Фармакогностичне та токсикологічне вивчення болиголову плямистого

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ`Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія

ФАРМАКОГНОСТИЧНЕ ТА ХІМІКО-ТОКСИКОЛОГІЧНЕ ВИВЧЕННЯ БОЛИГОЛОВУ ПЛЯМИСТОГО

Малиновський Юрій Юрійович

Харків - 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі токсикологічної хімії Національного фармацевтичного університету Міністерства охорони здоров`я України

Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук, професор

Бондар Володимир Степанович

Національний фармацевтичний університет,

завідувач кафедри токсикологічної хімії

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор

Ковальов Володимир Миколайович

Національний фармацевтичний університет,

завідувач кафедри фармакогнозії

доктор фармацевтичних наук, професор

Буряк Валерій Прокопович

Запорізький державний медичний університет

завідувач кафедри токсикологічної та неорганічної хімії

Захист відбудеться «20» лютого 2009 року о 10⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул.. Блюхера, 4)

Автореферат розісланий „___”__________2009р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

д. біол. наук, проф. МАЛОШТАН Л.Н.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми

У результаті розвитку науки поняття про безумовну шкідливість рослин, що містять сильнодіючі й отруйні речовини, втратило свою гостроту, тому що і серед отруйних рослин вже давно виявлені і продовжують виявлятися види, що мають корисні властивості. Причому, як це не парадоксально, найчастіше лікарськими властивостями володіють саме отруйні рослини.

Яскравим представником отруйних рослин є болиголов плямистий рослина, відома ще з античних часів. Болиголов широко застосовується в народній медицині й у наш час. Дана лікарська рослина має болезаспокійливу, седативну, протиастматичну, протисудомну, протиракову дії. Широке застосування знайшов болиголов і в гомеопатії для лікування великої кількості захворювань. Він входить до складу багатьох гомеопатичних лікарських препаратів відомих фармацевтичних фірм.

Безконтрольне вживання препаратів народної медицини та помилкове використання болиголову плямистого замість їстівних рослин родини селерових є причиною гострих отруєнь.

Аналіз доступних літературних джерел свідчить про недостатнє фармакогностичне вивчення болиголову та відсутність сучасних методів ідентифікації та кількісного визначення діючих речовин, що робить дане дослідження актуальним.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами

Дисертаційна робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного університету («Створення нових лікарських препаратів на основі рослинної та природної сировини, зокрема продуктів бджільництва, для дорослих та дітей», держреєстрація № 0198U007008 та проблемної комісії «Фармація» МОЗ України.)

Мета і задачі дослідження

Метою дисертаційної роботи є фармакогностичне та хіміко-токсикологічне вивчення болиголову плямистого (Conium maculatum L.)

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні задачі:

- провести інформаційний пошук та критичний аналіз сучасного стану досліджень за темою дисертаційної роботи;

- провести попередні фітохімічні дослідження якісного складу трави болиголову плямистого;

- виділити в індивідуальному стані БАР та встановити їх структуру;

- розробити методики ідентифікації та кількісного визначення основної діючої речовини - алкалоїду коніїну в рослинній сировині та біологічному матеріалі;

- дослідити повноту екстрагування алкалоїдів та розробити схему одержання екстракту з рослинної сировини;

- розробити схему дослідження біологічного матеріалу на коніїн, придатну для хіміко-токсикологічного аналізу;

- провести порівняльне морфолого-анатомічне вивчення болиголову плямистого та близьких видів - бутня Прескотта та петрушки кучерявої;

- встановити основні анатомо-діагностичні ознаки цих видів;

- з метою виключення помилок при заготівлі трави та плодів болиголову плямистого, створити методичні вказівки «Відмінні макро- та мікроскопічні ознаки болиголову плямистого, бутня Прескотта та петрушки кучерявої».

Об'єкти дослідження

Об'єктами дослідження є трава та недозрілі плоди болиголову плямистого, трава бутня Прескотта і петрушки кучерявої, алкалоїд коніїн, природні комплекси біологічно активних речовин, біологічний матеріал тваринного походження.

Предмет дослідження

Предметом дослідження є встановлення морфолого-анатомічних ознак болиголову плямистого та близьких видів; виявлення, виділення та ідентифікація БАР, кількісне визначення коніїну в рослинній сировині та біологічному матеріалі.

Методи дослідження

Якісний склад БАР визначали фармакопейними методами, використовуючи тонкошарову та паперову хроматографії. Для вилучення БАР із сировини застосовували методи вибіркової рідинної екстракції, адсорбційної колонкової хроматографії на силікагелі і поліамідному сорбенті та препаративну ПХ. Будову виділених сполук встановлювали хімічними та інструментальними методами.

Якісне та кількісне визначення алкалоїду в рослинній сировині та біологічних об'єктах проводили хімічними та фізико-хімічними методами (спектрофотометричним, ФЕК та ВЕРХ методами).

Мікроскопічні дослідження здійснювали за допомогою мікроскопів МБР-1 та МБУ-6, фотографування мікропрепаратів проводили фотоапаратом «ФЕД-5В» (плівки «Мікрат-200», «Мікрат-300») та цифровою фотокамерою Olympus «Camedia C-4000».

Наукова новизна одержаних результатів

Вперше проведено комплексне фармакогностичне вивчення трави та недозрілих плодів болиголову плямистого. Встановлено в них наявність полісахаридів, аміно- та жирних кислот (вперше) та флавоноїдів, гідроксикоричних кислот, кумаринів, мікро- та макроелементів. З досліджуваної сировини виділено та ідентифіковано 17 речовин фенольної природи: 4 гідроксикоричних кислоти (вперше: 5-0-кофеїл-D-хінна кислота (хлорогенова кислота), З-0-кофеїл-D-хінна кислота (неохлорогенова кислота), 4-0-кофеїл-D-хінна кислота (ізохлорогенова кислота)), 5 кумаринів (вперше: кумарин, умбеліферон (7-оксикумарин), скополетин(6-метокси-7оксикумарин), ізоскополетин, ескулетин), 8 флавоноїдів (вперше глікозиди флавоноїдів: кверцетин-3-0-в-D-глікопіранозид (ізокверцитрин), кемпферол-3-0-в-D-глюкопіранозид (астрагалін), кемпферол-3-0-а-L-арабофуранозид (кемпферол-3-арабінозид), кверцетин-3-0-в-D-галактопіранозид (гіперозид), кверцетин-3-0-в-D-рутинозид (рутин)).

Вперше встановлені основні анатомо-діагностичні ознаки плодів та трави болиголову плямистого в порівнянні з близькими видами - бутнем Прескотта та петрушкою кучерявою.

Вперше розроблено схему одержання витяжки алкалоїдів з сировини в залежності від часу екстрагування.

Розроблено сучасний метод якісного та кількісного визначення основної діючої речовини - алкалоїду коніїну в екстракті з рослинної сировини і в біологічному матеріалі та створено схему дослідження біологічного матеріалу, придатну для хіміко-токсикологічного аналізу на коніїн

Розроблено спосіб одержання комплексу полісахаридів з досліджуваної сировини. Новизна досліджень підтверджена патентом на корисну модель №23879 «Процес одержання та кількісного визначення полісахаридного комплексу з болиголова плямистого» від 11 червня 2007 р.

Практичне значення отриманих результатів

За результатами морфологічного і анатомічного вивчення трави болиголову плямистого та близьких видів (бутня Прескотта і петрушки кучерявої) видано методичні рекомендації «Відмінні макро- та мікроскопічні ознаки болиголову плямистого, бутня Прескотта та петрушки кучерявої».

Результати досліджень впроваджені в навчальний процес Національного фармацевтичного університету на кафедрах медичної ботаніки, хімії природних сполук, фармакогнозії; на кафедрах фармакогнозії і ботаніки, токсикологічної та аналітичної хімії фармацевтичних факультетів Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького, Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачовського, Запорізького державного медичного університету, Івано-Франківського державного медичного університету, Медичного інституту Української асоціації народної медицини.

За результатами досліджень розроблений проект АНД на сировину болиголову плямистого (Conium maculatum L.).

Особистий внесок здобувача

- проведено аналіз літературних даних з розповсюдження, хімічного складу та застосування болиголову плямистого;

- встановлено наявність в сировині амінокислот, жирних кислот, кумаринів, полісахаридів, флавоноїдів, гідроксикоричних кислот, макро- та мікроелементів;

- виділено та ідентифіковано будову 17 речовин фенольної природи;

- удосконалено спосіб одержання полісахаридів з рослинної сировини;

- розроблено схему одержання коніїну з рослинної сировини та його дослідження;

- розроблено схему хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на коніїн;

- вивчено анатомо-діагностичні ознаки трави та плодів болиголову плямистого і близьких видів (бутня Прескотта і петрушки кучерявої).

Апробація результатів дисертації

Основні аспекти роботи викладені та обговорені на Міжнародній науково-практичній конференції „Україна наукова 2003” (Дніпропетровськ 2003 р.); Міжвузівській науковій студентській конференції НФаУ. (Харків 2003 р.); Міжнародної наукової конференції „Історія та перспективи розвитку фармацевтичної науки і освіти” (Запоріжжя 2004 р.); Всеукраїнському науково-практичному семінарі „Перспективи створення в Україні лікарських препаратів різної спрямованості дії” (Харків 2004 р.); Науково-практичній конференції „Фармацевтичне право: Організаційно-правові проблеми рецептурного та безрецептурного відпуску лікарських засобів у сучасних умовах” (Харків 2004), Науково-практичній конференції „Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики” (Запоріжжя 2006 р.), ІІ Міжнародній науково-практичній конференції „Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономічні дослідження лікарських засобів та біологічно активних добавок” (Харків 2006 р.), Всеукраїнському конгресі «Сьогодення та майбутнє фармації» (Харків 2008 р.)

Публікації

Матеріали даної дисертаційної роботи опубліковано у 13 наукових роботах, серед яких 4 статті у наукових фахових виданнях, 7 тез доповідей, 1 патент на корисну модель та 1 методичні рекомендації.

Обсяг та структура дисертації

Дисертаційна робота складається зі вступу, 5 розділів, загальних висновків, списку літературних джерел та додатків. Загальний об'єм дисертації складає 141 сторінку. Робота ілюстрована 37 таблицями, 49 рисунками. Список використаних джерел містить 173 найменування, з них 51 - іноземних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У першому розділі наведено аналіз літературних даних з ботанічної та хімічної характеристики болиголову плямистого, його фармакологічної та токсикологічної дії, а також використання болиголову в народній медицині та гомеопатії. Проведений аналіз літературних даних виявив недостатнє вивчення різних груп біологічно активних речовин рослини і відсутність сучасних методів визначення коніїну.

У другому розділі описані: характеристика алкалоїду коніїну - основної діючої речовини болиголову плямистого; методи дослідження коніїну при проведенні хіміко-токсикологічного аналізу, а також методи дослідження груп БАР, які входять до складу болиголову.

Третій розділ «Попереднє визначення, виділення та хімічне вивчення біологічно активних речовин болиголову плямистого» присвячений вивченню груп БАР, які входять до складу болиголову.

Попередні дослідження підтвердили, що у всіх видах сировини є значна кількість гідроксикоричних кислот, вільних амінокислот, а також вуглеводів. Визначена присутність флавоноїдів та кумаринів. Для розділення комплексів БАР на основні групи і виділення сполук в індивідуальному стані з сировини був одержаний 50% спиртовий екстракт і проведено його фракціонування у системі рідини-рідина. З досліджуваної сировини виділено та ідентифіковано 17 речовин фенольної природи: 4 гідроксикоричних кислоти ( вперше: 5-0-кофеїл-D-хінна кислота (хлорогенова кислота), З-0-кофеїл-D-хінна кислота (неохлорогенова кислота), 4-0-кофеїл-D-хінна кислота (ізохлорогенова кислота)), 5 кумаринів (вперше: кумарин, умбеліферон (7-оксикумарин), скополетин(6-метокси-7оксикумарин), ізоскополетин, ескулетин), 8 флавоноїдів (вперше глікозиди флавоноїдів: кверцетин-3-0-в-D-глікопіранозид (ізокверцитрин), кемпферол - 3-0-в-D-глюкопіранозид (астрагалін), кемпферол - 3-0-а-L-арабофуранозид (кемпферол-3-арабінозид), кверцетин -3-0-в-D-галактопіранозид (гіперозид), кверцетин-3-0-в-D-рутинозид (рутин)).

З надземної частини болиголову виділено та вивчено водорозчинний полісахаридний комплекс, який складається, в основному, з галактуронової кислоти, галактози, арабінози з окремими включеннями глюкози, рамнози та ксилози. Це дозволяє віднести досліджуваний полісахаридний комплекс до групи глюкуроногликанів (див. табл. 1.)

Таблиця 1.. Результати дослідження полісахаридного комплексу болиголову

Полісахаридний комплекс болиголову	Вихід, %	Співвідношення моносахаридів, моль%	Вміст кислих моносахаридів, %	Вміст суми відновлюючих моносахаридів, %
		Glu	Gal	Ar	Kc	Rha
	17,15±0,34	15	43	23	10	9	8,15±0,16	10,21±0,25

На підставі проведених досліджень розроблений спосіб одержання комплексу полісахаридів з досліджуваної сировини (Пат. України №23879 від 11.06.2007 кл. А61К 36/00 G01N 30/02. Процес одержання та кількісного визначення полісахаридного комплексу з болиголову плямистого)

Аналіз жирних кислот трави та плодів болиголову проводили за допомогою методу газорідинної хроматографії на аналізаторі Т 339М (Мікротехніка, Прага, ЧР).

Ідентифіковано 11 жирних кислот. Сума жирних кислот в траві болиголову перевищує суму жирних кислот з плодів на 57%. У пробі з екстракту трави переважають такі кислоти, як пальмітинова та олеїнова, в плодах - олеїнова та лінолева кислоти. Лінолевої кислоти, яка міститься в плодах по кількості, в 2 рази більше ніж в екстракті з трави.

Визначено якісний та кількісний склад амінокислот. Аналіз проводили за допомогою амінокислотного аналізатора Т 339 (Мікротехніка, Прага, ЧР) на колонці h=45 см з іонітом Ostion LGANB. В результаті дослідження встановлена наявність 16 в траві та 13 в плодах основних амінокислот, в тому числі незамінних - 6 (треонін, валін, метіонін, лейцин, фенілаланін та лізин). Такі амінокислоти як лізин, аргінін та аланін не виявлені у зразках з екстракту плодів. Кількісний аналіз показує, що загальна кількість амінокислот в траві болиголову більша в порівнянні з пробою плодів на 67%, однак кількість окремих амінокислот, навпаки, перевищує кількість амінокислот, які знаходяться в траві, це - пролін та гістидин .

Визначено якісний та кількісний вміст 19 мікро та макроелементів (див табл.2.). В плодах та траві болиголову плямистого в найбільших кількостях акумулюються кремній, кальцій, магній, калій. Вказані елементи переважають в усіх зразках. В найменшій кількості в пробах трави та плодів містяться такі елементи як свинець, мідь, стронцій, молібден та цинк. Вміст кадмію, нікелю, кобальту, миш'яку та ртуті складає менше ніж 0,01мг/100г.

Таблиця 2. Вміст елементів в траві та плодах болиголову плямистого

№	Елемент	Вміст елементів мг/100г	№	Елемент	Вміст елементів мг/100г
		трава	плоди			трава	плоди
1	Fe	90	90	11	Mo	1	0,6
2	Si	530	440	12	Sr	1	1
3	P	270	220	13	Na	100	70
4	Mn	9	6	14	Zn	3	1
5	Al	50	55	15	Ni	0.01	0.01
6	Pb	0,3	0,1	16	Co	0.03	0.03
7	Ca	1040	900	17	Cd	0.01	0.01
8	Mg	400	320	18	As	0.01	0.01
9	K	3990	3490	19	Hg	0.01	0.01
10	Cu	0,3	0,2

Четвертий розділ «Виділення та вивчення коніїну в рослинній сировині та біологічному матеріалі» присвячений виділенню коніїну з рослинної сировини, розробці методик ідентифікації та кількісного визначення коніїну в рослинній сировині та біологічному матеріалі. Молекула основної діючої речовини представлена на рис.1.

Хімічна назва: (2S) - 2 - Пропілпіперидин (C₈H₁₇N), M.м. 127,3

Рис.1. Схема молекули коніїну

Для дослідження повноти екстракції діючих речовин болиголову плямистого були використані подрібнені надземні частини болиголову плямистого, зібрані до дозрівання плодів, спирт етиловий (96, 70 та 40%-вий) при співвідношенні рослинної сировини і екстрагента 1:15. Рослинну сировину настоювали протягом 1, 3, 7 і 14 діб. Аналіз проводили за величиною оптичної густини (А) спектрофотометрично на спектрофотометрі СФ-46 в кюветі з товщиною робочого шару 10 мм (результати досліджень представлені в таблиці 3.); за величиною сухого залишку в 100 мл екстракту (ваговим методом); за величиною плям коніїну (за допомогою ТШХ).

Таблиця 3. Значення оптичної густини (А) екстрактів (при л=268±2 нм)

Час наст., (діб)	Концентрація спирту етилового, %
Вих. значення (після 1-ї доби настоювання)	96	70	40
	0,823	0,768	0,700
3	0,831	0,846	0,889
7	0,852	0,862	0,901
14	0,874	0,890	0,916

Значення оптичної густини А досліджуваних екстрактів при довжині хвилі л=268 нм зростає зі збільшенням часу екстрагування. Найбільший приріст ?А спостерігається між 1 та 3 добами настоювання при концентрації екстрагента - 40%. Після 3-ї доби настоювання приріст ?А при всіх концентраціях екстрагента (40%, 70%, 96%) спостерігається незначний.

Результати дослідження екстрактів ваговим методом та ТШХ, підтверджують висновки, зроблені на підставі даних спектрофотометрії, про доцільність настоювання сировини не більш 3 діб, при цьому використання спирту різної міцності не є визначальним і з точки зору економічної доцільності, для отримання екстрактів болиголову плямистого, з оптимальним вмістом коніїну, достатньо використовувати 40% етанол. Якісне визначення коніїну, отриманого з рослинної сировини проводили за допомогою хімічних та фізико-хімічних методів. Результати реакцій коніїну з загальноалкалоїдними реактивами (крім утворення кристалів коніїну йодбісмутату) є неспецифічними і можуть використовуватися тільки як попередні дослідження.

Ґрунтуючись на літературних даних про те, що при солеутворенні в області довжин хвиль 260-270 нм з'являється максимум піку світлопоглинання коніїну, ми використали метод спектрофотометрії для дослідження коніїну, виділеного з рослини. Для проведення спектрофотометричного аналізу використовували розчини коніїну з кислотою сульфатною та хлоридною, з якими даний алкалоїд легко утворює солі. До хлороформних витяжок додавали водні розчини 0,05 М сульфатної та 0,1 М хлоридної кислот, реекстрагували коніїн з хлороформних в водно-кислі розчини (у вигляді солей). Знімали спектр досліджуваної речовини в діапазоні довжин хвиль 200-300 нм у кюветі товщиною 10 мм на спектрофотометрі моделі СФ-46. Як розчини порівняння використовували 0,05 М розчин кислоти сульфатної та 0,1 М розчин кислоти хлоридної. В інтервалі довжин хвиль 260-270 нм спостерігали характерний для коніїну максимум світлопоглинання. Встановлено, що розчини коніїну з кислотами сульфатною та хлоридною мають однаковий характер піку світлопоглинання, і, таким чином, спектрофотометрично коніїн можна ідентифікувати при його взаємодії з обома кислотами.

Для ідентифікації коніїну ми використовували метод ТШХ. Аналіз досліджуваних розчинів коніїну проводили на пластинках «Сорбфіл ПТСХ-ІІ-А» у 2-х системах розчинників: БОВ (бутанол - оцтова кислота - вода) 40:10:50 та метанол - 25% розчин амоніаку (100:1,5). У системі метанол-25% розчин амоніаку поділ речовин був кращий. У зразку екстракту спостерігали шість плям. При хроматографуванні в системі метанол-25% розчин амоніаку крім реактива Драгендорфа й УФ-світла як специфічний проявник коніїну був використаний лужний розчин натрію нітропрусиду. При цьому коніїн проявляється у виді червоних плям з Rf 0,26.

Таким чином, за допомогою методу ТШХ в системі розчинників метанол - 25% розчин амоніаку вдалося задовільно розділити коніїн і ідентифікувати його за допомогою специфічного проявника - лужного розчину натрію нітропрусиду.

Крім методу УФ-спектрофотометрії і ТШХ проводили дослідження коніїну за допомогою методу ВЕРХ на хроматографі «Міліхром А-02», малогабаритному (польовому), з автоматичним дозуванням проби, градієнтним насосом й багатоканальним спектрофотометричним детектором.

Для дослідження були використані: стандартний розчин коніїну (±Coniine, концентрація 99,4%, компанії Sigma, Німеччина) та зразки коніїну, отриманого з кислого настою болиголову (1:10) і виділеного з 40% водно-спиртового екстракту болиголову плямистого (1:15) методом перегонки з водяною парою.

У результаті хроматографування встановлено, що час утримування коніїну (розчин стандарту) за даних умов (обсяг проби - 1мкл; колонка 2мм*75мм; температура - 40^оС; нерухома фаза - Protonsil 120-C₁₈AQ; розмір часток - 5 мкм; елюент А - перхлорат літію; елюент В - ацетонітрил; потік - 100 мкл/хв; максимальний тиск - 3.0 мПа; довжина хвилі, нм - 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280, 300;режим однопроменевий, точність нормальна, кювета верхня, час 0,08 с.) складає при л= 280 нм - 10,60 хв. Також встановлено, що л=280 нм є оптимальним значенням довжини хвилі, при якому спостерігається максимум світлопоглинання з можливістю виключення інших речовин, які поглинають у діапазоні 210-220 нм. Нами була проведена ідентифікації коніїну, виділеного й очищеного з рослинної сировини, а також проведені дослідження з його ідентифікації безпосередньо в екстракті з болиголову. Умови проведення аналізу ті самі, що й при хроматографуванні коніїну стандарту, за виключенням об'єму проби - 2 мкл та максимального тиску - 2,3 мПа.

Збільшення часу утримування коніїну в пробі з екстракту (10,85 хв.) в порівнянні з очищеним коніїном (10,60 хв.) пов'язано з наявністю в екстракті крім коніїну великої кількості речовин, що перейшли в екстрагент при настоюванні і які при спільному хроматографуванні змінюють процес поділу компонентів на колонці. При реєстрації сигналів у короткохвильових областях кількість піків зростає, що вказує на наявність великої кількості речовин, що перейшли в екстракт. Таким чином, використання високоефективної рідинної хроматографії дає можливість об'єктивно ідентифікувати коніїн як у чистому виді, так і коніїн, що знаходиться в екстракті. болиголов плямистий коніїн алкалоїд

Для розробки методу кількісного визначення алкалоїду коніїну проведені дослідження з використанням методів молекулярно-абсорбційного аналізу: УФ-спектрофотометрії, фотоелектроколориметрії, та ВЕРХ.

Кількісне визначення алкалоїду методом УФ-спектрофотометрії проводили за допомогою градуювального графіка, для побудови якого використовували стандарт коніїну, компанії Sigma Aldrich. Оптичну густину стандартних розчинів (розчини коніїну з сульфатною кислотою визначених концентрацій: 1,0, 3,0, 5,0, 7,0, 9,0 мг у 10 мл) вимірювали на спектрофотометрі СФ-46 у кюветі товщиною 10 мм, при довжини хвилі л=268±2 нм. Встановлено, що чутливість методу становить 1мг у 10 мл проби. Відносна помилка методу складає ±2,73%. За допомогою методу була визначена концентрація коніїну в 40% водно-спиртовому екстракті зі свіжозібраної трави болиголову - 0,53%.

Ґрунтуючись на даних літератури, що коніїн реагує з сумішшю роданіду амонію і сульфату кобальту (у співвідношенні 1:5) і утворює забарвлену сполуку, яка екстрагується нітробензолом, забарвлюючи його в синій колір, нами був побудований градуювальний графік для кількісного визначення коніїну за допомогою екстракційно-фотометричного методу. Для побудови графіка використовували стандартні розчини коніїну (від 0,2 до 2 мг в 10 мл). Оптичну густину нітробензольних витяжок, які забарвленні в синій колір, вимірювали за допомогою фотоелектроколориметра КФК-2 (світлофільтр червоний, кювета з товщиною шару 10 мм). Розчином порівняння була нітробензольна витяжка з сумішшю реактивів. Чутливість методу становить 0,2 мг у 10 мл. При цьому відносна помилка не перевищувала ± 2,43% Після побудови градуювального графіка проводили визначення коніїну в водно-спиртових екстрактах. При цьому досліджували вміст коніїну в залежності від терміну зберігання рослинної сировини. Була визначена концентрація коніїну, що знаходиться в рослинній сировині - 0,16%. Практично такі ж дані отримані за допомогою методу УФ-спектроскопії.

На основі отриманих даних кількісного визначення коніїну методом фотоелектроколориметрії та УФ-спектрофотометрії, можна зробити висновок, що при зберіганні рослинної сировини більше 1 року, вміст основної діючої речовини зменшується в 3 рази в порівнянні зі свіжозібраною травою болиголову плямистого.

Кількісне визначення коніїну в модельних розчинах методом ВЕРХ проводили з урахування його максимуму поглинання в УФ-області спектра при довжині хвилі л= 280 нм.

Для кількісного визначення коніїну в об'єктах досліджень використовували градуювальний графік, побудований в координатах - площа піка (S_{коніїну}) - концентрація коніїну (C, мкг/мл) у стандартному розчині (вміст препарату - 9,94 мкг/мл). Встановлено, що чутливість методу складає 1 мкг/мл. Відтворюваність та надійність результатів, отриманих за розробленою методикою, перевіряли на модельних розчинах, при цьому відносна помилка не перевищувала ± 1,29% (табл.4.).

Таблиця 4. Результати кількісного визначення коніїну в модельних розчинах методом ВЕРХ

Концентрація коніїну, мкг/мл	Площа піка, (S)	Визначена концентрація	Метрологічні характеристики (n=5)
		мкг	%
0,9940	0,002717	1,004	101,0	=99,72% =1,077 =0,46 =±1,29 =1,29% ±=99,72±1,29%
1,9880	0,004943	1,972	99,2
4,9700	0,01274	4,995	100,5
6,9580	0,0185	6,847	98,4
9,9400	0,02504	9,890	99,5

Було проведено визначення кількості коніїну в рослинній сировині. Для аналізу використовували водно-спиртові екстракти болиголову плямистого.. Встановлено, що в екстракті з болиголову, концентрація коніїну становить 0,52%.

На підставі отриманих даних визначення коніїну методами УФ-спектрофотометрії, ФЕК та ВЕРХ, зроблено висновок, що ВЕРХ є найбільш чутливим з наведених в роботі методів кількісного визначення алкалоїду коніїну в рослинній сировині і може бути використаний для ідентифікації алкалоїду безпосередньо в екстракті. Ґрунтуючись на результатах проведених досліджень була запропонована схема одержання коніїну та аналізу рослинної сировини на його наявність

Розроблена методика ідентифікації та кількісного визначення коніїну за допомогою методу ВЕРХ в рослинній сировині була застосована і для виділення та визначення коніїну в біологічному матеріалі (органи отруєних тварин).

Для дослідів використовували щурів масою 170-200 г, що не одержували їжі протягом доби. Відомо, що LD₅₀ для мишей при пероральному введенні складає 100 мг/кг. Токсичну дозу розраховували, виходячи з того, що LD₅₀ для щурів при пероральному введенні складає 100*2,64/1,89 = 140 мг/кг тварини. Для дослідження брали кров, серце, печінку, нирки, мозок та шлунок зі вмістом.

Виділення коніїну з органів проводили за допомогою методу ізолювання водою, підкисленою кислотою сульфатною (метод В.П. Крамаренка)

Результати ВЕРХ-аналізу коніїну виділеного з органів отруєних тварин свідчать, що піки коніїну на хроматограмах розчинів витяжок з органів тварин співпадають з піком коніїну на хроматограмі стандартного розчину за часом утримання з точністю ±2,7%. Встановлено, що з досліджуваних об'єктів тваринного походження вдається виділити близько 52% коніїну. Дані вказують, що при летальних отруєннях коніїном на хіміко-токсикологічні дослідження варто відправляти кров, шлунок, нирки.

Графічно розподіл коніїну в органах отруєних тварин можна навести у вигляді діаграми)

На основі проведених досліджень розроблено схему хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на коніїн (рис.2.)

Рис.2. Схема хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на коніін

У п'ятому розділі «Морфологічно-анатомічне вивчення болиголову плямистого» описані результати морфологічних та анатомічних досліджень незрілих плодів болиголову, що мають найбільший вміст основної діючої речовини - коніїну порівняно з іншими частинами рослини і представляють найбільший інтерес для хіміко-токсикологічного аналізу.

В результаті проведених досліджень встановлені характерні діагностичні ознаки плодів болиголову плямистого: багатогранна епідерма з рідкими, дрібними продихами, сосочковидна по борозенках і з одноклітинними волосками по боках ребер; неоднорідні клітини мезокарпу з кільцем багаточисленних дрібних вмістищ, розміщених ближче до ендокарпу і одиночні вмістища в ребрах над провідними пучками; крупні клітини ендокарпу і дрібні - зовнішнього шару ендосперму, заповнені темно-коричневим вмістом, який дає позитивну реакцію на алкалоїди з реактивом Драгендорфа, Вагнера та пікролоновою кислотою; наявність порожнин у флоемі всередині ребер, утворених личинками комах; крупний провідний пучок всередині ребра, утворений з двох дрібних.

Також проведені дослідження з вивчення фрагментів трави болиголову в порівнянні з близькими видами рослин (петрушки кучерявої та бутня Прескотта). Характерними діагностичними ознаками трави болиголову плямистого є: піхва, основну масу піхви складає дуже крупна, тонкостінна паренхіма, серед якої проходить від 7 до 15 колатеральних провідних пучків; черешок - округлий, слабо ребристий, з борозенкою на верхній стороні і порожниною в центрі. Провідних пучків від 7 до 11. Три, більш крупні, розміщуються знизу. Проти пучків розміщуються дрібні схизогенні канальці. Елементи ксилеми широкопросвітні, в них переважають спіральні судини; центральна жилка округла, або 5-лопатева. В ній проходить 7 провідних пучків. Жилки бокових сегментів трьохлопатеві з глибокою борозенкою з нижньої сторони; епідерма зовнішньої сторони піхви крупноклітинна, паренхімно-прозенхімна, з рідкими дрібними продихами анізоцитного типу, з внутрішньої сторони - паренхімна, тонкостінна, з дуже рідкими продихами. Епідерма черешка по горбочках прямостінна, прозенхімна, між горбочками - паренхімна, багатогранна, з повздовженьою складчастістю кутикули, продихи дрібні, рідкі, анізоцитного типу; листкові сегменти в основному дорзивентрального типу. Провідні пучки проходять по губчастій паренхімі. На зубчиках сегментів є водяні устячка. По краю сегментів є сосочковидні утворення. Нижня епідерма сегментів звивистостінна, дуже тонкостінна, продихи не часті, анізоцитного типу. Верхня епідерма більш крупно-клітинна, звивисто-стінна, без продихів.

За результатами морфологічного і анатомічного вивчення трави болиголову плямистого та близьких видів (бутня Прескотта і петрушки кучерявої) видано методичні рекомендації «Відмінні макро- та мікроскопічні ознаки болиголову плямистого, бутня Прескотта та петрушки кучерявої».Отримані дані використані для розробки аналітичної нормативної документації на траву болиголову.

ЗАГАЛЬНІ ВИСНОВКИ

1. Вперше проведено комплексне фармакогностичне вивчення трави та незрілих плодів болиголову плямистого. Встановлено в них наявність полісахаридів, аміно- та жирних кислот (вперше) та флавоноїдів, гідроксикоричних кислот, кумаринів, мікро- та макроелементів.

2. З досліджуваної сировини виділено та ідентифіковано 17 речовин фенольної природи: 4 гідроксикоричних кислоти (вперше: 5-0-кофеїл-D-хінна кислота (хлорогенова кислота), З-0-кофеїл-D-хінна кислота (неохлорогенова кислота), 4-0-кофеїл-D-хінна кислота (ізохлорогенова кислота)), 5 кумаринів (вперше: кумарин, умбеліферон (7-оксикумарин), скополетин (6-метокси-7оксикумарин), ізоскополетин, ескулетин), 8 флавоноїдів (вперше глікозиди флавоноїдів: кверцетин-3-0-в-D-глікопіранозид (ізокверцитрин), кемпферол-3-0-в-D-глюкопіранозид (астрагалін), кемпферол-3-0-а-L-арабофуранозид (кемпферол-3-арабінозид), кверцетин-3-0-в-D-галактопіранозид (гіперозид), кверцетин-3-0-в-D-рутинозид (рутин)).

3. Вперше розроблено схему одержання екстракту болиголову плямистого та дослідження його на наявність коніїну.

4. Розроблено сучасний метод якісного та кількісного визначення основної діючої речовини - алкалоїду коніїну в рослинній сировині та біологічному матеріалі і досліджено розподіл коніїну в органах отруєних тварин.

5. На підставі проведених досліджень запропоновано схему хіміко-токсикологічного дослідження біологічного матеріалу придатну для хіміко-токсикологічного аналізу на коніїн.

6. Розроблений спосіб одержання комплексу полісахаридів з досліджуваної сировини. Новизна досліджень підтверджена патентом на корисну модель №23879 «Процес одержання та кількісного визначення полісахаридного комплексу з болиголова плямистого» від 11 червня 2007 р.

7. Вперше встановлені основні анатомо-діагностичні ознаки плодів та трави болиголову плямистого в порівнянні з близькими видами - бутнем Прескотта та петрушкою кучерявою.

8. За результатами морфологічного і анатомічного вивчення трави болиголову плямистого та близьких видів (бутня Прескотта і петрушки кучерявої) видано методичні рекомендації «Відмінні макро- та мікроскопічні ознаки болиголову плямистого, бутня Прескотта та петрушки кучерявої» та розроблено проект АНД на сировину.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Малиновський Ю.Ю. Виділення коніїну з болиголову плямистого та його ідентифікація хімічними та фізико-хімічними методами / Ю.Ю. Малиновський, В.С. Бондар, А.Г. Сербін // Історія та перспективи розвитку фармацевтичної науки і освіти: зб. наук. ст. - Запоріжжя, 2004 - Вип. XII, т. III. - С. 241-245. (Особистий внесок - планування експерименту, підготовка зразків та інтерпретація отриманих даних).

2. Малиновський Ю.Ю. Анатомо-гістохімічне вивчення болиголову плямистого / Ю.Ю. Малиновський, Л.С. Картмазова, В.С. Бондар // Медична хімія - 2005. Т. 7, №3. - С. 70-73. (Особистий внесок - планування експерименту та інтерпретація отриманих даних).

3. Малиновський Ю.Ю. Вивчення жирнокислотного та амінокислотного складу трави та плодів болиголову плямистого (Сonium maculatum L.) / Ю.Ю. Малиновський, В.С. Бондар // Вісник Фармації - 2007. №2 (50). - С. 15-18. (Особистий внесок - планування та постановка експерименту, інтерпретація отриманих даних).

4. Малиновський Ю.Ю. Вивчення полісахаридів трави болиголову плямистого / Ю.Ю. Малиновський, В.М. Чушенко, В.С. Бондар // Медична хімія - 2007. Т. 9, №3.- С. 100-102. (Особистий внесок - планування експерименту, підготовка зразків та інтерпретація отриманих даних).

5. Малиновський Ю.Ю.Виділення коніїну з рослинної сировини та його ідентифікація / Ю.Ю. Малиновський, В.С. Бондар, А.Г. Сербін // Тези доповідей міжвуз. наук. студ. конф., м. Харків, 17-18 квіт. 2003 р. Х., 2003. - С. 35.

6. Малиновський Ю.Ю. Виділення коніїну з болиголову плямистого та його ідентифікація хімічними та фізико-хімічними методами / Ю.Ю. Малиновський, В.С. Бондар, А.Г. Сербін // Україна наукова 2003: міжнар. наук.-практ. конф., Дніпропетровськ, 16-20 черв. 2003 р. - Дніпропетровськ, 2003. Т. 12. - С. 55-56.

7. Малиновський Ю.Ю. Вивчення анатомічної будови плодів болиголову плямистого / Ю.Ю. Малиновський, А.Г. Сербін, В.С. Бондар // Ліки України 2004. №9 (86) (додаток). С. 154.

8. Малиновський Ю.Ю. Використання методів УФ-спектроскопії та фотоколориметрії для кількісного визначення алкалоїду коніїну / Ю.Ю. Малиновський, А.Г. Сербін, В.С. Бондар // Ліки України 2004. №9 (86) (додаток). - С. 140.

9. Малиновський Ю.Ю. Фенольні сполуки болиголову плямистого / Ю.Ю. Малиновський, В.С. Бондар // Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики: зб. наук. ст. Запоріжжя, 2006. - Вип. XV, т. 1 - С. 241-242.

10. Малиновський Ю.Ю. Ідентифікація та кількісне визначення діючих речовин болиголову плямистого / Ю.Ю. Малиновський, В.С. Бондар // Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономічні дослідження лікарських засобів та біологічно активних добавок: міжнар. наук.-практ. конф., м. Харків, 12-13 жовт. 2006 р. - Х., 2006. - С. 93-95.

11. Малиновський Ю.Ю. Розробка методу кількісного визначення коніїну / Ю.Ю. Малиновський, В.С. Бондар // Сьогодення та майбутнє фармації: всеукр. конгр., м. Харків, 16-19 квіт. 2008 р. - Х., 2008. - С. 93.

12. Пат. Україна №23879 (U2007 00913). МПК А61К 36/00 G01N 30/02. Процес одержання та кількісного визначення полісахаридного комплексу з болиголова плямистого / Ю.Ю. Малиновський, В.М. Чушенко, В.С. Бондар заявл. 29.01.2007; опубл. 11.06.2007, Бюл.№8, 2007 р.

13. Відмінні макро- та мікроскопічні ознаки болиголову плямистого, бутня Прескотта та петрушки кучерявої: метод. рек. / В.С. Бондар, Ю.Ю. Малиновський. К., 2007. - 19 с. (Затверджено проблем. комісією «Фармація», протокол №43 від 15.11.2006 р.)

Малиновський Ю.Ю. Фармакогностичне та токсикологічне вивчення болиголову плямистого. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія. - Національний фармацевтичний університет, м. Харків, 2009.

Дисертаційна робота присвячена фармакогностичному та хіміко-токсикологічному вивченню болиголову плямистого (Conium maculatum L.).

Вперше проведено фармакогностичне вивчення трави та незрілих плодів болиголову плямистого. Встановлено в них наявність полісахаридів, аміно- та жирних кислот (вперше), мікро- та макроелементів. З досліджуваної сировини виділено та ідентифіковано 17 речовин фенольної природи.

Розроблено сучасний метод якісного та кількісного визначення алкалоїду коніїну в рослинній сировині та біологічному матеріалі. Проведені дослідження по розподілу коніїну в органах отруєних тварин і запропоновано схему хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на наявність коніїну.

Експериментально встановлені основні анатомо-діагностичні ознаки плодів та трави болиголову плямистого в порівнянні з близькими видами - бутнем Прескотта та петрушкою кучерявою.

За результатами досліджень видано методичні рекомендації «Відмінні макро- та мікроскопічні ознаки болиголову плямистого, бутня Прескотта та петрушки кучерявої». Розроблений спосіб одержання комплексу полісахаридів з досліджуваної сировини. Новизна досліджень підтверджена патентом на корисну модель №23879 «Процес одержання та кількісного визначення полісахаридного комплексу з болиголова плямистого» від 11 червня 2007 р.

Ключові слова: болиголов плямистий, фенольні сполуки, полісахаридний комплекс, коніїн, високоефективна рідинна хроматографія, екстракція, біологічний матеріал, хіміко-токсикологічний аналіз.

Малиновский Ю.Ю. Фармакогностическое и химико-токсикологическое изучение болиголова пятнистого. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.02. - фармацевтическая химия и фармакогнозия. - Национальный фармацевтический университет. Харьков, 2009.

Диссертационная работа посвящена фармакогностическому и химико-токсикологическому изучению болиголова пятнистого (Conium maculatum L.).

Впервые проведено фармакогностическое изучение травы и незрелых плодов болиголова пятнистого. Установлено наличие в них полисахаридов, амино и жирных кислот (впервые), гидроксикоричных кислот, флавоноидов, кумаринов, микро и макроелементов. Из исследуемого сырья выделено и идентифицировано 17 веществ фенольной природы: 4 гидроксикоричных кислоты (впервые: 5-0-кофеил-D-хинная кислота (хлорогеновая кислота), З-0-кофеил-D-хинная кислота (неохлорогеновая кислота), 4-0-кофеил-D-хинная кислота (изохлорогеновая кислота)), 5 кумаринов (впервые: кумарин, умбелиферон (7-оксикумарин), скополетин (6-метокси-7оксикумарин), изоскополетин, эскулетин), 8 флавоноидов (впервые гликозиды флавоноидов: кверцетин-3-0-в-D-гликопиранозид (изокверцитрин), кемпферол - 3-0-в-D-глюкопиранозид (астрагалин), кемпферол-3-0-а-L-арабофуранозид (кемпферол-3-арабинозид), кверцетин -3-0-в-D-галактопиранозид (гиперозид), кверцетин-3-0-в-D-рутинозид (рутин)).

Проведены исследования по изучению полноты экстракции действующих веществ из исследуемого растительного сырья в зависимости от концентрации растворителя и времени экстракции. С помощью методов УФ-спектроскопии и тонкошаровой хроматографии определено оптимальное время экстракции с использованием 40% этилового спирта - 3 дня.

С использованием химических и физико-химических методов проведено качественное определение конина, выделенного из растительного сырья. Установлено, что с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) алкалоид кониин может быть качественно обнаружен как в очищенном виде, так и непосредственно в экстракте из растительного сырья. Полученные результаты количественного определения конина методами УФ-спектрофотометрии, фотоэлектроколориметрии и ВЭЖХ, позволили установить, что ВЭЖХ является наиболее чувствительным из приведенных в работе методов. Чувствительность метода составляет 1мкг/мл (относительная ошибка ±1,29%). По результатам исследований разработан современный метод качественного и количественного определения алкалоида и предложена схема получения экстракта из болиголова и анализа его на кониин.

Изучено распределение кониина в органах отравленных животных. Установлено, что из объектов животного происхождения удается выделить около 52% кониина. При летальных отравлениях кониином на химико-токсикологические исследования следует отправлять кровь, желудок, почки. На основании результатов эксперимента разработана схема химико-токсикологического анализа биологического материала.

Экспериментально установлены основные анатомо-диагностические признаки плодов и травы болиголова пятнистого в сравнении с близкими видами - бутнем Прескотта та петрушкой кучерявой. По результатам морфологических и анатомических исследований травы болиголова пятнистого изданы методические рекомендации «Отличительные макро- и микроскопические признаки болиголова пятнистого, бутня Прескотта и петрушки кучерявой».

Разработан способ получения комплекса полисахаридов из исследуемого сырья. Новизна исследований подтверждена патентом на полезную модель №23879 «Процесс получения и количественного определения полисахаридного комплекса из болиголова пятнистого» от 11 июня 2007 г.

Ключевые слова: болиголов пятнистый, фенольные соединения, полисахаридный комплекс, кониин, высокоэффективная жидкостная хроматография, экстракция, биологический материал, химико-токсикологический анализ.

Malinovsky Y.Y. “Pharmacognostic and chemico-toxicological study of hemlock”. Manuscript.

Thesis for a competition of an academic degree of candidate of pharmaceutical on speciality 15.00.02 - pharmaceutical chemistry and pharmacognosy. - National university of pharmacy, Kharkov, 2009.

The Thesis is devoted to pharmacognostic and chemico-toxicological study of Conium maculatum.

The pharmacognostic study of grass and immature garden-stuffs of hemlock was first conducted. The presence of polysaccharides, amino- and fat acids (first), macro and trace elements was set in it. From the explored raw material it was selected and identified 17 compounds of phenolic nature.

The modern method of qualitative and quantitative determination of alkaloid coniine was developed in vegetable matter and biological material. Researches were conducted for distributing of coniine in the organs of the poisoned animals and the scheme of chemico-toxicological analysis of biological material for the presence of coniine was offered

Basic anatomical diagnostic signs of garden-stuffs and grass of hemlock as compared to similar species - Chaerophyllum Preskotti DC. and Petroselinum crispum (Mill.) were determined. As a result of researches methodical recommendations «Distinguishing macro- and microscopic signs of Conium maculatum (L.), Chaerophyllum Preskotti DC. and Petroselinum crispum (Mill.)» were published out.. The method of obtaining of polysaccharide's complex from the investigated vegetable material. was developed The newness of researches was confirmed by a patent on an useful model №23879 «Process of receiving and quantitative determination of polysaccharide's complex from hemlock» from June, 11 2007 р

Key words: conium maculatum, phenolic compounds, complex of polysaccharides, coniine, high-performance liquid chromatography, extraction, biological material, chemico-toxicological analysis.

Размещено на Allbest.ru