Іммобілізація біолігандів на полістирольних колоїдних частинках з функціоналізованою поверхнею

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ “ЛЬВІВСЬКА ПОЛІТЕХНІКА”

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук

02.00.06 - хімія високомолекулярних сполук

ІММОБІЛІЗАЦІЯ БІОЛІГАНДІВ НА ПОЛІСТИРОЛЬНИХ КОЛОЇДНИХ ЧАСТИНКАХ З ФУНКЦІОНАЛІЗОВАНОЮ ПОВЕРХНЕЮ

ВИКОНАЛА ФЕДОРОВА ОЛЕНА ВАЛЕРІЇВНА

Львів - 2008



АНОТАЦІЯ

Федорова О.В. Іммобілізація біолігандів на полістирольних колоїдних частинках з функціоналізованою поверхнею. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.06 - хімія високомолекулярних сполук.- Національний університет “Львівська політехніка”, Львів, 2008.

Дисертаційна робота присвячена створенню вітчизняних діагностичних полімерних тест-систем на основі композицій полімер-біополімер. Розроблено умови синтезу полістирольних мікросфер методом емульсійної беземульгаторної полімеризації для одержання монодисперсних, агломераційно стійких у фізіологічних розчинах полімерних дисперсій з заданим комплексом властивостей. Створена оригінальна методика модифікації поверхні полістирольної дисперсії методом зародкової полімеризації, з використанням суміші водо- та олієрозчинних ініціаторів та структурно-механічних стабілізаторів, без додаткового зародження нових частинок дисперсної фази в ході модифікації.

Методом рентгеноелектронної спектроскопії встановлено склад та структуру міжфазного шару полістирольних дисперсій з контрольованою природою поверхні. Вивчено вплив способу іммобілізації біолігандів на стійкість полімерної дисперсії. Одержано ряд високочутливих полімерних біотест-систем для діагностики інфекційних захворювань.

Ключові слова: полімерна мікросфера, емульсійна беземульгаторна полімеризація, зародкова полімеризація, іммобілізація біоліганду, полімерна діагностична тест-система.

полімерізація фагоцитоз ковалентний біоліганд



1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність роботи. Полімерні дисперсії з функціональними групами на поверхні частинок дисперсної фази широко використовуються в біотехнології, мікробіології, біохімії, фармакології та інших галузях.

Розробка сучасних, високотехнічних, простих у виконанні полімерних тест-систем для експрес-діагностики різних захворювань та вивчення рецепторного апарату клітин є актуальним напрямком у біотехнології, медицині, імунології. Для створення полімерних тест-систем в останні роки широко використовують як носії біолігандів полімерні мікросфери.

Для успішного використання вони повинні мати певний діаметр, вузький розподіл за розмірами, зберігати агломераційну стійкість при синтезі, зберіганні, іммобілізації біолігандів в буферних розчинах. В зв`язку з цим достатньо актуальним є синтез полімерних частинок для біохімічних досліджень. Виробництва полімерних дисперсій подібного типу в Україні немає, і в даний час реакцію латекс-аглютинації проводять з використанням закордонних діагностикумів.

Отже, актуальною є проблема розроблення вітчизняних полімерних діагностичних тест-систем на основі композицій полімер-біополімер, завдяки здатності полімерних мікросфер з функціональною поверхнею ковалентно іммобілізувати біоспецифічні ліганди.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є частиною фундаментальних досліджень кафедри технології біологічно активних сполук, фармації та біотехнології Національного університету «Львівська політехніка» (№ держреєстрації 0100U00518, 0104U002315, 0102U001199), а також виконана у відповідності з державними науково-технічними програмами 1.02 «Створення, вивчення та впровадження в практику охорони здоров'я України гостронеобхідних лікарських засобів», 7.03.01 «Нові речовини та матеріали малотоннажного хімічного виробництва» і 03.06 «Нові екологічно безпечні лікувальні засоби», що є підтвердженням актуальності та перспективності даних досліджень.

Мета роботи.

Розробка методів та методик синтезу полімерних дисперсій з вузьким розподілом частинок за розмірами та реакційноздатною поверхнею дисперсної фази, здатної до формування міжфазних шарів спеціального призначення.

На основі одержаних дисперсій розробка шляхів модифікації поверхні частинок для іммобілізації біолігандів для створення систем медичного призначення та імунодіагностики.

Для реалізації цієї мети були поставлені наступні завдання:

синтезувати полістирольні мікросфери з діаметром 0,5-1,5 мкм та вузьким розподілом за розмірами;

провести модифікацію поверхні полістирольних частинок методом полімеризації на зародках з одержанням композитних частинок структури "ядро-оболонка" з визначеною природою функціональних груп;

створити композиції полімер-біополімер з заданою відстанню біоспецифічного ліганду від полімерної матриці;

розробити експериментальні серії нових полімерних діагностичних тест-систем;

розробити методики для вивчення фагоцитозу, застосовуючи синтезовані полімерні мікросфери.

Об'єкт дослідження - полістирольні дисперсії з функціоналізованою поверхнею, придатною до фізичної чи ковалентної взаємодії з біолігандами.

Предмет дослідження - синтез полімерних дисперсій, ковалентна іммобілізація антигенів та антитіл на їх поверхні, створення полімерних імунотестів.

Методи дослідження - беземульгаторна емульсійна полімеризація стиролу, зародкова полімеризації функціональних мономерів на синтезованих зародкових частинках, фотон-корреляційна спектроскопія, світлова мікроскопія, гравіометричний метод аналізу, гель-проникаюча хроматографія, рентгеноелектронна спектроскопія, неперервна ультрафільтрація на ядерних фільтрах, метод Лоурі, реакція латексної аглютинації (РЛА) (з використанням 96-лункової мікропланшети).

Наукова новизна.

Розроблено умови синтезу полістирольних монодисперсних, агломераційно стійких у фізіологічних розчинах полімерних дисперсій з функціоналізованою поверхнею та заданим комплексом властивостей.

Вперше встановлено основні закономірності модифікації функціональними мономерами поверхні полістирольної дисперсії методом зародкової полімеризації, що полягає у використанні суміші водо- та олієрозчинних ініціаторів та структурно-механічних стабілізаторів, яка дозволяє повністю зупинити зародження нових частинок дисперсної фази в ході модифікації.

Методом рентгеноелектронної спектроскопії встановлено склад та структуру міжфазного шару полімерних мікросфер з контрольованою природою поверхні.

Доказано доцільність іммобілізації імуноглобуліну G на поверхню частинок полістирольної дисперсії через спейсор. Визначено оптимальні умови спільної адсорбції желатини та альбуміну на поверхню полістирольних мікросфер для одержання полімерної тест-систем на фібронектин.

Практичне значення одержаних результатів.

Розроблено метод одержання полістирольних колоїдних частинок з функціоналізованою поверхнею та заданим комплексом властивостей.

Розроблено лабораторні регламенти на нові полімерні діагностичні тест-системи для їх серійного виробництва, а саме для визначення ревматоїдного фактору, аутоантитіл до тіреоглобуліну щитоподібної залози в сироватці крові людини методом реакції латексної аглютинації (РЛА).

Одержано контрольовані полімерні тест-системи для детектування на клітинах фібронектину та фіксованих на клітинній мембрані імунних комплексів при фагоцитозі. Проведено дослідження фагоцитозу за допомогою модифікованих та не модифікованих опсонінами полімерних мікросфер.

Розроблена методика продукування антитільних діагностикумів для виявлення:

- концентрації антигенів (Y.enterocolitica серотипу 03, L canicola, S.pulorum, вірусу ИБК штам Н120) у біологічних середовищах (шляхом іммобілізації антитіл через ковалентно зв`язаний спейсор - протеїн А);

- концентрації правцевого анатоксину (ПА) (шляхом прямої іммобілізації антитіл до функціональних груп біоліганду).

Результати роботи сприяють розширенню та впровадженню імунодіагностики в медичну практику України, та дозволяють налагодити виробництво серії вітчизняних імунотестів, значно дешевших за імпортні.

Особистий внесок здобувача полягає в розробці, опрацюванні методик та у проведенні експериментальних досліджень, в обробці одержаних даних та в теоретичному обгрунтуванні одержаних результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи доповідались на Міжнародній конференції « Органическая химия от Бутлерова и Бейльштейна до современности» (Санкт-Петербург, Росія, 2006), ІХ Українському Біохімічному з`їзді (Харків,2006), ІІІ Всеукраїнській Науково-практичній конференції ”Біотехнологія. Освіта Практика” ( Харків 2006), 20^th Conference of the European Colloid and Interface Society (Budapest, Hungary, 2006), Ukrainian-German Symp.on Nanobiotechnology (Київ,2006), ІV Всеросійській Каргінській конференції “Наука о полимерах 21-му веку”( Москва, Росія,2007), ХХI Українській конференції з органічної хімії (Чернігів, 2007), “Reactiv Polimer in inhomogeneous System, in Melts, and at interfaces” (Dresden, Germany, 2007), V Польсько-українській конференції “ Полімери спеціального призначення” (“Polymers of special applications”, Radom, Poland, 2008) (Радом, Польща, 2008).

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

В першому розділі дисертаційної роботи проведено аналіз літературних джерел з питань синтезу монодисперсних полімерних носіїв методом суспензійної та емульсійної полімеризації. Розглянуто особливості синтезу та будови полімерних мікросфер, одержаних методом зародкової полімеризації, адсорбцію білків на полімерних мікросферах з різними функціональними групами на поверхні, методи активації функціональних груп частинок полімерних дисперсій для можливості ковалентної взаємодії з функціональними групами біолігандів. Показана перспективність одержання біологічно активних полімерних мікросфер для використання їх як носіїв для іммобілізації біоактивних лігандів.

Обгрунтовано шляхи використання іммобілізованих систем в біотехнології, медицині, імунодіагностиці.

У другому розділі наведено характеристики вихідних речовин і методики проведення експериментів. Мономери (стирол, метакрилова кислота (МАК), акролеїн, стиролсульфонат натрію), ініціатори (динітрилазобісізомасляної кислоти (ДАК), персульфат калію (ПСК)) очищували за стандартною методикою. Полівінілпіролідон (ПВП) з молекулярною масою 40000 використовували марки “хч” без додаткової очистки. Додецилсульфонат натрію, емульгатор іоногенного типу, використовували марки “чда”. ПАР- полідиметилсілоксан (ПДС), синтезований в ІНЕОС РАН. Фосфатно-сольовий буфер (ФСБ рН=7,2) одержаний згідно описаної в літературі методиці. Карбодиімід, продукт фірми “Merck”. Альбумін ліофілізований (з людської сироватки), серія 89041631 фірми Raanal. Вміст (електрофоретично, на суху речовину) не менше 95%. Дисперсійне середовище - вода (дистилят). Желатина кістково-лужна - середня молекулярна маса 95,10 кДа. Моноспецифічна сироватка проти Іg людини (кроляча) одержана в ІЕМ РАМН РФ, використовували без додаткової очистки. Пулорозна кроляча сироватка з титром у бактеріальній аглютинації (РА)-1:400. Імунна кишково-ієрсиніозна сироватка кроля, відтитрована в пасивній гемаглютинації (РПГА)- 1:6400. Позитивна сироватка проти ІБК, представлена ВГНКІ. Протеїн А - рекомбінатний білок А, що cекретується штаммом B.Subtilis. Формалін (40%-вий розчин). Азід натрію, марки “хч”.

Синтез полістирольних мікросфер здійснювали за методиками проведення емульсійної беземульгаторної полімеризації. Полімерні дисперсії для іммобілізації біолігандів синтезували зародковою кополімеризацією функціональних мономерів на полістирольних зародкових частинках. Розмір частинок визначали методом електронної мікроскопії за допомогою мікроскопа S-570 “Hitachi” (Японія), молекулярні маси методом гель-проникаючої хроматографії, розподіл частинок за розмірами (РЧР) на приладі “Malvern Autosizer”. У роботі використовували ультрацентрифугування та потенціометричні методи дослідження. Гідрофільно-гідрофобні властивості поверхні полімерних мікросфер визначали оптичною мікроскопією. Рентгеноелектронні спектри, що розглядаються в роботі, одержані на електростатичному спектрометрі МК ІІ фірми VG Scientific (Англія).

Наведені методики іммобілізації білків на поверхні полістирольних мікросфер, методика визначення масової частки білка за Лоурі, вибір сенсибілізуючої дози діагностикумів та методика проведення реакції латексної аглютинації (РЛА).

У третьому розділі наведені результати досліджень розроблених методів формування монодисперсних полімерних мікросфер на основі полістиролу методом емульсійної беземульгаторної полімеризації.

Не дивлячись на те, що метод полімеризації стиролу за відсутності емульгатора широко використовується для синтезу частинок з вузьким розподілом за розмірами, не існує універсальних методик синтезу полімерних дисперсій з середнім діаметром частинок ?1,5 мкм, які б відповідали вимогам, що до них висуваються при застосуванні в імунохімії. В зв'язку з цим виникла необхідність проведення спеціальних досліджень, які б дозволили визначити оптимальні умови їх одержання.

Діаметр частинок в першу чергу залежить від концентрації ініціатора та мономеру, тому спочатку було досліджено вплив масового співвідношення мономерної та водної фази і концентрації ініціатора на діаметр частинок полімерної дисперсії та стійкість реакційної системи в процесі синтезу та при зберіганні. Масове співвідношення мономерної та водної фаз змінювали від 1:3 до 1:20. Склад реакційної суміші проведення полімеризації наведені в таблиці 1. Полімеризацію проводили при 70^оС протягом 24 годин, при постійній концентрації ініціатора, яка складала 0,2% в перерахунку на водну фазу.

Таблиця 1. Склад реакційної суміші проведення беземульгаторних полімеризацій за різних співвідношень фаз (масові частки)

Найменування компонента	Найменування взірця
	ZPS-1	ZPS-2	ZPS-3	ZPS-4	ZPS-5
Стирол	100	100	100	100	100
Вода	300	500	750	1000	2000
Персульфат калію, % мас. в перерахунку на водну фазу.	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2

На рис.1 представлені криві конверсія-час, які отримані гравіометричним методом через визначення сухого залишку. Як і очікувалось, швидкість полімеризації збільшується пропорційно до зменшення мономерної фази. Максимальна швидкість полімеризації спостерігається при масовому співвідношенні мономер/вода - 1:20; мінімальна - при масовому співвідношенні фаз - 1:3.



Рис. 1. Залежність конверсії від часу для різних співвідношень між водною та органічною фазою при беземульгаторній полімеризації стиролу. Т= 70^оС. Концентрація ПСК 0,2%

Крива (а) на рис.2 демонструє залежність загальної площі та кількості частинок дисперсної фази, від частки органічної фази. Збільшення органічної фази до 0,1 супроводжується одночасно, як збільшенням діаметру частинок (б), так і збільшенням площі дисперсної фази.

Подальше збільшення не приводить до зростання загальної площі дисперсної фази і це означає, що кількості поверхнево-активних речовин, що утворюються з наявної (0,2 %) концентрації ПСК вже не вистачає для стабілізації додаткової поверхні. Збільшення дисперсної фази більше 0,15 супроводжується втратою стабілізації системи. Крива на рис.3 після значення діаметру частинок 1,1-1,2 мкм різко відхиляється від лінійної залежності, а це означає збільшення полі- дисперсності системи та втрату її стабілізації.

В табл. 2 наведені значення середнього діаметру частинок дисперсної фази, його коефіцієнту варіації і стійкість одержаного латексу від співвідношення водної та органічної фази. З представлених даних видно, що діаметр частинок дисперсної фази знаходиться в антибатній залежності від їх кількості.



Дослідження стійкості до показують, що латекси, отримані при співвідношенні, більшому 1:5 (частка дисперсної фази більша за 0,2 ) втрачають стійкість.

Таблиця 2. Колоїдно-хімічні властивості полістирольних дисперсій

Співвідношення полістирол : водна фаза	Діаметр частинок, мкм	Кількість частинок дис.фази.*10-8/мл	Стійкість до електролітів М (NaCl)
ZPS-1	1,55	1,3	-
ZPS-2	1,06	2,7	0,15 М
ZPS-3	0,85	4,0	0,20 М
ZPS-4	0,60	7,9	0,25 М
ZPS-5	0,48	8,6	0,30 М

Вплив концентрації ініціатора на кінетичні закономірності полімеризації стиролу за відсутності емульгатора вивчали при постійному масовому співвідношенні мономер:вода - 1:5. Концентрацію ініціатора за інших рівних умов змінювали в інтервалі від 0,1 до 0,4% в перерахунку на водну фазу. Склад реакційної суміші для проведення полімеризації наведені в табл. 3.

Як і очікувалось, при збільшенні концентрації ініціатора швидкість полімеризації зростає. Максимальна швидкість полімеризації спостерігається при концентрації ініціатора 0,4% в перерахунку на водну фазу.

Таблиця 3. Склад реакційної суміші для проведення беземульгаторних полімеризацій при різних концентраціях ініціатору

Найменування компонента	Найменування взірця
	ZPS-2	ZPS-6	ZPS-7
Персульфат калію, % в перерахунку на водну фазу	0,2	0,1	0,4
Масове співвідношення стирол: вода	100/500	100/500	100/500

Залежності загальної площі, діаметру дисперсної фази та коефіцієнту варіації, отриманого на основі аналізу мікрофотографії СЕМ, від концентрації ПСК наведені на рис.4 та 5.

Приведені данні свідчать, що збільшення концентрації ініціатора не приводить ні до суттєвого зменшення середнього діаметру, ні до суттєвого зменшення полідисперсності системи. В деякій мірі зростає стійкість до дії розчинів електролітів. Зменшення ж концентрації менш ніж на 0,2% при цьому співвідношенні фаз приводить до суттєвих змін в системі - різко зростає діаметр частинок дисперсної фази, що супроводжується відповідним зменшенням загальної її площі та кількості частинок при суттєвому збільшенні коефіцієнта варіації і як, наслідок, суттєвому збільшенню полідисперсності дисперсної фази. Такий характер залежностей вказує на втрату стійкості системи та здатності до процесів коагуляції. Отже, проведення беземульгаторної полімеризації при співвідношенні фаз більше за 1:5 при концентрації ініціатора менше 0,2% недоцільно.

В табл.4 наведені характеристики дисперсій, одержаних при різних концентраціях ініціатора.

Таблиця 4. Колоїдно-хімічні властивості полістирольних дисперсій

Співвідношення фаз	[ПСК],%	Діаметр частинок, мкм	Кількість частинок дисперсної фази*10-8/мл	Стійкість М (NaCl)	о-потенціал, mV
1:5	0,1	1,60	0,77	0,05	-22,8
	0,2	1,06	2,7	0,15
	0,4	0,92	3,4	0,20

Рис. 6. СЕМ мікрофотографія частинок дисперсії, одержаної при співвідношенні органічної до водної фази 1:5, конц ПСК 0,2 %. Т= 70^оС

Таким чином, за обраних умов проведення полімеризації оптимальний по розподілу та стійкості до дії електролітів діаметр частинок, 1,06 мкм, був одержаний при концентрації персульфату калію 0,2% в перерахунку на водну фазу і співвідношенні фаз 1:5. За цих умов утворюються частинки відносно стійкі до дії електролітів та з вузьким розподілом за розміром. Візуально, відносно останнього, можна переконатись завдяки мікрофотографії СЕМ, що наведена на рис.6. Ці частинки полістирольної дисперсії були застосовані як зародкові при зародковій полімеризації різних мономерів.

Полімерні мікросфери одержували зародковою кополімеризацією стиролу (Ст), метакрилової кислоти (МАК), акролеїну, стиролсульфонату натрію (ССН), зародковою кополімеризацією стиролсульфонату натрію зі стиролом, який містить розчинений в ньому ?-(карбоксиетил)-?-(триметилсілокси)полі-диметилсілоксан (ПДС), а також зародковою кополімеризацією стиролу, акролеїну, стиролсульфонату натрію, в присутності полівінілпіролідону (ПВП), на полістирольних зародкових частинках (ZPS-2). Склад реакційної суміші для проведення полімеризацій наведений в табл. 5.

Процес зародкової полімеризації проводили в дві стадії. На першій стадії відбувалось набрякання полістирольної дисперсії сумішшю стиролу та другого комономеру, з розчиненим в ній олієрозчинним ініціатором ( ДАК) при кімнатній температурі протягом 24 годин. На другій стадії здійснювали власне зародкову полімеризацію протягом 24 годин при 70^? С. З метою забезпечення ініціювання полімеризації розчинного у воді мономеру, а також додаткової стабілізації частинок за рахунок гідрофільних -SO₄-груп, через 3 години після початку полімеризації вводили водний розчин персульфату калію.

Таблиця 5. Склад реакційної суміші для проведення зародкової кополімеризації на полістирольних зародкових частинках, ZPS-2, (масові частки в розрахунку на мономер)

№	Компоненти	NPS2C2	NPS2G2	NPS2M2	NPS2A2	NPS2C1Si	NPS2S1
1	Полістирольна дисперсія	100	100	100	100	100	100
2	Стирол	20	20	20	20	20	20
3	Вода	2400	2400	2400	2400	2400	2400
4	Метакрилова кислота	1,0	-	-	-	0,5	-
5	Гліцидилметакрилат		1,65	-	-	-	-
6	Хлорметилстирол			1,773		-	-
7	Акролеїн				0,65	-	-
8	Полівінілпіролідон м.м. 40000	1,0	1,0	1,0	1,0	-	-
9	(ДАК)	0,72	0,72	0,72	0,72	0,72	0,72
10	Додецилсульфонат натрію (ДСН)	2,4	2,4	2,4	2,4	2,4	2,4
11	ПДС					1,0	3,0
12	Стиролсульфонат натрію	1,0	1,0	1.0	1,0	1,0	1.0
13	Персульфат калію	0,31	0,31	0,31	0,31	0,31	0,31

Вибір мономерів визначався в першу чергу необхідністю одержання полімерних мікросфер з функціональними групами у межфазному шарі- карбоксильними -СООН (метакрилова кислота), альдегідними -СНСО (акролеїн)- для ковалентного зв`язування з функціональними групами біоліганду

Вибір стиролсульфонату як комономера при зародковій кополімеризації зі стиролом і акролеїном було зроблено з наступних міркувань. Передбачалось, що при входженні до складу кополімерного ланцюга, ланки стиролсульфонату натрію, орієнтуючись на границі розділу фаз, формуватимуть у міжфазному шарі частинок електростатичний фактор стабілізації, збільшуючи їхню стійкість.

Використання суміші ПАР (додецилсульфонату натрію, стиролсульфонату натрію та полівінілпіролідону) для формування електростатичного та структурно-механічного факторів стабілізації у міжфазних шарах полімерних мікросфер пов`язано з тим, що концентрація кожного з них не може бути збільшена вище певного рівня. При перевищенні вмісту цих ПАР вище певної концентрації з`являється вірогідність утворення нових частинок з клубків молекул полівінілпіролідону, олігомерних радикалів стиролсульфонату натрію (розчинного у воді) та з міцел додецилсульфонату натрію.

Полімеризацію ініціювали водорозчинним ініціатором - персульфатом калію (К₂S₂O₈) та олієрозчинним ініціатором - динітрилазобісізомасляної кислоти (ДАК). Олієрозчинний ініціатор, що сконцентрований в дисперсній фазі , забезпечує високу швидкість полімеризації та вичерпування основної маси мономеру, що був привнесений в частинки дисперсної фази (ДФ) при набряканні. Цей процес супроводжується пониженням стабілізації частинок через збільшення загальної площі ДФ та блокуванні значної частини стабілізуючих груп зародкової дисперсії, що була одержана беземульгаторною полімеризацією, в об'ємі частинки. Порушенню стабілізації протидіє водорозчинний ініціатор - згенеровані ним радикали з одного боку залучають до формування оболонки водорозчинні мономери (стиролсульфонат та/або метакрилову кислоту), ініціюючи їх полімеризацію та, завдяки входженню свого залишку в полімерну молекул, утворюють ПАР та компенсують його нестачу. Крім того, локалізація олієрозчинного ініціатора в ДФ сприяє, при підвищенні температури, на глибоких стадіях полімеризації повноті вичерпування мономеру. Колоїдно-хімічні властивості синтезованих за даною методикою дисперсій наведені в табл.. 6.

Таблиця 6. Колоїдно-хімічні властивості дисперсій одержаних зародковою полімеризацією

Назва зразка	Діаметр частинок, нм	Полідисперсність	Коефіцієнт варіації	о- потенціал, mV	Кількість частинок, **10-8/мл
	dm	dn
NPS2C2	1200,8	1142,4	0,05	10,26	-20,1	5,17
NPS2G2	1422,7	1241,2	0,09	14,2	-	4,16
NPS2M2	1213,2	1190,6	0,02	5,36	-	4,4
NPS2A2	1290,3	1240,8	0,04	9,36	-15,4	4,9

Одержані рентгеноелектронні спектри поверхні полімерних дисперсій та проведений комплексний аналіз елементного складу та характеру хімічного зв`язку полімерів.

На рис. 7 представлений оглядовий спектр поверхні досліджуваного взірця з альдегідними групами на поверхні з використанням випромінювання Mg Kб з енергією випромінювання 1253,6 еВ. За структурою спектру можна провести комплексний аналіз елементного складу і характеру хімічного зв`язку досліджуваного взірця. Інформаційна глибина досліджуваної поверхні полімерних мікросфер склала 10 нм. Відповідно, інформацію про поверхню можна вважати достовірною.

Одержані результати доказали присутність тих компонентів у поверхневому шарі полімерних мікросфер, вміст яких передбачався згідно заданих умов синтезу частинок та поставлених до них вимог. Значення інтегральних інтенсивностей парціальних складових рентгеноелектронного спектру рівня C1s для взірця з альдегідними групами на поверхні (рис.8) дозволяють визначити співвідношення вмісту хімічних зв`язків між вуглеводними атомами та атомами кисню. У всіх полімерних дисперсіях у межфазному адсорбційному шарі виявлено функціональні групи сполук, що забезпечують електростатичний та структурно-механічний фактори стабільності: сульфонатні групи у всіх частинках, азот. Також стверджено наявність на поверхні частинок С=О груп, необхідних для ковалентного сполучення з біолігандами. Відповідно, на поверхні частинок сумісно працюють два фактори стабілізації - електростатичний та структурно-механічний, а поєднання цих двох факторів стабілізації дозволяє забезпечити високу стійкість полімерних мікросфер в процесі полімеризації та при зберіганні, при іммобілізації на поверхню частинок біолігандів, в розчинах електролітів, збереження вузького розподілу частинок за розмірами після фарбування, що відповідає вимогам до полімерних дисперсій, які використовуються в імунодіагностиці.

У четвертому розділі подані результати досліджень способів іммобілізації біолігандів для створення нових полімерних тест-систем.

Іммобілізацію на поверхню частинок полімерних дисперсій біоліганду - імуноглобуліну G (IgG) людини здійснювали через сполучні компоненти, спейсори різної природи протеїн А-поверхневий білок S.aureus або - правцевий анатоксин (ПА).



Для підвищення їх стійкості у всі полімерні дисперсії додавали людський сироватковий альбумін (ЛСА) с концентрацією 0,78*10^-5 %.

Наявність спейсора, протеїну А, на поверхні частинок контролювали по аглютинації їх сироватковим -глобуліном кроля та людини, а антигенного спейсора, ПА, по аглютинації з антитоксичною кінською референс-сироваткою та імунною сироваткою донора (людини). За результатами титрування були вибрані оптимальні дози іммобілізованого протеїну А і ПА, які складали відповідно 0,05мг/мл та 2,75мг/мл. (табл.7). В подальших дослідженнях були одержані полімерні мікросфери, на поверхні яких іммобілізували інший індикаторний IgG через відповідний спейсор.

Кількість IgG, іммобілізованого на поверхню полімерних мікросфер, розраховували, виходячи з титру (1 аглютинаційна одиниця АО) антитоксичною сироваткою людини. Для іммобілізації IgG (антитоксичної сироватки людини) брали дози або нижче (субаглютинаційна одиниця СО) або вище титру (АО). Іммобілізацію IgG проводили в фосфатно-буферному розчині (рН=7,2) протягом 2 годин при t=37С. Одержані кон`югати відмивали розчином буферу від надлишку білків сироватки трьохкратним центрифугуванням.



Таблиця 7. Аглютинація частинок, що містять на поверхні протеїн А та ПА

Характеристика тест-системи	Титр РЛА з г-глобуліном кроля	Титр РЛАз анти правцевою кінською референс сироваткою	Титр РЛА з антитоксичною сироваткою людини.
Полімерні мікросфери (ПМ), шо не містять біоліганди	-	-	-
Кон`югат-полімерна мікросфера - протеїн А ( конц. 0,05 мг/мл)	1:160	-	1:16380
Кон`югат - полімерна мікросфера -ПА (конц. 2,7 мг/мл)	-	1:64	1:20

Наявність IgG на поверхні частинок контролювали антивидовою сироваткою проти IgG людини в РЛА з одержаними тест-системами (табл. 8).

Таблиця 8. Результати титрування анти IgG сироватки в РЛАТчастинками з іммобілізованим IgG

Характеристика тест-систем	Сенсибілізуюча доза донорської антитоксичної сироватки людини	Титр анти видової сироватки проти IgG
ПМ модифіковані протеїном АТ(конц. 0,05 мг/мл)	-	-
ПМ модифіковані протеїном А, містять IgG	(0,25) А.О* (0,5) А.О* (1) С.О**	1:>10240 1: 5120 1: 5120
ПМ модифікована ПА (конц. 2,7 мг/мл)	-	-
ПМ модифіковані ПА, містять IgG	(0,5) А.О* (1) С.О.** (2) С.О.**	1:640 1:320 1:320

Таким чином, спосіб іммобілізації біоліганду вносить суттєвий внесок у стійкість тест-системи. У випадку використання спейсора-протеїну А імуноглобулін G орієнтований у водну фазу гідрофільним F_ab -фрагментом і за рахунок ліофілізації поверхні зменшується константа Гаммакера, яка є мірою міжмолекулярних та міжчастинникових взаємодій. Ліофілізація поверхні одночасно з реологічними параметрами міжфазних шарів біополімеру є умовою прояву структурно-механічного фактора стійкості за Ребіндером.

Було досліджено умови для створення тест-систем на фібронектин - рецептор, що забезпечує адгезію клітин між собою та сприяє очищенню крові від клітинних залишків. Його детекцію було здійснено за допомогою частинок, що містили на поверхні желатину для афінної взаємодії з лігандом. Для одержання тест-систем були обрані частинки, синтезовані зародковою кополімеризацією стиролу з функціональними мономерами на полістирольних зародкових частинках середнього діаметру 1,06 мкм -ZPS-2. Желатину на поверхню частинок фізично сорбували та ковалентно зв`язували з альдегідними та карбоксильними групами частинок полімерних дисперсій. Було встановлено, що для забезпечення стійкості частинок в буферному розчині в процесі одержання тест-системи на фібронектин, міжфазний адсорбційний шар частинок повинен мати товщину 0,06 мкм і складатися з молекул желатини, що знаходиться у вигляді ”клубка”(при 60^є С), та альбуміну, взятих у певних співвідношеннях.

У п'ятому розділі розроблено оптимальні умови створення полімерних діагностичних тест-систем на синтезованих полімерних носіях та проведення РЛА з одержаними діагностичними препаратами.

Імунотести було створено двома шляхами. Перший передбачає два варіанта:

- іммобілізація антитіл через ковалентно зв`язаний спейсор ;

- афінна взаємодія специфічних речовин на поверхні полімерних мікросфер (желатина)з біолігандами, що визначаються (антиген та/або антитіло).

Для іммобілізації спейсора було обрано полімерні частинки, стабілізовані полівінілпіролідоном з реакційноздатними альдегідними групами на поверхні.-NPS2A2. Ковалентно зв'язаний протеїн А зберігає спейсорну функцію, мінімальна кількість його складає 0,05мг/мл.

Сенсибілізовані ним частинки аглютинувались сироватковим -глобуліном людини і кроля в титрі 1:1280- 1:2560 і 1:40-1:640 відповідно. Вказані властивості залишались стабільними при зберіганні дисперсій протягом півроку. Обмеженнями при цьому є:

- антитіла, що взяті для іммобілізації через спейсор, повинні містити Fc-фрагмент.

- видова належність -глобуліну обмежує можливість взаємодії його із спейсором;

- низькотитражні сироватки для цього непридатні.

Таким методом було одержано серію антитільних полімерних діагностикумів різної специфічності: ієрсиніозний - до Yersinia enterocolitica серотипу03, лептоспірозний до L. canicola, сальмонельозний до S. pulorum, до вірусу ІБК штам Н120. Одержані антитільні діагностикуми виявились дуже чутливими.

За рахунок афінної взаємодії желатини, іммобілізованої на поверхні частинок полімерної дисперсії, з фібронектином було створено полімерну тест-систему для виявлення фібронектину (умови розглянуто в четвертому розділі).

Другий шлях створення імунотестів полягав у ковалентній взаємодії альдегідних та карбоксильних груп, які присутні у міжфазному шарі полімерних дисперсій, з функціональними групами антитіла та/або антигена, що визначаються.

При створенні тест-ситеми на правцевий анатоксин іммобілізацію біоліганду проводили двома шляхами: фізичною адсорбцією на поверхню полімерних мікросфер та ковалентною взаємодією з активованими карбодиімідом карбоксильними групами взірця NPS2C1Si. Результати визначення анатоксину одержаними діагностикумами наведені в табл. 9.



Таблиця 9. Кількість правцевого анатоксину, визначена антитільними діагностикумами

Доза	Карбоксильні групи полімеру на поверхні частинок
сенситину в (МО)	активовані	неактивовані
	Титр РЛА	Виявлена конц. анатоксину в мкг/мл	Титр РЛА	Виявлена конц. анатоксину в мкг/мл
5,9 23 93,7 375	640 5120 5120 5120	0,4 0,05 0,05 0,05	640 640 1280 640	0,4 0,4 0,2 0,4

При ковалентному приєднанні антитіл до функціональних груп полімерних частинок можна одержати значно чутливіші діагностикуми, ніж при фізичній сорбції на їх поверхню. Аналогічно були створені тест-системи для виявлення аутоантитіл до тіреоглобуліну (захворювання щитоподібної залози), та для визначення RF-фактора.

У шостому розділі наведені результати практичного використання полімерних мікросфер для вивчення фагоцитозу.

Були використані полімерні дисперсії двох типів:

· полістирольні дисперсії з діаметром частинок 0,5-2,0 мкм та вузьким РЧР;

· полістирольні дисперсії з різним поверхневим зарядом частинок, поверхня частинок яких була покрита опсоніном.

Як опсоніни були використані желатин, желатоза, зимозан, протеїн А, фібронектин. Фагоцитоз модифікованих і не модифікованих опсонінами полістирольних мікросфер вивчали із використанням лейкоконцентратів крові хворих донорів з різними патологіями печінки: хронічний вірусний гепатит, жировий гепатоз, алкогольний цироз печінки. Результати проведених експериментів показали, що поглинаюча здатність фагоцитами створених полімерних тест-систем залежить від розміру, заряду полімерних мікросфер, а також від опсоніну, що міститься на їх поверхні. Запропоновані полімерні тест-системи можуть надати нові методичні підходи до вивчення клітинної кооперації, фармакокінетики, антигенного кліренсу в нормі та при патології, а методика з їх використанням можлива у клінічних випробовуваннях для оцінки важкості перебігу захворювання, прогнозу лікування та контролю ефективності терапії, що проводиться.



ВИСНОВКИ

1. Розроблена методика та встановлені оптимальні умови синтезу полістирольних дисперсій з вузьким розподілом за розмірами частинок дисперсної фази (з діаметром в інтервалі 0,5 ч1,06 мкм) та достатньою стійкістю до агрегації у фізіологічних розчинах, що дозволяє їх використовувати для іммобілізації біолігандів.

2. Розроблено метод формування частинок полімерної дисперсії структури “ядро-оболонка” (в інтервалі значень діаметру 0,8-1,5 мкм) з регульованою концентрацією функціональних груп на поверхні - карбоксильних ,альдегідних, епоксидних, придатних до фізичної та/або ковалентної взаємодії з функціональними групами біолігандів, який дозволяє проводити зародкову полімеризацію без додаткового зародження частинок, забезпечуючи вузький розподіл дисперсної фази за розміром.

3. Вперше методом рентгеноелектронної спектроскопії встановлено структуру та склад міжфазних шарів одержаних полістирольних дисперсій з контрольованою природою поверхні для підтвердження її будови.

4. Встановлена залежність специфічності полімерних імунотестів та стійкості полімерних дисперсій від способу іммобілізації білку імуноглобуліну G на поверхню синтезованих частинок полістирольних дисперсій для конкретного інфекційного захворювання.

5. Визначено оптимальні умови сумісної адсорбції желатини та сироваткового альбуміну на поверхню полістирольних мікросфер для одержання високочутливих на фібронектин полімерних тест-систем.

6. Розроблено ряд діагностичних полімерних тест-систем на основі синтезованих полімерних дисперсій для виявлення антигенів: Y.enterocolitica серотипу 03, L canicola, S.pulorum, вірусу ИБК штам Н120.

7. Запропоновано за результатами клінічних випробувань використовувати сконструйовані діагностичні препарати для виявлення вірусних та інфекційних захворювань - RF-фактора, правцевого анатоксину (ПА), для виявлення аутоантитіл до тіреоглобуліну у сироватці крові.

8. Запропоновано використовувати синтезовані полімерні композиції для вивчення фагоцитозу в біорідинах людини у медичній практиці.



СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Синтез полімерних суспензій для біоаналітичних досліджень / Федорова О.В., Петріна Р.О., Новіков В.П., Станішевський Я.М., Грицкова І.О., Прокопов М.І. // Вісник НУ «Львівська політехніка». Хімія, технологія речовин та їх застосування. -- 2006. -№ 553.-С. 315-317. (Внесок дисертанта: синтез полістирольної зародкової дисперсії ,дослідження умов ,аналіз результатів)

2. Вплив способу іммобілізації імуноглобуліну G на стійкість полімерної суспензії / Федорова О.В., Петріна Р.О., Станішевський Я.М., Новіков В.П., Грицкова І.О., Прокопов М.І. // Доповіді Національної академії наук України. - 2006. -№12.-с.146-149.(Внесок дисертанта: розробка умов іммобілізації біоліганду на поверхню полімерних мікросфер ,теоретичне обґрунтування доцільності іммобілізації через спейсор ).

3. Дослідження фагоцитозу за допомогою модифікованих і немодифікованих опсонінами полімерних мікросфер / Федорова О.В., Петріна Р.О., Новіков В.П., Станішевський Я.М., Грицкова І.О., Прокопов М.І // Вопросы химии и химической технологии. - 2007. -№ 3. - С.59-63. (Внесок дисертанта : розробка умов фізичної адсорбції опсонінів на частинки полімерної дисперсії, теоретичний аналіз результатів при використанні різних обсонінів)

4. Федорова О.В. Одержання антитільних діагностичних тест-систем заданої специфічності / Федорова О.В., Думанська Ю., Залуська О. // Вісник НУ «Львівська політехніка». Хімія, технологія речовин та їх застосування. - 2007. -№590.- с.143-146. (Внесок дисертанта: проведення реакції латексної аглютинації, інтерпретація результатів)

5. Полімерні носії для створення діагностичних тест-систем / Федорова О.В., Петріна Р.О., Заярнюк Н.Л., Новіков В.П., Станішевський Я.М., Грицкова І.О., Прокопов М.І // Вопросы химии и химической технологии. - 2007. -№6.- с.123-126. (Внесок дисертанта: дослідження стійкості полімерних дисперсій в розчинах електролітів, аналіз результатів адсорбції біолігандів в різних буферних середовищах)

6. Zaichenko A., Mitina N., Fedorova О., Petrina R., Holovko M., Komarovska O., Lubenets V., Brazhnikova E., Raevska K., Druchok M., Zayarnuk N. Micellar and colloidal carriers based on reactive oligomer surfactants for targeted drug deliveri // NATO Advanced Research Workshop. IONIC SOFT MATTER: Novel trends in theory and applications. - Lviv. - 2004. - P. 105.

7. Novikov V., Zaichenko A., Fedorova О, Petrina R., Mitina N., Raevska K., Lubenets V., Komarovska O. Oligomer surface-active and colloidal carriers for poor water soluble biocide transportation in aqueous media // Abstracts III Polish-Ukrainian conference “Polymers of special applications”. - Radom (Poland). - 2004. - P. 15.

8. Федорова О.В., Петрина Р.Е., Новиков В.П., Станишевский Я.М., Грицкова И.А. Полимерные носители для иммуноанализа // Тезисы докл. Междунар.конф. «Органическая химия от Бутлерова и Бейльштейна до современности».-26-29.06.2006 г.- Санкт-Петербург, Россия,. - 2006.-Т.2 - С.790.

9. Петріна Р.О., Федорова О.В., Станішевський Я.М., Новіков В.П., Грицкова І.О. Іммобілізація біолігандів та створення тест-систем на основі полімерних мікросфер // Тези доп. IХ Укр. Біохімічного з'їзду.- 24-27.10.2006.-Харків.- 2006.- с. 216.

10. Федорова О.В., Петріна Р.О., Новіков В.П., Станішевський Я.М. Іммобілізація імуноглобуліну G на поверхню полімерних мікросфер // Тези доп. ІІІ Всеукр.наук.-практ. конф. «Біотехнологія. Освіта. Практика».- 18-20.10.2006.-Харків.-2006. - С. 133.

11. Станишевский Я.М., Грицкова И.А., Прокопов Н.И., Лобанов А.Н, Федорова Е.В., Новиков В.П. Биотест-системы с использованием полимерных носителей биолигандов // Тезисы докл. Международн. науч.-техн. Конф. «Наука и образование 2006». - 04-12.04.2006.- Мурманск, Россия. -2006.-С.667-668.

12. Fedorova О., Petrina R., Stanishevsky Ya., Novikov V., Gritskova I. Polymeric microspheres for immobilization of immunoglobulin g //20^th Conference 7.. of the European Colloid and Interface Society.- 17-22.09.2006.- Budapest, Hungary. -2006.- P. 8.30.

13. Petrina R., Fedorova О., Novikov V., Stanishevsky Ya. Influence of surface active agent nature on monodisperse particles obtaining // Ukrainian-German Symp.on Nanobiotechnology.- 14-16.12.2006.- Kyiv. -2006.- P.117

14. Федорова Е.В., Петрина Р.Е., Новиков В.П., Станишевский Я.М., Грицкова И.А. Исследование фагоцитоза с помощью полимерных носителей // Тезисы докл. IV Всерос. Каргинской конф. «Наука о полимерах 21-му веку».- 29.01-02.02.2007 .- Москва, Россия. - 2007.-С. 438.

15. Петрина Р.Е., Федорова Е.В., Новиков В.П. Полимерные носители для иммоблизации биоактивных лигандов // Тезисы докл. IV Всерос. Каргинской конф. «Наука о полимерах 21-му веку».- 29.01-02.02.2007 .- Москва, Россия. -2007.- С. 413.

16. Федорова О.В., Петріна Р.О., Заярнюк Н.Л., Новіков В.П. Вплив природи ПАР на отримання реакційноздатних монодисперсних частинок // Тези доп.ХХI Укр.конференція з орг.хімії. - Чернігів. - 2007. - С.340.

17. Fedorova О., Petrina R., Stanishevsky Ya., Novikov V., Gritskova I., N. Prokopov. Polimeric suspensions for bioanalitical study // Тези доп. Міжнародн.симпозіума ”Реакційні полімери в негомогенних системах, в розплавах та на межі розділу фаз”.- 23-26 вересня 2007.- Дрезден, Німеччина.-2007.- Р3-9.- с.217. (“Reactiv Polimer in inhomogeneous System, in Melts, and at interfaces”, September 23 to 26, 2007. - Dresden, Germany.-2007.- Р3-9, с.217.)

18..Petrina R,,. Novikov V., Fedorova О., Gubriy Z. Modification of the particles for immobilization of a bio-specific ligand .// Тези доп. Міжнародн. симпозіума ”Реакційні полімери в негомогенних системах, в розплавах та на межі розділу фаз”.- 23-26 вересня 2007.- Дрезден, Німеччина.-2007.- P3-1.- c.218. (“Reactiv Polimer in inhomogeneous System, in Melts, and at interfaces”, September 23 to 26, 2007.- Dresden, Germany.-2007.- P3-10.- c. 218.)

19. Fedorova O, Petrina R, Zayarnyuk N, Stanishevsky Ya, Griskova I, Novikov V. Influence of surface active nature on monodisperse particles obtaining. // Тези доп.V Польсько-україн.конф. “ Полімери спеціального призначення”.-17-19 червня 2008.-Радом. Польща.-2008-с.34. (“Polymers of special applications”.- june 17-19, 2008.- Radom, Poland.-2008.- р.34.)

20. Petrina R, Gubriy Z, Fedorova O, Zayarnyuk N, Novikov V. Immobilization of biospecific ligand on the surface of polimeric microspheres. // Тези доп.V Польсько-україн. конф.“Полімери спеціального призначення”.-17-19 червня 2008.-Радом, Польща.-с.60. (“Polymers of special applications”. - june 17-19, 2008.-Radom, Poland.-2008.- р.60.)

Размещено на Allbest.ru