj (2.1.5)

Слід зазначити, що рівняння (2.1.1) та (2.1.2) справедливі лише для гранично розведених розчинів та за відсутності солей. Вплив електроліту виражається за допомогою іонної сили м, яку можна виразити як:

(2.1.6)

Зі збільшенням іонної сили рухливість зменшується через накопичення іонів протилежного заряду навколо частинок, що призводить до зменшення сумарного заряду. Невелика зміна іонної сили розчину змінює рухливість приблизно у відповідності із наступним рівнянням:

(2.1.7)

Згідно рівняння (2.1.1), електрофоретична рухливість обернено пропорційна в'язкості середовища. В'язкість середовища зменшується при збільшені температури, тому рухливість приблизно на 2,7% збільшується при збільшені температури на 1 градус [1].

Також на рухливість впливає природа носія, який може бути гелем, може мати волокнисту чи порошкоподібну структуру, може бути насиченим електролітом. У таких випадках збільшується шлях та зменшується напруженість електричного поля. Гелеподібні носії можуть проявляти молекулярно-ситові властивості, що призводить до зменшення швидкості, або повної зупинки часток з великим стоксовим радіусом. Ці ефекти знайшли широке застосування у зонному електрофорезі. На хід розділення чинять вплив також і сорбційні процеси.

Коли через електрофоретичну комірку проходить струм, виділяється певна кількість джоулів тепла, що визначається рівнянням:

(2.1.8)

Щоб в'язкість системи, а як наслідок і рухомість часток, були постійними, тепло що виділяється необхідно постійно відводити, інакше виникає загроза перемішування зон. Це особливо важливо при електрофорезі без носія.

2.2 Безперервний електрофорез у вільному потоці

В основу цього методу покладено зонний електрофорез у електроліті, який рухається перпендикулярно напрямку електричного поля. Первинний варіант методу призначений для розділення на папері, пізніше його стали використовувати за відсутності носія, стабілізація зон відбувалася шляхом ламінарного руху достатньо тонкого шару електроліту. Електрофоретична комірка має форму плоского квадрату або прямокутника, довжина сторін якого декілька десятків сантиметрів, а товщина шару 0,25-0,60 мм [1].

Рух часток описується наступним співвідношенням:

tgб=Електрофоретична рухливість/Швидкість електроліту-носія, (2.2.1)

де б - кут між напрямком руху зони та напрямком руху електроліту-носія.

Задля забезпечення постійного значення кута б необхідно постійно підтримувати сталість умов, а саме струм, швидкість подачі електроліту-носія, безперервна система охолодження.

Продуктивність зазвичай сягає 100-200 мг зразка у годину. Розділення часток, що осаджуються, проводять у спеціальних вертикальних камерах, а розчинних речовин - у горизонтальних.

Преваги методу - це висока ефективність, продуктивність, висока чистота отримуваних фракцій.

Зазвичай електропровідність електроліту у електрофоретичній комірці лежить у межах 1*10^-3-2,2*10^-3 (Ом*см)^-1, лише система фенол-оцтова кислота-вода мають суттєво нищу електропровідність у порівнянні із іншими сумішами розчинників, що рекомендується використовувати у цьому методі, наведені у таблиці 2.2.1.

Суттєвою перевагою цього методу є те, що за допомогою нього можна розділяти навіть клітини та субклітинні одиниці, але у цьому випадку необхідно щоб умови розділення сприяли виживанню клітин. Осмотичний тиск регулюють за допомогою сахарози або глюкози.

Рисунок 2.2.1. Схема камери апарату для безперервного електрофорезу у вільному потоці

Е - електроліт-носій, S - досліджувана суміш, F₁-F₄ - місця виходу компонентів суміші.

Таблиця 2.2.1. Рекомендовані системи електролітів для безперервного зонного електрофорезу у вільному потоці

рН	Електроліт-носій для електролітичних камер	Електроліт для електродних камер	Сполуки, що розділяють цим методом
2,0	0,187 М оцтова кислота0,187 М мурашина кислота	32 мл крижаної оцтової кислоти, 21,3 мл 99% -ї мурашиної кислоти, вода до 1 л	Нуклеозиди, нуклеотиди
2,6	0,5 М оцтова кислота	1 М оцтова кислота	Мукополісахариди, білки, полісахари-ди, основні білки, основні і нейтральні пептиди
3.0	Фенол - оцтова кислота - вода (1: 1: 1, г / мл / мл)	Як і в електрофоретичній камері або оцтова кислота - вода (1: 1, за об'ємом)	Рослинні екстракти
3.9	2,58 мл піридину, 8,58 мл оцтової кислоти, вода до 1 л	7,73 мл піридину, 25,75 мл оцтової кислоти, вода до 1 л	Гідролізати білків
4.9	3,7 мл піридину, 2,96 мл оцтової кислоти, вода до 1 л	11,1 мл піридину, 3,4 мл оцтової кислоти, вода до 1 л 0,075 М ацетат амонію, оцтова кислота	Екстракт тимусу, пептиди
5.1	0,025 М ацетат амонію, оцтова кислота	0,75 М ацетат амонію, оцтова кислота	Ферменти, цереброзид-сульфатаза
5,3	0,025 М ацетат натрію, оцтова кислота до pH 5,3	0,75 М ацетат натрію, доведений до pH 5,3 0,75 М оцтовою кислотою	Фаги
5,6	0,08 М піридин, оцтова кислота	0,24 М піридин, оцтова кислота	Нейрогіпофізні екстракти, вазопресин, окситоцин, AVTH
7.2	0,01 М тріс-буфер, 0,01 М ацетат магнію, лимонна кислота до pH 7,2	0,05 М трис-буфер, 0,05 М ацетат магнію, лимонна кислота до pH 7,2	Рибосоми з E. coli
7.3	0,01 М фосфат калію-натрію	0,03 М фосфат калію-натрію 0,1 М триетаноламін,	Фактор росту
7.4	0,01 М триетаноламін, 0,01 М оцтова кислота, 0,001М ЕДТА, 0,33 М сахароза, 2 М NaОН до pH 7,4	0,1 М триетаноламін, 0,1 М оцтова кислота, 2 М NаОН до pH 7,4	Лізосоми, мітохондрії з мітохондріальних мембран
8.5	0,15 М тріс-буфер, 4,0 М сечовина, доведена до pH 8,5 лимонною кислотою 0,08 М трис-буфер, лимонна кислота	0,45 М тріс-буфер, лимонна кислота до pH 8,5	Комплекс РНК - білок, кислотні білки
8,6	0,08 М тріс-буфер, лимонна кислота	0,24 М тріс-буфер, лимонна кислота	Сироваткові білки
10,5	0,017 М гліцин, NаОН, NаСl до електропровідності ж= 1,5*10-3	0,24 М тріс-буфер, лимонна кислота 3,8 г гліцину в 1 л, 0,5 М NaОН до pH 10,5, 2 М NaCl до електропровiдності ж= 5*10-3	Білки вірусу тютюнової мозаїки

2.3 Зонний електрофорез на папері

Широке поширення методу паперового електрофорезу обумовлено такими властивостями паперу, як механічна міцність, здатність утримувати велику кількість електроліту і зразка, можливість надання необхідної форми, легкість застосування двомірних методів і простота елюювання зразка. Виявлення проводиться або зануренням в розчин реагенту або обприскуванням цим розчином. Електроферограму після висушування можна зберігати [1].

Однак папір має і ряд недоліків: це неоднорідність паперу уздовж аркуша, поруватість, яка подовжує шлях переміщення речовини. У результаті сорбції збільшуються втрати в процесі препаративного поділу або поділ взагалі стає практично неможливим через утворення «хвостів» .

Розширення зон внаслідок дифузії можна зменшити, скорочуючи тривалість поділу, знижуючи температуру і одночасно збільшуючи градієнт напруги. Для розділення високомолекулярних сполук придатна проста апаратура і достатньо низький градієнт напруги, але для розділення низькомолекулярних з'єднань необхідний градієнт напруги до 200 В / см. Приклади простіших приладів наведені на рисунку2.3.1. Прилади з ефективним охолодженням дозволяють більш точно визначати електрофоретичну рухливість [1].

Прилади для високовольтного електрофорезу забезпечуються пристроєм для відводу джоулівського тепла. Найчастіше використовується система постійного відводу тепла. Прилад з рідинними теплообмінником простіший по конструкції (правда, відведення тепла в ньому менш ефективний) і дозволяє отримати дуже однорідну міграцію зон. Для відводу тепла використовуються такі інертні рідини, як толуол, вищі фракції нафти або фторовані вуглеводні. Просочений буферним розчином папір поміщають в рідину, яку можна охолоджувати за допомогою зануреного в неї холодильника [1].

Рисунок 2.3.1. Схеми приладів для низьковольтного зонного електрофорезу.

Е - електродні камери; N - інертна рідина; Р - скляна перегородка, що розтягує папір; Т - скляний стрижень. 1- прилад з горизонтальною камерою, в якому папір розташовується між скляними пластинами; 2 - прилад звичайного типу; 3 - пристрій з горизонтальною камерою; у цього приладу невеликий об'єм вологої камери і насичення парами електроліту відбувається швидко; 4 - апарат Кремера і Тізеліуса, в якому відведення тепла здійснюється за допомогою інертної рідини; 5 - апарат з підвішеним в центрі папером; 6 - прилад, в якому надмірне тепло швидко відводиться інертною рідиною, наприклад СС1₄.

Прилади для високовольтного електрофорезу з постійним теплообміном, згідно з даними роботи, можна з успіхом використовувати протягом тривалого часу. Новий, знайшовший широкого поширення прилад з металевим одностороннім теплообмінником має більш ефективну систему охолодження і його можна застосовувати при градієнті напруги до 170 В / см .

2.4 Зонний електрофорез на ацетатцелюлозній мембрані

Для зонного електрофорезу ацетатцелюлозну мембрану (САМ) першим використав Кон. На думку Кона, переваги цього носія -- його однорідність і строго визначена поруватість. САМ містить мізерно мале число ОН-груп, забрудненість органічними і неорганічними домішками також дуже мала. У тих випадках, коли сильна сорбція може призводити до утворення на папері смужок позаду зон (як, наприклад, при електрофорезі біополімерів) важливою перевагою стає знижена сорбційна активність САМ. На відміну від паперу САМ дозволяє отримати хороший поділ б₁-фракціі сироватки альбуміну, а також інсуліну, фібриногену, гістонів, лізоциму, гліко- і ліпопротеїнів і нуклеїнових кислот. Після електрофорезу мічених сполук залишкова радіоактивність між зонами і стартом виключно мала. Знебарвлення фону, якщо визначення проводиться шляхом фарбування і подальшого знебарвлення, відбувається досить швидко [1].

На САМ зручно оцінювати кількісно вміст фракцій. САМ, призначену для фотоколориметричних визначень, просочують парафіновим маслом, наприклад Shell Whitmore Oil 120, або оцтовою кислотою, при цьому САМ стає прозорою, і на ній можна вимірювати поглинання та відбиття. Оскільки САМ розчинна в ряді органічних розчинників, при проведенні деяких кількісних визначень можна використовувати цю її властивість. Отримані розчини можна аналізувати, фотоколориметрично або сцинтиляційним методом [1].

Сполуки, що розділяють на САМ, як правило, дають вузькі зони, що дозволяє для більшості типів поділів зменшити загальну довжину шляху до 6-12 см. Міграція на меншу відстань призводить до скорочення тривалості електрофорезу і меншому розширенню зон під впливом дифузії . В результаті розділення, наприклад, сироваткових білків можна здійснити при градієнті потенціалу в 20-25 В / см за 60-90 хв.

Прилади для електрофорезу на ацетатцелюлозних мембранах

Конструкція приладу для електрофорезу на мембранах з САМ може бути досить простою, але простір навколо легковисихаючої тонкої ацетатцелюлозної мембрани маєретельно насичуватися водяними парами. У зв'язку з інтенсивним випаровуванням води з САМ відбувається локальне збільшення електричного опору носія , що приводить до перегріву і спотворення розділених зон, а також до руйнування носія. З цієї причини камеру ізолюють від навколишньої атмосфери рідинним затвором, а відкриті кювети, що містять електроліт, поміщають під мембраною. На рис. 2.4.1 показана схема приладу цього типу, що випускається в Угорщині. Джерело живлення забезпечує регульовану напругу до 200 або 400 В або регульований струм. Для стандартизованого поділу, при проведенні якого враховується вплив тепла, що виділяється, найзручніше джерело живлення зі стабілізованим струмом. Відповідно до ширин смужки САМ сила струму зазвичай відповідає 0,4-0,5 мА / см ширини. Довжина смужки, як правило, не перевищує 8-10 см.

Буферні розчини для електрофорезу на САМ зазвичай мають нижчу електропровідність, ніж аналогічні розчини, що застосовуються для паперового електрофорезу. Для електрофорезу в барбітуратному буферному розчині рекомендується 0,05-0,07 М розчин діетілбарбітурата.



Рисунок. 2.4.1. Схема приладу для електрофорезу на ацетатцелюлозних мембранах.

1 - ацстатцелюлозна мембрана (САМ); 2 - підтримуючий стрижень для введення струму; 3 - тримач смужки з САМ; 4 - паперовий місток-гніт для проходження струму в зовнішнє вічко; 5 - регульована пластикова підкладка; 6 - внутрішні електродні комірки; 7 - ватні містки-гноти осередків; 8 - порожнина для водяного затвора електрофоретичної камери; 9 - кришка камери, що вставляється в порожнину водяного затвору.

Склади буферів приведені в табл. 2.4.1. Методи фарбування, застосовувані щі поділі на САМ, аналогічні методам фарбування на папері, однак не можна використовувати такі розчинники (наприклад, ацетон і хлороформ), в яких САМ набухає або розчиняється. Концентрація розчинів барвника може бути нижче, ніж при поділі на папері, і перевага віддається водним, а не спиртовим розчинам барвника. Сухі мембрани можна відразу занурювати в розчин, їх слід обережно, намагаючись не викликати утворення бульбашок, покласти на поверхню рідини, щоб розчин в них вбирався під дією капілярних сил. Зволожені мембрани можна занурювати в розчин [1].

Таблиця 2.4.1. Буферні розчини для електрофорезу на ацетат целюлозній мембрані

Анодний розчин	Катодний розчин	Примітки
рН	склад	рН	склад
9,1	25,2 г тріс-буфера, 2,5 г ЕДТА, 1,9 г борної кислоти, вода до 1 л	8,6	5,15 г діетілбарбітурату натрію, 0,92 г діетілбар- бітуратної кислоти, вода до 1 л	Дискретна система розчинів, САМ просочують сумішшю обох буферів (1:1)
8,6	1,84 г діетілбарбітуратної кислоти, 10,3 г діетілбарбітурату натрію, вода до 1 л; для запобіганнярозвитку мікроорганізмів додають 5 мл 5%-го розчину тимолу в ізопропіловому спирті	8,6	Відповідає анодному	Рутинні аналізи сироватки, кінини
5,3	25 мл піридину, 10 мл крижаної оцтової кислоти, дистильована вода до 2 л	5,3	Відповідає анодному	Електрофорез сечі, амінокислот

На смужку САМ товщиною 0,2-0,5 мм і шириною 2,5 см зазвичай наносять 0,2-1,0 мкл зразку. Для стандартного розділення компонентів сироватки з подальшим фотометричним визначенням використовується до 3 мкл зразка, що містить 0,1-0,2 мг білка. Оптимальна кількість зразка залежить від методу виявлення. Для калориметричного виявлення після елюювання необхідна найбільша кількість зразку, а для фотометричного і радіоізотопного виявлення - найменше. Якщо проводиться фотометричне виявлення, найменшу кількість зразка потрібно в тих випадках, коли вимірюється відбиття світла від смужки прозорої САМ, покладеної на білу підкладку [1].

2.5 Тонкошаровий електрофорез

Методика поділу тонкошаровим електрофорезом (ТШЕ) аналогічна методиці поділу ТШХ. Для отримання незакріпленого шару найчастіше використовується дрібнозернистий силікагель. Перевага методу ТШЕ - можливість застосування універсальних проявляючих реагентів (тих же, що і в ТШХ). Біохімічний аналіз проводять на шарах тонкогранулюваної целюлози, до якої для збереження вологості і поліпшення прилипання шару до підкладки додають невелику кількість дуже тонкого сефадексу. Порошок крохмалю сьогодні застосовується рідше. Для аналізу деяких типів препаратів придатний синтетичний дрібнодисперсний матеріал на основі полівінілу - певікон [1].

Розміри пластинок зазвичай відповідають розмірам стандартних пластинок для ТШХ, тобто 200x200 або 200X100 мм. Прилади для ТШЕ зазвичай дають вихід 0,10-0,15 Вт/см2 при градієнті напруги до 60 В / см. Тривалість поділу в залежності від типу зразку і буферного розчину становить від 20 до 120 хв. Якщо після проведення ТШЕ висушити шар, то можна в перпендикулярному напрямку провести друге розділення методом ТШХ або знову ТШЕ і в результаті отримати «карту». Якщо умови першого і другого (в перпендикулярному напрямку) розділення ідентичні, то в проміжку між поділами можна провести хімічну реакцію. В результаті реакції рухливість ряду сполук зміниться, і вони відхиляться від діагоналі, на якій розташуються не модифіковані компоненти. На рис. 2.5.1 показана схема приладу для ТШЕ [1].

Рисунок. 2.5.1 Прилад для тонкошарового електрофорезу

1 - підведення струму; 2 - прозора кришка; 3 - з'єднання з платиновими електродами; 4 - пристосування, що притискають паперові контакти до тонкого шару; 5 - скляна пластина з тонким шаром; 6 - паперові струмопровідні контакти; 7 - електродний осередок з електролітом; 8 - пластикова (поліпропіленова) камера; 9 - ізольований блок охолодження; 10 - введення холодної води.

2.6 Гель-електрофорез

З самого початку застосування електрофорезу для стабілізації зон використовувалися гелі. У 1946 р з цією метою був застосований силікагель, а 1949 року - гель агару. Ці гелі використовуються і в даний час, особливо в аналітичних цілях. Розширення сфери застосування гелів при електрофорезі білків пов'язано з проявленням молекулярно-ситових властивостей гелю крохмалю. Це гель особливо зручний для аналітичних робіт. При проведені препаративних розділень слід враховувати деяку забрудненість елюата полісахаридами, які вимиваються з матриці гелю. Аналогічне забруднення елюата спостерігається і при поділі на гелі агару і силікагелі, який містить велику кількість неорганічних домішок. Наявність іоногенних груп підтверджується чітким електроосмотичним потоком. Електроосмос викликає зрушення зон в одному напрямку, що спотворює профіль поділу. У агарозному гелі, властивості якого за іншими ознаками схожі з агаровим гелем, вміст йоногенних груп істотно нижчий [1].

Гель агарози також можна змішувати з поліакриламідних гелем в тих випадках, коли макропористий поліакріламідний гель з низькою щільністю не придатний за своїми механічними властивостями.

Поліакриламідний гель найменш хімічно активний. Його слабка спорідненість до барвників дозволяє здійснювати швидке виявлення біополімерів, головним чином білків, нуклеїнових кислот і продуктів їх розпаду, за допомогою забарвлення. Прозорий поліакриламідний гель володіє гарними механічними властивостями, що допускають зміну концентрації поліакриламіду в найширших межах. Електроосмолітичні ефекти в цьому гелі дуже малі. Умови аналітичних і препаративних поділів на поліакриламідному гелі шляхом зонного електрофорезу в гомогенних і дискретних системах буферних розчинів добре вивчені [1].

2.7 Гель-електрофорез при градієнті концентрації поліакриламіду

У цьому методі електрофорезу використовується електрофоретичне переміщення макромолекул в середовищі з градієнтом густини пор гелю. Кінцевий результат -- поділ суміші на окремі компоненти відповідно до розмірів молекул, при цьому електрофоретична рухливість не відіграє суттєвої ролі. Необхідною умовою такого поділу є наявність у досліджуваних сполук зарядів одного типу і відмінність від нуля електрофоретичної рухливості в застосовуваної середовищі. Рух речовин від старту поступово гальмується внаслідок зменшення пор гелю, і зі збільшенням відстані від старту рухливість макромолекул поступово зменшується. При великих молекулярних масах рухливість зменшується майже до нуля. Обмеження рухливості, що викликається гелем, призводить до фокусування зон. Для того щоб рухливість знижувалася до нуля, поряд з градієнтом концентрації акриламіду необхідна наявність градієнта ступеня зшивання гелю. Тому в нових типах гелів є градієнт концентрацій і поліакриламіду, і бісакриламіду. На цих гелях можна розділяти і фокусувати зони сполук з молекулярною масою від 2*10⁴ до 8 * 10⁶дальтонів.

Метод зручний тим, що сталість напруги електричного струму і тривалості поділу не належать до числа необхідних умов. Зазвичай достатньо застосування буферного розчину одного і того ж типу при двох концентраціях. Недолік методу - відносна довготривалість поділу - компенсується гарною відтворюваністю положення зон. Таким способом можна також визначити молекулярні маси [1].

2.8 Дискретних гелевий електрофорез

Основи методу

Теорію гель-електрофорезу в дискретній системі буферів булавпершерозроблена Девісом і Орнштейном. Метод дискретного електрофорезу, описаний цими авторами, або метод так званого багарофазного зонного електрофорезу в поліакриламідному гелі, передбачає об'єднання двох основних принципів електроміграції. На початковій стадії поділу відбувається процес фокусування, який поступово трансформується в процес зонного електрофорезу на гелі, що володіє властивостями молекулярного сита.

Розчин зразка перед нанесенням або згущують, наприклад додаючи сахарозу, або вводять в шар гелю при його полімеризаціі. За шаром, що містить зразок, слідує шар «фокусуючого» гелю з рівномірною низькою концентрацією поліакриламідного гелю. У цьому шарі компоненти зразка після їх міграції з гелю зі зразком концентруються в зону, в якій вони з різним ступенем поділу слідують один за одним. На цьому етапі сфокусовані компоненти зразка переходять в наступний шар більш концентрованого «розділяючого» гелю. Електрофоретична рухливість макромолекулярнихсполук зменшується до такої міри, що низькомолекулярний «заключний» іон наздоганяє концентровані зони макромолекулярних речовин і поступово заміщає «ведучий» іон у всьому обсязі гелю. В утвореному таким чином гомогенному середовищі, що містить цей іон і буферний компонент протилежного заряду, окремі зони макромолекул мігрують з різною швидкістю. В аналітичних цілях поділ ведуть протягом певного відрізка часу, а при препаративному поділі дають компонентам суміші подолати певну відстань, пов'язану із зоною елюювання [1].

Методика аналітичного дискретного гелевого електрофорезу

Електрофорез проводять в скляних трубках довжиною близько 70 мм з внутрішнім діаметром близько 5 мм. Перед використанням трубки ретельно промивають сумішшю хромової і сірчаної кислот або гарячою азотною кислотою, водою і на закінчення ацетоном. Сухі трубки тримають вертикально і дно їх закривають гумовим ущільненням так, щоб гума не входила в трубку. Як ущільнення можна використовувати гумові кришки, перевернувши їх навпаки. Вихідні розчини для приготування гелю зберігаються при 4 ° С в темних бутлях, які витримують при кімнатній температурі і відкачують водоструминним насосом, щоб зменшити вміст кисню, інгібуючого полімеризацію. Якщо нижня частина стовпчика гелю не достатньо рівна, то в кожну трубочку вводять 0,1 мл 40%-го розчину сахарози і обережно покривають сумішшю для полімеризації розділяючого гелю до заздалегідь зазначеної висоти, наприклад 50 мм, тобтоблизько 2 мл суміші для полімеризації. Далі цей шар відразу ж дуже обережно з шприца з тонкою голкою (по стінці трубки) покривають 0,1 мл води. Під час полімеризації чіпати трубки не рекомендується. Після завершення полімеризації залишкову воду видаляють ватним тампоном. Суху поверхню розділяючого гелю спочатку промивають приблизно 0,1 мл розчину для приготування проміжного гелю, потім вводять 5 мм шару (0,2 мл) розчину для приготування проміжного гелю і швидко і обережно покривають 0,1 мл води . Трубку висвітлюють зверху флуоресцентної лампою зі спектром денного світла, віддалений максимум на 50 мм. Після закінчення фотополімеризації шар води видаляють, а поверхню гелю промивають або буферним розчином з верхньої електродної камери, якщо зразок наносять в розчині, або знову розчином для приготування фокусуючого гелю, в який замість води додають зразок. Якщо аналізуються хімічно лабільні сполуки, наприклад ферменти, зразок краще наносити у виглядірозчину після додавання до нього 10%-го розчину сахарози. Для аналізу складних сумішей необхідно до 0,2 мг зразка, для аналізу більш простих сумішей досить меншої їх кількості, до 0,01 мг. Якщо зразок не полімеризується, його наносять тільки після того, як трубка з гелем закріплена в пристої. Трубки, закріплені вертикально у верхній частині пристрою, занурюють в нижній електроліт, бульбашки повітря з нижніх ділянок гелю ретельно видаляють загнутою піпеткою. Верхню електродну камеру заповнюють відповідним електродним буферним розчином, до якого додають барвник (3 краплі насиченого розчину барвника на 250 мл розчину). Барвник вказує фронт однорідної фази, що мають зони зразку. При поділі аніонів використовується розчин бромфенолового синього, при поділі катіонів -- розчин метиленового зеленого. Приготовлений таким чином пристрій поміщають в холодильник, де підтримується постійним рівень температури (4 ° С). Полярність вибирають відповідно до заряду поділюваних іонів (якщо поділяються аніони, позитивний полюс повинен бути знизу, якщо поділяються катіони, позитивний полюс повинен перебувати нагорі). Напругу вибирають таким, щоб сила струму в одній трубці не перевищувала 2 мА (до 4 мА для менш складних розділень). Якщо можливо, рекомендуєтьсякористуватися джерелом живлення (до 500 В) зі стабілізованим струмом. Як тільки зона барвника досягне нижнього кінця розділяючого гелю, електрофорез припиняють. Якщо зразки містять небажані солі, зони мігрують більш повільно і виходять менш вузькими. У таких випадках трубки виймають (після відключення джерела живлення), щоб визначити відстань, яку подолав барвник, закривають утворений у верхній частині пристрою отвір і продовжують розділення. В охолоджені трубки, що мають розділяючий гель, (тримають водній руці) з шприца з тонкою голкою (тримають в іншій руці) поступово по внутрішньому периметру трубки між гелем і склом вводят воду або більш ефективний розчин гліцерину (~ 10%-й). Щоб уникнути потрапляння на шкіру токсичного акриламіду і не забруднити гель, перед проведенням цих операцій слід надіти тонкі рукавички [1].

Виявлення за допомогою фарбування поліакриламідних гелів

Найбільш надійними і універсальними барвниками для білків є амідовий чорний 10В і кумассі синій. Найбільшого поширення набув універсальний барвник «Stains-all», який забарвлює рибонуклеїновую кислоту в блакитно-рожевий колір, дезоксирибонуклеїнові кислоти і білки - в червоний, кислотні полісахариди -- в синій.

2.9 Теорія ізоелектричного фракціонування

У ізоелектричному фракціонуванні, або фокусуванні, (скорочено ІФ) використовується градієнт концентрації іонів, який впливає на заряд розділяючих компонентів, наприклад Н⁺ і комплексоутворюючих іонів. Найпростіший приклад - ІФ амфотерних макромолекул, головним чином білків при градієнтній зміні pH. Білки значно різняться за своїми ізоелектричними точкам, тобто за значеннями pH, при яких вони мають нульовий заряд. При pH меншому, ніж ізоелектрічна точка, білок набуває позитивного заряд, і тому рухається в електричному полі як катіон. При наявності градієнту pH, який збільшується від анода до катода, іон рухається до точки, у якій він втратить свій позитивний заряд або стане повністю електрично нейтральним. Такий градієнт pH можна створити за допомогою системи буферних розчинів. Однак описаний метод не знайшов широкого застосування [3].

Свенсон теоретично обґрунтував і підтвердив практичні переваги застосування стійкого природного градієнту pH. Градієнт такого типу спостерігається при електролізі суміші амфотерних речовин. Стаціонарний стан встановлюється в тому випадку, коли амфоліти розташовуються в порядку збільшення ізоелектричної точки рН від найнижчого значення (поблизу анода) до найвищого (поблизу катода). Практичне використання цього методу можливо при підборі потрібної консистенції амфолітів-носіїв. Амфоліти мають відповідати наступним вимогам: 1) відсутність взаємодії з білками, 2) низька молекулярна маса, 3) найменше можливе відмінність між рК і pІ, 4) хороша електропровідність, 5) найменше можливе поглинання світла в області УФ поглинання білків, 6) рівномірний розподіл зон рІ амфолітів, 7) максимальну кількість різних значень рІ. Спочатку в якості амфолітів використовувалися лише речовини, хімічно близькі білкам, тобто різні типи частково гідролізованих білків. Коли вимагаєтся більш тонка зміна рІ і ближчий до лінійного градієнт, слід застосовувати електроліти-носії, запропоновані Вестербергом. Це гетерогенні синтетичні матеріали під назвою амфолінові електроліти ( «Ampholine electrolyte»), з відомим діапазоном рІ. Амфолінові електроліти являють собою суміш аліфатичних поліамінополікарбонових з'єднань з молекулярной масою 300-1000 дальтон і рІ від 3 до 10; діапазон рІ може бути і більш вузьким.

Міграція амфотерних сполук в умовах ІФ до такого стену, в якому молекула має нульовий сумарний заряд, конкурує з тенденцією зон розширюватися внаслідок дифузії. Збільшення градієнта напруги підсилює фокусуючий ефект доти, поки джоулівське тепло не викликає перемішування зон під дією теплової дифузії і конвекції або не приведе до денатурації природних амфотерних макромолекул. Теорія цього процесу була розроблена Свенсоном. І буферна ємність, і необхідна електропровідність амфолітів збільшуються в міру зменшення різниці між рІ і рК. Коли ця різниця стає дорівнює одиниці, зберігається 25% максимальної буферної ємності, але при різниці, близькій до 2, залишається тільки 3% буферної ємності. Величина різниці в 1,5-2 од. pH є межею, до якого амфоліти використовуються в якості середовища для ізоелектричного фракціонування [1].

2.10 Капілярний електрофорез

Метод капілярного електрофорезу базується на розділенні компонентів складної суміші в кварцовому капілярі під дією прикладеного електричного поля. Мікрооб'єм аналізованого розчину вводять у капіляр, який попередньо заповнено підходящим буфером - електролітом. Після прикладання до кінців капіляра високої напруги (до 30 кВ) компоненти суміші починають рухатися по капіляру з різною швидкістю, яка залежить у першу чергу від заряду і величини іонного радіуса, і відповідно, у різний час досягають зони дететкування. Отримана послідовність піків називається електрофореграмою, при цьому якісною характеристикою речовини є параметр утримування (час міграції), а кількісною - висота чи площа піку, пропорційна концентрації речовини. На рисунку 2.10.1 показана схема установки для капілярного електрофорезу [2].

Рисунок 2.10.1 Схема установки для капілярного електрофорезу

При проведенні розділення у капілярах особливо важливе значення набуває електроосмотичний потік (ЕОП), пов'язаний із рухом дифузної частини подвійного шару, який утворюється відносно зарядженої поверхні внутрішньої стінки капіляра (рис. 2.10.2).

Рисунок 2.10.2Подвійний електричний шар на стінці капіляра

Швидкість електроосмотичного потоку (v_eo) залежить від електро-осмотичної рухливості, яка у свою чергу визначається густиною заряду на внутрішній стінці капіляра та характеристиками буфера [2].

(2.10.1)

де е -- діелектрична проникність, о -- дзета потенціал, з -- динамічна в'язкість середовища.

Як правило, заряд поверхні визначається наявністю негативно заряджених силанольних груп на поверхні немодифікованих кварцових капілярів або створюється за рахунок додаткової модифікації поверхні. Результуюча рухливість частинок є сумою електрофоретичної та електроосмотичної рухливостей:

м= м_еf + м_eo (2.10.2)

Швидкість пересування іонів з однаковим напрямком електрофоретичної та електроосмотичної рухливостей буде збільшуватись, а з протилежним - зменшуватись. Для немодифікованого кварцового капіляра в дифузній частині подвійного електричного шару присутня надлишкова концентрація катіонів, в результаті руху яких виникає ЕОП, направлений до катода. В результаті катіони будуть пересуватися швидше та дететкуватися до ЕОП, а аніони повільніше та дететкуватися після ЕОП, нейтральні молекули рухаються із ЕОП.

У кварцових капілярах ЕОП зменшується при збільшенні концентрації електроліту і додаванні органічних розчинників та зростає зі збільшенням рН (рис. 2.10.3), а також залежить від в'язкості розчину в капілярі та температури. Якщо ж при додаванні катіонних ПАР до роздільного буфера на поверхні капіляра адсорбується позитивний заряд, то ЕОП змінює напрям і переносить роздільний буфер у напрямку анода.

Рисунок 2.10.3 Залежність електроосмотичного потоку від рН

Унікальною особливістю ЕОП є плаский профіль потоку в капілярі. Такий профіль є вигідним, оскільки зменшується розмивання зон речовин, що розділяють. Ефективність розділення в капілярному електрофорезі прямо пропорційна, а час аналізу обернено пропорційний напрузі, прикладеній до електродів.

Розділення в капілярному електрофорезі може бути виконано як із позитивною, так і з негативною полярністю електродів. Якщо для компонентів проби відомі значення рК_а, можна вибрати буфер із відповідним значенням рН і полярність електродів, щоб зразок рухався в бік детектора. Швидкість міграції залежить від напруженості електричного поля, яка звичайно складає 200--400 В/см.

Типовий об'єм введеної проби в капілярному електрофорезу становить1-20 нл. Загальноприйнято заповнювати пробою не більше 2% об'єму капіляра з тим, щоб спочатку, до аналізу, не створювати широку зону компонентів і забезпечити достатній час знаходження зони проби в капілярі для встановлення значущих відмінностей в електрофоретичної рухливості.

Безпосередньо перед введенням проби капіляр промивають робочим буферним розчином, видаляючи залишки проби від попереднього введення.

Таблиця 2.10.1 Деякі характеристики методів детектування, що використовуються у капілярному електрофорезі

Детектування	Селективність	Універсальність	Якісність інформації про речовину	Детектування у капілярі	Приблизна межа детектування, моль/л	Частота використання, %
Фотометричне у УФ-В області спектру (пряме)	+	-	+	+	10-5--10-7	55
Фотометричне у УФ-В області спектру (непряме)	-	+	-	+	10-4--10-6	5
Флуорометричне (пряме)	+	-	-	+	10-7--10-9	15
Флуорометричне (непряме)	-	+	-	+	10-6--10-8	2
Флуорометричне (індуковане лазером)	+	-	-	+	10-13--10-18	5-7
Масс-спектрометричне	+	+	+	-	10-8--10-10	10
Амперометричне (пряме)	+	-	-	-	10-7--10-10	2
Амперометричне (непряме)	-	+	-	-	10-6--10-8	<1
Кондукто-метричне	-	+	-	-	10-7--10-9	<1
Рефракто-метричне	-	+	-	+	10-6--10-8	<1
Радіометричне	+	-	-	+	10-10--10-12	<1

Для капілярного електрофорезу в більшості випадках опрацювання даних аналогічне із капілярною хроматографією, тобто тут існують ті самі характеристики, такі як час утримування, параметри піків (ширина, висота). За певних сталих умов час утримування може бути якісною характеристикою компоненту, такою обчислюють повноту розділення [4].:

 (2.10.3)

Кількість теоретичних тарілок є характеристикою ефективності методики:

(2.10.4)

, (2.10.5)

де , -- різниця та середня електрофоретична рухливість компонентів; t_2, t₁--час утримування компонентів; w₁, w₂ - ширини піків компонентів; w_1/2--ширина на половині висоти піку.

Якщо внутрішню поверхню капіляру модифікувати, то на розділення поряд із здатністю взаємодіяти з електричним полем впливатимуть інші властивості, такі як здатність до сорбції, комплексоутворення тощо, що значно підвищить ефективність розділення [2].

електрофорез поле капіляр заряджений

Висновки

1. Електрофорез - це один із методів розділення сполук, що базується на їхній взаємодії з електричним полем.

2. Змінюючи кількісний та якісний склад середовища, в якому проводять електрофорез, можна підлаштувати систему на розділення суміші певного характеру (білки, амінокислоти, органели клітин тощо)

3. Залежно від задачі розділення та кількості суміші, що розділяється, електрофорез можна застосовувати як для аналізу мікрокількостей, так і для препаративного розділення сумішей.

4. Електрофорез має багато напрямків розвитку, пов'язаних із розробкою нових носіїв та середовищ, то надаватимуть розділенню більшої селективності та/або збільшуватимуть масовий вихід суміші, що розділяється.

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. Микеш О. Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам ІІ / Я. Туркова, Б. Мелоун, О. Мотл, Л. Новотный, Р. Комерс, М. Крейчи, З. Прохазка, З. Прусик, О. Микеш - Москва: Мир, 1982. - Ч. ІІ. 381 с.

2. Комарова Н. В., Каменцев Я. С. Практическое руководство по использованию систем капиллярного электрофореза «КАПЕЛЬ» -- СПб.: ООО «Веда», 2006. -- 212 с., ISBN 5-903297-01-3

3. Куліков А.Ю. Електрофоретичні методи аналізу / А.Ю. Куліков, О. С. Чернишова, Н.О. Нікітіна. - Х.: ХНУ ім.. В.Н. Каразіна, 2013. - 68 с.

4. Дэвид Хайгер Высокоэффективный капиллярный электрофорез / Доктор Дэвид Хайгер, перевод Б.П. Лапина -- Чапел-Хилл: Agilent Technologies, 1992. - 115 c.

Размещено на Allbest.ru