Жидкостно-жидкостная хроматография

Размещено на http://www.allbest.ru/

Жидкостно-жидкостная распределительная хроматография

I. Теоретические основы метода

Подобно тому, как в газо-жидкостной распределительной хроматографии в основе разделения смеси веществ лежит различие в коэффициентах распределения между газом и жидкостью, в жидкостно-жидкостной хроматографии таким критерием служит различие в коэффициентах распределения между двумя несмешивающимися жидкостями.

Таким образом, коэффициент распределения в жидкостно-жидкостной хроматографии (ЖЖХ) равен

Кр,ж= Сж,1 / Сж,2 ,

где Сж,1 -- концентрация определяемого вещества в жидкости, служащей подвижной фазой, а Сж,2 -- то же, в другой -- неподвижной фазе. Термодинамическим условием существования такой системы является равенство активностей растворенного вещества в двух контактирующих, но несмешивающихся жидкостях, т. е. а1= а2.

Поскольку a1 = Cж,1?1 и а2=Сж,2, где?1 и ?2 -- коэффициенты активности растворенного вещества в соответствующих фазах, то

= 1 = Кр,ж

и, следовательно,

Кр,ж = ?1/?2

Итак, коэффициент распределения в ЖЖХ связан с коэффициентом активности растворенного вещества весьма простым образом. Разделение смеси веществ в ЖЖХ становится возможным вследствие различия свойств молекул растворяемых веществ, например их полярности. Известно, что если рассматривать простейший случай разделения -- смеси веществ одного гомологического ряда, то

lg?i=A + Bzi ,

где ?i -- коэффициент активности i-ro члена гомологического ряда, имеющего z атомов углерода в молекуле; А и В -- эмпирические константы. Эта зависимость хорошо подтверждается экспериментально. Следовательно, для двух несмешивающихся жидкостей:

lg?i,1 = A1 + B1zi

lg?i,2 = A2 + B2zi

или lg?i,2 - lg?i,1 = lgКр,ж,i = (A2 - A1) + ( B2 - B1)zi;

lgКр,ж,i = А' + В'zi.

Отсюда следует, что удерживание гомологов возрастает с числом атомов углерода экспоненциально. При условии, что В' достаточно велико, члены любого гомологического ряда могут быть хроматографически разделены. Необходимая величина В' зависит от эффективности колонки. Однако большинство реальных систем содержит соединения различных гомологических рядов. Поэтому выбор несмешивающихся фаз в распределительной хроматографии достаточно затруднен. Обычно о предполагаемой селективности системы судят, исходя не из расчетных, а из эмпирических данных и больше всего из собственного опыта. Селективность двух несмешивающихся фаз можно оценить по двум критериям: «параметру растворимости» Гильдебранда и критической температуре растворения. Эти свойства наряду с коэффициентами активности и полярностью молекул характеризуют межмолекулярное взаимодействие. Первый критерий определяется как корень квадратный из «энергии испарения 1 см3» чистого вещества. Критическая температура растворения Ткр является максимальной температурой бинарной жидкой системы, при которой две несмешивающиеся жидкости могут находиться в равновесии. Критическая температура растворения и параметр растворимости связаны выражением

2RTкр= f(?1- ?2)2;

где ? -- параметр растворимости.

Из данного уравнения следует, что если две жидкости имеют близкие параметры растворимости, то их Ткр окажутся очень низкими. Поэтому при выборе несмешивающихся фаз для ЖЖХ знание параметров растворимости весьма полезно.

Изменения селективности двух жидких фаз можно достичь, вводя третий компонент. В распределительной хроматографии тройные системы получили широкое применение. В этом случае выбирают две совершенно несмешивающиеся фазы и вводят третью, растворяющуюся и в той и в другой. Вводя третью жидкость в разных соотношениях, получают набор несмешивающихся фаз различной селективности. Например, если взять совершенно несмешивающиеся друг с другом воду и гептан и вводить в эту систему этанол в различных количествах, то спирт, растворяясь как в воде, так и гептане, даст набор двухфазных систем различной селективности.

К системе, состоящей из двух жидких фаз, в ЖЖХ предъявляется еще одно важное требование -- ее стабильность. Нарушение стабильности может быть вызвано различными факторами: взаимной растворимостью жидких фаз, изменением температуры опыта, испарением одного из компонентов раствора и др. Поэтому необходимо сохранение постоянства свойств выбранной системы на протяжении всего эксперимента.

Постоянство температуры обеспечивается применением соответствующих термостатов. Изменение состава вследствие испарения исключается применением герметичной аппаратуры. Для обеспечения постоянства состава фаз применяют два метода: предварительное приведение несмешивающихся фаз в состояние равновесия и химическое закрепление неподвижной фазы. Первый метод состоит в насыщении подвижной фазы неподвижной, чтобы при хроматографировании был исключен переход неподвижной фазы в подвижную. Насыщение производят встряхиванием подвижной фазы с избытком неподвижной в течение 24 ч при температуре работы хроматографической системы. Второй метод основан на реакции взаимодействия гидроксильных групп, имеющихся на поверхности применяемых носителей, с силанизирующими реагентами. Эта идея была впервые использована для дезактивации твердых носителей в газовой хроматографии. В ЖЖХ силанизацию производят для химического закрепления неподвижной фазы на твердом носителе. Такие системы получили название связанных фаз.

Так, например, Стюарт и Перри приготовили «октадецилцелит», с которого органические вещества не смывались ни одним из органических растворителей. Промышленностью выпускаются силанизированные носители, которые с успехом применяются в ЖЖХ. Например, «дурапакс», в котором поверхность пористого стекла силанизирована и содержит радикалы оксидипропионитрила, полиэтиленгликоля с молекулярной массой 400 или н-октана. Эти вещества и служат неподвижной фазой.

Успех хроматографического разделения смеси веществ зависит не только от селективности выбранных фаз, но и от эффективности колонки. Последняя связана с такими физическими свойствами применяемых жидкостей, как вязкость и коэффициент диффузии. Подвижные фазы в ЖЖХ должны обладать относительно низкой вязкостью, чтобы давление, необходимое для продавливания раствора через слой носителя в колонке, было минимальным. Поэтому в качестве подвижных фаз рекомендуется применять жидкости с малой молекулярной массой. Коэффициент диффузии в применяемых жидких фазах в большей степени влияет на эффективность работы, колонки, чем на длительность анализа. Высокая скорость диффузии в неподвижной фазе оказывает благоприятное действие на быстрое установление равновесия между анализируемыми веществами и несмешивающимися фазами и, таким образом, уменьшает высоту тарелки. В то же время большая скорость диффузии в подвижной фазе оказывает противоположное действие. Скорость диффузии в неподвижной фазе обычно много меньше, чем в подвижной, поэтому влиянием диффузии при выборе неподвижной фазы можно пренебречь. При выборе подвижной фазы надо иметь в виду, что малая ее вязкость способствует ускорению анализа, в то же время высокая вязкость обеспечивает более высокую эффективность. Однако абсолютная величина влияния вязкости на высоту тарелки невелика, поэтому предпочитают пользоваться маловязкими подвижными фазами. Распределительная жидкостно-жидкостная хроматография может осуществляться в трех вариантах: колоночном, на бумаге и в тонком слое.

II. Колоночный вариант

Методика распределительной хроматографии в колоночном варианте не отличается от жидкостно-адсорбционной хроматографии. Здесь важен правильный выбор пары несмешивающихся фаз и твердого носителя неподвижной фазы. В их качестве могут применяться вещества различной молекулярной природы: гидрофильные, удерживающие воду, и гидрофобные, удерживающие органические, несмешивающиеся с водой вещества. К носителям в колоночном варианте предъявляются следующие основные требования: они должны прочно удерживать на своей поверхности неподвижную жидкую фазу, обладать достаточно развитой поверхностью, быть химически инертными, не адсорбировать анализируемые вещества и, наконец, не растворяться в применяющихся растворителях.

В качестве гидрофильных носителей применяют целлюлозу (специально выпускаемый для хроматографии целлюлозный порошок), прочно удерживающую воду, служащую неподвижной фазой. Целлюлоза обладает рядом недостатков, ею трудно равномерно заполнять колонки.

В колонках, заполненных целлюлозным порошком, помимо основного процесса распределения вещества имеют место процессы адсорбции и ионного обмена.

Другим гидрофильным носителем служит силикагель, не получивший широкого применения вследствие сильных адсорбционных свойств. Наконец, гидрофильными носителями могут служить ионообменники.

В общем случае распределительная хроматография на колонках с гидрофильными носителями обладает существенным недостатком, связанным с тем, что процесс распределения вещества зависит от состава и кислотности водной фазы. В то же время изменение состава водной фазы, находящейся на носителе, трудно осуществимо. Поэтому в колоночном варианте предпочитают применять гидрофобные носители.

Гидрофобными носителями служат различные полимерные вещества. Одним из лучших носителей этого типа считается полимер трифторхлорэтилена, известный под названием фторопласт-3 или KeI-F. Удачным носителем является также полностью фторированный полимер фторопласт-4, или тефлон. В качестве гидрофобного носителя применяется также ацетилцеллюлоза. В принципе гидрофобным носителем может служить любой полимер, нерастворимый и не набухающий в органических растворителях и приготовленный в виде порошка с необходимой для удержания неподвижной фазы поверхностью. Подобно носителям в газожидкостной хроматографии, в ЖЖХ в качестве носителей могут применяться поверхностно-пористые носители, особенно с контролируемой поверхностной пористостью.

Методика приготовления и нанесения неподвижных жидких фаз на твердые носители в ЖЖХ не отличается от газо-жидкостной хроматографии. Количество неподвижной жидкой фазы, приходящейся на единицу массы твердого носителя, без появления тенденции к склеиванию составляет для силикатных носителей примерно половину его массы. Обычный диапазон наносимой жидкости составляет от 1 до 40% от массы носителя. Химически связанные неподвижные фазы приготовлять в лабораторных условиях достаточно трудно. Поэтому рекомендуется пользоваться фирменными образцами. Эти материалы могут содержать до 25% от массы носителя органических групп, связанных с ним. В случае поверхностно-пористых носителей содержание химически не связанной жидкой фазы снижается до 0,5--1%. Размер пробы, вводимой в колонку, зависит от количества содержащейся в носителе жидкой фазы. Для высокоэффективной колоночной ЖЖХ размеры проб, вводимых в колонку, обычно не отличаются от размеров проб, вводимых в газо-жидкостные колонки.

III. Хроматография на бумаге

Носителем неподвижной жидкой фазы в хроматографии на бумаге служат специальные сорта бумаги, способные удерживать в своих порах значительные количества жидкости. Так же, как и в колоночном варианте, здесь возможны два типа бумаги: гидрофильная, способная удерживать в своих порах воду, и гидрофобная-- специально приготовленная и способная удерживать неполярные органические жидкости. Способы получения хроматограмм на бумаге практически аналогичны способам, применяемым в тонкослойной хроматографии. В колоночной распределительной хроматографии движение зон компонентов разделяемой смеси количественно характеризуется величиной Rf, названной Фуксом подвижностью:

Rf=

где S -- поперечное сечение колонки; Sп -- поперечное сечение подвижной жидкой фазы; Sн-- то же, неподвижной жидкой фазы; Кр.ж. -- коэффициент распределения.

Однако при хроматографировании на бумаге величину Rf измерить нельзя. Поэтому для характеристики поведения зон на бумаге вводят величину Rf:

хроматография колоночный адсорбционный бумага

Rf = =RfRn/S

Эту величину можно выразить через смещение зоны при промывании вещества подвижной фазой. В самом деле, смещение зоны х по слою бумаги при промывании подвижной фазой объемом V равно х = откуда Rf = XSjV и X = RfVjS. Если смещение фронта подвижной фазы обозначить Xf, то Xf=VISn. Тогда Rf = XJXf. Полученное для Rf выражение то же, что и в гл. IV для подвижности в тонком слое. Практическое определение Rf приведено на рис. IV.1. В идеальном случае Rf характеризует скорость перемещения зоны компонента по слою бумаги и не зависит от природы бумаги и других факторов, а определяется лишь коэффициентом распределения. На практике, однако, вследствие взаимодействия веществ смеси с носителем, отклонения процесса от равновесия, неправильного распределения волокон бумаги и по другим причинам Rf зависит от сорта бумаги, техники эксперимента и ряда других факторов. Поэтому пользоваться для качественного определения табличными значениями ./?/ не всегда возможно. Значения Rf могут лежать в пределах от 0 до 1. При Rf, близких к единице, смесь не сможет разделиться, а при Rf, близких к нулю, движение зон будет замедлено. Значения Rf, двух соседних компонентов анализируемой смеси для полного их разделения должны достаточно отличаться друг от друга. Методики получения распределительных хроматограмм на бумаге. Методика проведения анализа на бумаге аналогична методике, применяемой в тонкослойной хроматографии. Анализ может выполняться восходящим или нисходящим способом на полосках специальной бумаги. Кроме того, исходная смесь может наноситься в центр круга и далее распределяться концентрическими кольцами от центра к периферии. В этом случае получают круговую хроматограмму. Конец фитиля опускается в сосуд с подвижной фазой. Стартовая линия в этом случае находится в верхней части полоски бумаги. Если при помощи подвижной фазы выбранного состава не удается разделить анализируемую смесь, прибегают к способу двумерной хроматограммы. Для получения двумерной хроматограммы применяют квадратные листы бумаги размером 20X20, 30X30 или 40X40 см. В начале опыта каплю исследуемого раствора наносят на бумагу в ее левом углу на расстоянии 5 см от краев (рис. VII.5,а). После высушивания образовавшегося пятна бумагу помещают в сосуд для хроматографирования, опускают нижний край бумаги в один из выбранных растворителей и производят хроматографирование восходящим способом. После того как фронт подвижной фазы достигнет заданного предела в верхней части бумаги, хроматографирование прекращают, бумагу высушивают и поворачивают ее на 90° против часовой стрелки. При этом место нанесения капли исследуемого раствора окажется справа, а линия, по которой происходил подъем зон анализируемых веществ, образует новую стартовую линию (рис. VII.5, б). В таком положении бумагу помещают снова в сосуд для хроматографирования и опускают ее нижний край в подвижную фазу иного состава и хроматографируют по восходящему методу. По достижении фронтом новой подвижной фазы заданной высоты хроматографирование прекращают, бумагу высушивают и проявляют. Получают двумерную хроматограмму такого типа, как изображено на рис. VII.5, в. Двумерная хроматография значительно расширяет возможности распределительной ЖЖХ.

Успех хроматографии на бумаге обусловлен не только широким ассортиментом жидких фаз с различными коэффициентами распределения и другими ее достоинствами, но также и возможностью применять одновременное или последовательное воздействие на разделяемую смесь электрического поля. Такой прием получил название электрофоретической хроматографии. При одновременном проведении хроматографирования и электрофореза лист бумаги пропитывают раствором электролита и закрепляют между электродами, на которые подается напряжение от источника постоянного тока. Одновременно происходит движение подвижной фазы. Такой процесс значительно сокращает время анализа и улучшает разделение смеси.

При электрофорезе с последующим хроматографированием на бумагу, пропитанную раствором электролита, наносят каплю анализируемого раствора и проводят электрофорез, подключая концы листа бумаги через электроды к источнику постоянного тока. После окончания электрофореза бумагу вынимают из прибора, сушат и переносят в камеру для хроматографирования по способу восходящей или нисходящей хроматографии. После окончания хроматографирования бумагу проявляют и проводят качественные и количественные определения. Метод раздельного электрофореза и хроматографирования позволяет проводить эти две операции при различных значениях рН, что улучшает возможности разделения. Распределительную хроматографию на бумаге полезно сочетать с осадочной хроматографией. Сначала получают осадочную хроматограмму на бумаге. После образования осадков бумагу помещают в прибор для хроматографирования, край бумаги опускают в подвижную фазу и хроматографируют. Если осадки получались из водной среды, то в качестве подвижной фазы берут органический растворитель, насыщенный водой,, способный полностью или частично растворять осадки. После хроматографирования хроматограмму проявляют. Бумага для хроматографирования. К хроматографической бумаге предъявляются определенные требования: она должна быть химически чистой, химически нейтральной, не адсорбировать вещества анализируемой смеси и подвижной фазы, однородной по плотности и обеспечивать определенную скорость движения подвижной фазы. Существенное значение имеют структура и ориентация волокон бумаги. Без соблюдения этих требований успех хроматографического анализа не может быть обеспечен. Для получения химически чистой бумаги товарные образцы бумаги обрабатывают различными реагентами, например аминоуксусной кислотой, трилоном Б, 8-оксихинолином и другими, образующими растворимые комплексные соединения с присутствующими в бумаге неорганическими ионами. Получающиеся соединения вымывают затем растворителями. Однако для анализа можно применять просто плотные сорта фильтровальной бумаги, лучше марки «синяя лента», бумагу «Ватман» и др. Для характеристики плотности бумаги принимают массу 1 м2 в граммах, толщину листа в миллиметрах или же высоту подъема смеси н-бутилового спирта, уксусной кислоты и воды, (4:1:5 по объему) в сантиметрах в час. Для получения четкого разделения необходимо учитывать направление волокон бумаги, оно должно совпадать с направлением движения подвижной фазы. В любом случае бумага должна содержать достаточное количество неподвижной фазы. Обычные сорта бумаги гидрофильны и содержат в воздушносухом состоянии 20--22% воды, что обычно вполне достаточно для проведения опыта с применением в качестве неподвижной фазы воды. В этом случае подвижной фазой служат органические жидкости, нерастворимые в воде. Для получения гидрофобной бумаги обычную гидрофильную бумагу подвергают специальной обработке, например пропитывают различными гидрофобными веществами или ацетилируют. Пропитку бумаги производят 1%-ным раствором парафина в петролейном эфире, 0,5%-ным раствором каучука в бензоле, или же 1--2%-ным раствором очищенного растительного масла в диэтиловом эфире. Для проверки гидрофобности бумаги после окончания ее пропитки и испарения растворителя на бумагу наносят каплю воды. Она должна стекать, не смачивая бумаги. При ацетилировании бумаги ее обрабатывают ацетилирующей смесью (90 мл уксусного ангидрида, 10 мл петролейного эфира и 8--10 капель конц. H2SO4). Бумагу помещают в ацетилирующую смесь на 45 мин, затем вынимают и тщательно промывают в течение 15 мин в проточной воде, оставляют на 10--15 мин в дистиллированной воде, промывают и высушивают. Хранят гидрофобную бумагу в герметичных сосудах в атмосфере паров того органического растворителя, который затем будет служить неподвижной фазой. Метод получения хроматограмм на гидрофобной бумаге применяется для анализа водонерастворимых веществ. Он получил название метода обращенных фаз. В этом случае неподвижной фазой служит неполярный растворитель (углеводород), а подвижной -- полярный (водные растворы спиртов, органических кислот и т. п.). Для анализа водорастворимых веществ применяют гидрофильную бумагу, неподвижной фазой служит вода, а подвижной -- органические водонерастворимые растворители, насыщенные водой. В качестве подвижной фазы выбирается такая смесь, в которой компоненты анализируемого раствора имеют меньшую растворимость, чем в растворителе, служащем неподвижной фазой. При этом растворимость в подвижной фазе не должна быть слишком малой, иначе анализируемые вещества будут слишком медленно передвигаться по слою бумаги или же оставаться без движения на месте.

Размещено на Allbest.ru