Молекулярні механізми регуляції активності ліпоксигеназ у модельних системах

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

УДК 577.152.1: 577.334

Молекулярні механізми регуляції активності ліпоксигеназ у модельних системах

02.00.10 - біоорганічна хімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Скатерна Тетяна Дмитрівна

Київ 2010

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, відділ молекулярних механізмів регуляції метаболізму клітини.

Науковий керівник

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Харченко Ольга Володимирівна,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,

старший науковий співробітник відділу молекулярних механізмів регуляції метаболізму клітини

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, професор

Кібірєв Володимир Костянтинович

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,

провідний науковий співробітник відділу хімії білків і пептидів

Кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Шалак В'ячеслав Федорович

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

старший науковий співробітник відділу механізмів трансляції генетичної інформації

Захист відбудеться 29 жовтня 2010 р. о 10-00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (02094, Київ-94, вул. Мурманська 1).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1.

Автореферат розісланий 29 вересня 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д.М. Федоряк

міцелярний фосфатидний ліпоксигеназний кислота

АНОТАЦІЯ

Скатерна Т.Д. Молекулярні механізми регуляції активності ліпоксигеназ у модельних системах. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 02.00.10 - біоорганічна хімія. - Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ, 2010.

Досліджено вплив фосфатидної кислоти на функціонування ліпоксигенази. Фосфатидна кислота виступає як алостеричний активатор 5-ліпоксигенази у міцелярній системі та призводить до появи додаткового рН оптимуму у кислій області. В умовах недостатньої кількості субстрату лінолевої кислоти та нефізіологічному значенні рН фосфоліпід підтримує певний рівень первинних продуктів 5-ліпоксигеназного окиснення шляхом заміщення молекул субстрату в алостеричному центрі ферменту, підвищення спорідненості ферменту до субстрату та зниження частки неферментативно утворених продуктів. Визначено термодинамічні параметри термоінактивації 5-ліпоксигенази. Присутність фосфатидної кислоти збільшує константи швидкості термоінактивації та енергію активації термоінактивації ферменту. Припускається, що гідрофобні взаємодії мають відігравати суттєву роль у взаємодії 5-ліпоксигенази з фосфатидною кислотою, що призводить до конформаційних перебудов у молекулі ферменту.

Встановлено, що лінолелгідроксамова кислота виступає як безконкурентний інгібітор 5-ліпоксигенази в охарактеризованій модельній системі міцел з постійним молярним співвідношенням компонентів. Окиснені похідні інгібітора проявляють інгібіторні властивості подібні до неокисненої форми сполуки у випадку 5-ліпоксигенази з бульб картоплі та 12-ліпоксигенази з лейкоцитів свині. Взаємодія 5-ліпоксигенази з фосфатидною кислотою призводить до окиснення неспецифічного субстрату реакції - лінолелгідроксамової кислоти, що може свідчити про потенційну можливість регуляції активності ферменту за участі цієї сполуки на клітинному рівні.

Ключові слова: 5-ліпоксигеназа, лінолева кислота, фосфатидна кислота, алостеричний ефектор, фосфоліпід, інгібітор, лінолелгідроксамова кислота.

АННОТАЦИЯ

Скатерная Т.Д. - Молекулярные механизмы регуляции активности липоксигеназ в модельных системах. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 02.00.10 - биоорганическая химия. - Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев, 2010.

Диссертация посвящена исследованию молекулярных механизмов влияния соединений природного происхождения и синтетических производных природного субстрата на активность липоксигеназ в системах, которые моделируют клеточное окружение фермента.

Проведено детальное изучение влияния фосфатидной кислоты на функционирование липоксигеназы. Установлено, что фосфатидная кислота при взаимодействии с 5-липоксигеназой в мицеллярной системе выступает как аллостерический активатор и приводит к появлению дополнительного рН оптимума в кислой области. Показано, что фосфатидная кислота в условиях недостаточного количества субстрата 5-липоксигеназной реакции и нефизиологических значениях рН принимает участие в поддержании определенного уровня первичных продуктов 5-липоксигеназного окисления линолевой кислоты путем замещения молекул субстрата в аллостерическом центре фермента, повышения сродства фермента к субстрату и снижения части неферментативно образованных продуктов окисления линолевой кислоты.

Определены термодинамические параметры термоинактивации 5-липоксигеназы. В присутствии фосфатидной кислоты константы скорости термоинактивации и энергия активации термоинактивации фермента возрастают. Предпологается, что во взаимодействии 5-липоксигеназы с фосфатидной кислотой существенную роль должны играть гидрофобные взаимодействия, что ведет к некоторым конформационным перестройкам в молекуле фермента.

Обосновано использование модельной системы возрастающего количества мицелл (с постоянным молярным соотношением линолевая кислота/Lubrol РХ) для исследований липоксигеназ. В такой системе линолеилгидроксамовая кислота выступает как бесконкурентный ингибитор 5-липоксигеназы. Показано, что окисленные производные линолеил-гидроксамовой кислоты проявляют ингибиторные свойства подобные неокисленной форме ингибитора по отношению к растительным и животным липоксигеназам, а именно 5-липоксигеназе из клубней картофеля и 12-липоксигеназе из лейкоцитов свиньи. Установлено, что взаимодействие 5-липоксигеназы с фосфатидной кислотой приводит к окислению неспецифического субстрата реакции, а именно - линолеилгидроксамовой кислоты. Это свидетельствует о потенциальной возможности регуляции активности фермента этим веществом на клеточном уровне.

Ключевые слова: 5-липоксигеназа, линолевая кислота, фосфатидная кислота, аллостерический эффектор, фосфолипид, ингибитор, линолеилгидроксамовая кислота.

ANNOTATION

Skaterna T.D. Molecular mechanisms of lipoxygenase regulation in modeling systems. - Manuscript.

The dissertation for the candidate of biological sciences degree in speciality 02.00.10 - Bioorganic chemistry. Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2010.

In our work we investigated phosphatidic acid influence on lipoxygenase function. Phosphatidic acid was shown to act as an allosteric activator of 5-lipoxygenase in micellar system, which led to the appearance of additional pH optimum in acidic region. Under conditions of nonsaturating substrate (linoleic acid) amounts and nonphysiological pH, phosphatidic acid was proved to maintain certain level of 5-lipoxygenase oxygenation of primary products by replacement of the substrate molecules in the enzyme allosteric center, increasing in such way enzyme affinity to substrate and decreasing the part of nonenzyme fraction products of linoleic acid oxygenation. Thermodynamic parameters of 5-lipoxygenase thermoinactivation were determined. Thermoinactivation rate constants and activation energy of enzyme thermoinactivation were shown to increase in the presence of phosphatidic acid. It was suggested that hydrophobic forces play an essential role for 5-lipoxygenase and phosphatidic acid interaction, that can induces certain conformational changes of enzyme molecule.

Using model system of mixed micelles with constant molar ratio we found that linoleyl hydroxamic acid acted as a noncompetitive inhibitor of 5-lipoxygenase. Linoleyl hydroxamic acid oxidized derivatives exert the same inhibition effects as nonoxidized linoleyl hydroxamic acid on potato tuber 5-lipoxygenase and porcine leucocyte 12-lipoxygenase. 5-lipoxygenase interactions with phosphatidic acid led to oxidation of nonspecific reaction substrate - linoleyl hydroxamic acid. These results suggest that enzyme activity can be potentially regulated by this modified inhibitor on the cell level.

Key words: 5-lipoxygenase, linoleic acid, phosphatidic acid, allosteric effector, phospholipid, inhibitor, linoleyl hydroxamic acid.

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ліпоксигенази (лінолеат:кисень оксидоредуктази КФ 1.13.11.12.(ЛО)) - ферменти ліпідного обміну; каталізують регіо- та стерео специфічне введення молекулярного кисню до 1,4-цис,цис-пентадієнового фрагменту поліненасичених жирних кислот (ПНЖК), що призводить до утворення відповідних гідропероксидів. Ця реакція є ключовою у ліпоксигеназному каскаді [Grechkin A.N., 1999, Andreou A., Feussner I., 2009] та веде до утворення біологічно активних речовин - оксиліпінів, які забезпечують відповідь організму на дію біотичних та абіотичних стресів; участь у процесах старіння клітин та апоптозу; захисті проти патогенів. У тварин продукти ліпоксигеназної реакції залучені у прояві запальних, алергічних, атеросклеротичних, ішемічних процесів, канцерогенезі тощо [Rokach J., 1989].

Для більшості ЛО притаманна спорідненість до мембран та прояв активності на межі розділу фаз ліпід:вода. Гетерофазний характер реакції можливий завдяки наявності у структурі цих ферментів С2-подібного домену, який забезпечує взаємодію ферменту з мембранною поверхнею. Стадія сорбції ферменту на біологічну мембрану є першим етапом регуляції його активності. На сьогодні існують докази існування білкових (FLAP) [Brash A.R., 1999] та ліпідних (фосфатидна кислота, фосфатидилінозитол, фосфатидилхолін, гліцероли [Бутович І.А. та ін., 1991, Pande A.H. et al., 2004, Hцrnig C. et al., 2005]) факторів регуляції активності ЛО тварин та рослин. Такий вплив ліпідів говорить про важливість дослідження ліпід-білкових взаємодій для розуміння процесів регуляції активності ліпоксигеназ. Актуальним є дослідження механізму дії сполук природного походження та синтетичних похідних природного субстрату - лінолевої кислоти - на ліпоксигенази на молекулярному рівні в системах, які моделюють мембранне оточення ферменту в клітині. Вперше факт активації 5-ЛО фосфатидною кислотою (ФК) було встановлено в роботі [Бутович І.А. та ін., 1991]; на даний час не з'ясовано механізму взаємодії ЛО з цим фосфоліпідом та невідомо як ця взаємодія впливає на рівень специфічності продуктів ферментативного походження, термодинамічні параметри процесу денатурації ЛО. Крім структурної функції ФК виступає у клітині як вторинний мессенджер та бере участь у сигнальних системах клітини. Вивчення взаємозв'язків між компонентами різних гілок ліпідного обміну та сигнальних систем є актуальним для поглиблення наших уявлень та розуміння клітинного метаболізму.

За функціональними особливостями 5-ЛО з картоплі подібна до ЛО ссавців. Цей фермент викликає цікавість для хімічної та фармацевтичної індустрії завдяки своїй здатності каталізувати перетворення арахідонової кислоти та подальшу трансформацію у лейкотриєн А4 [Hughes R.K. et al., 2001] - перший етап у синтезі лейкотриєнів та ліпоксинів. Саме тому, на сьогоднішній день є актуальним дослідження механізмів регуляції рівня ліпоксигеназних метаболітів та засобів їх корекції. Синтетичне похідне субстрату лінолевої кислоти - лінолеїлгідроксамова кислота (ЛГК) проявляє значні інгібіторні властивості по відношенню ліпоксигеназ рослин та тварин [Butovich I. et al., 2008, Харченко О.В. та ін., 1999]. На сьогодні залишається нез'ясованим механізм інгібування 5-ЛО та вплив цього інгібітора в умовах моделюючих мембранну поверхню. Крім того, при потраплянні до організму вірогідна трансформація вищезазначеного інгібітора, що може призводити до зміни його ефективності. На даний момент вплив окиснених форм інгібітора лінолеїлгідроксамової кислоти на ліпоксигеназний каталіз не вивчався. Перспективним також у дослідженні механізму впливу ефекторів природнього та синтетичного походження на ліпоксигеназну реакцію є створення систем, які моделюють взаємодію ферменту з мембранною поверхнею та використання цих систем для скринінгу інгібіторів та активаторів.

Біологічна важливість продуктів ліпоксигеназного каталізу у живих організмах обумовлює дослідницький інтерес з точки зору регуляції активності цього ключового ферменту та можливості коригування рівня ліпоксигеназних метаболітів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є складовою частиною науково-дослідних робіт Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (тема: "Вивчення механізмів дії та регуляції ферментів каскаду поліненасичених жирних кислот у системах, що моделюють біологічні мембрани", державний реєстраційний номер 0103U005437; тема: "Молекулярна асоціація, функціональні властивості та шляхи регуляції активності ферментів каскадів поліненасичених жирних кислот", державний реєстраційний номер 0106U004305; тема: ”Ключові ферменти ліпоксигеназного шляху перетворення поліненасичених жирних кислот та дія біологічно активних сполук”, державний реєстраційний номер 0109U002339).

Мета та завдання дослідження. Метою роботи є встановлення молекулярних механізмів впливу сполук природного походження та синтетичних похідних природного субстрату лінолевої кислоти на активність ліпоксигеназ у системах, які моделюють клітинне оточення ферменту in vitro.

Для досягнення мети вирішувались наступні завдання:

Дослідити молекулярні механізми впливу фосфатидної кислоти як структурного компоненту клітинної мембрани на 5-ліпоксигеназне окиснення лінолевої кислоти.

а) З'ясувати кінетичний механізм дії фосфатидної кислоти на 5-ліпоксигеназу в міцелярній системі.

б) Дослідити вплив фосфатидної кислоти на термодинамічні параметри процесу термоінактивації 5-ліпоксигенази.

2. Встановити особливості взаємодії ліпоксигенази з синтетичним похідним лінолевої кислоти - лінолеїлгідроксамовою кислотою в міцелярній модельній системі.

а) Розробити та охарактеризувати штучну міцелярну систему, що моделює мембранну поверхню клітин.

б) З використанням розробленої системи вивчити кінетичний механізм впливу лінолеїлгідроксамової кислоти на функціонування 5-ліпоксигенази.

Дослідити можливість перетворення інгібітора лінолеїлгідроксамової кислоти за участю ліпоксигенази та фосфатидної кислоти. Проаналізувати інгібіторні властивості окиснених похідних лінолеїлгідроксамової кислоти для рослинних та тваринних ліпоксигеназ, як потенційних метаболітів, які можуть утворюватись в клітині.

Об'єкт дослідженя - ферментативне окиснення поліненасичених жирних сполук за каталітичної дії ліпоксигеназ.

Предмет дослідження - механізм впливу алостеричних ефекторів та інгібіторів на функціонування 5- та 12-ліпоксигеназ.

Методи дослідження - фізико-хімічні методи (хроматографія, електрофорез) застосовували при очищенні 5-ЛО з бульб картоплі, 12-ЛО з лейкоцитів свині та визначенні фізичних параметрів змішаних міцел лінолева кислота/Lubrol РХ; УФ-спектрофотометрія використана для дослідження кінетики ферментативного окиснення; кінетичні та математичні методи.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлено молекулярний механізм впливу фосфатидної кислоти як структурного компоненту мембрани на 5-ліпоксигеназне окиснення лінолевої кислоти. Результати кінетичних досліджень свідчать, що фосфатидна кислота виступає як алостеричний активатор 5-ліпоксигенази у міцелярній системі, що призводить до появи додаткового рН оптимуму у кислій області. Встановлено, що фосфатидна кислота в умовах недостатньої кількості субстрату 5-ліпоксигеназної реакції та нефізіологічних значеннях рН бере участь у підтриманні певного рівня первинних продуктів ліпоксигеназного окиснення лінолевої кислоти шляхом заміщення молекул субстрату в алостеричному центрі ферменту, підвищення спорідненості ферменту до субстрату та зниження частки неферментативно утворених продуктів окиснення лінолевої кислоти.

Вперше встановлено закономірності впливу фосфатидної кислоти на термодинамічні показники процесу денатурації. Показано, що взаємодія 5-ліпоксигенази з алостеричним активатором - фосфатидною кислотою - збільшує енергію активації термоінактивації ферменту. Це може вказувати на певні конформаційні зміни ферменту, які, можливо, обумовлені гідрофобними взаємодіями.

З використанням запропонованої системи змішаних міцел з постійним молярним співвідношенням, що моделює мембранну поверхню, на основі кінетичних досліджень встановлено механізм взаємодії ліпоксигенази з синтетичним похідним лінолевої кислоти - лінолеїлгідроксамовою кислотою, який передбачає інгібування за безконкурентним типом.

Вперше встановлена можливість біотрансформації інгібітора лінолелгідроксамової кислоти за участю 5-ліпоксигенази та фосфатидної кислоти. Показано, що взаємодія 5-ліпоксигенази з фосфатидною кислотою призводить до окиснення неспецифічного субстрату реакції - лінолеїлгідроксамової кислоти.

За участю ліпоксигеназ рослинного та тваринного походження вперше показано, що окиснені форми лінолелгідроксамової кислоти не менш ефективні за неокиснену форму інгібітора.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані дані про особливості регуляції ліпоксигенази структурним компонентом мембрани та вторинним месенджером - фосфатидною кислотою розширюють існуючі на сьогоднішній день теоретичні уявлення про особливості функціонування ферментів ліпідного обміну ліпоксигеназ та їх взаємозв'язку з метаболітами інших ферментативних систем у клітині. Результати, отримані при дослідженні 5-ліпоксигеназного каталізу в умовах модельної системи змішаних міцел лінолева кислота/Lubrol РХ з постійним молярним співвідношенням 0,3 дозволяють використовувати цю модельну систему для скринінга регуляторів ферментів in vitro. Одержані результати при вивченні впливу окиснених форм інгібітору лінолеїлгідроксамової кислоти на 5-ліпоксигеназу з бульб картоплі та 12-ліпоксигеназу з лейкоцитів свині показали збереження та підсилення інгібіторних властивостей окиснених похідних інгібітора, що має практичне значення для застосовування у фармакології та медицині.

Особистий внесок здобувача. Експериментальна частина роботи та обробка отриманих результатів виконані здобувачем особисто. Планування та обговорення роботи, а також формулювання висновків відбувалось спільно з науковим керівником кандидатом біологічних наук Харченко О. В. Друковані праці були підготовлені за безпосередньої участі дисертанта.

Апробація результатів дисертаційної роботи. Результати роботи представлені на конференціях з біоорганічної хімії та нафтохімії ІБОНХ НАН України (Київ, 2007, 2010 рр.), конференції FEBS (Барселона, червень 1996), Міжнародній конференції „Современная физиология растений: от молекул до экосистем” (Сиктивкар, 2007), 2-му Міжнародному симпозіумі “Регулятори росту рослин: внутрішньоклітинна гормональна сигналізація та застосування у сільському господарстві” (Київ, 2007), ІV Російському симпозіумі „Белки и пептиды” (Казань, 2009).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 11 праць з них 5 статей у фахових виданнях та 6 тез наукових доповідей.

Структура та об'єм роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, опису отриманих результатів та їх обговорення, висновків та списку використаних джерел (197 найменувань). Дисертаційна робота викладена на 139 сторінках друкованого тексту і містить 35 рисунки та 12 таблиць.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. У розділі представлено сучасні уявлення про будову, каталітичні механізми та особливості функціонування ліпоксигеназ. Розглянуто регуляцію ферменту у клітині та значення продуктів ліпоксигеназного ферментативного каскаду у метаболізмі тваринних та рослинних організмів.

Матеріали та методи дослідження. 5-ліпоксигеназу (5-ЛО) було отримано з бульб картоплі (Solanum tuberosum L.) сорту “Луговська”. Частково очищений препарат ферменту (препарат І) отримували за схемою, яка складалась з екстракції, висолювання 25-50 % сульфатом амонію, хроматографії на Sephadex G-25 або діалізу 12 год. Високоочищений препарат 5-ЛО (препарат ІІ) отримували за схемою, яка складалась з екстракції, висолювання 25-50% сульфатом амонію, діалізу, іонообмінної хроматографії на DEAE-Toyоpearl та гідрофобної хроматографії на Butyl-Sepharose. Згідно результатів електрофорезу у поліакріламідному гелі за денатуруючих умов [Ornstein M., Davis J., 1964], чистота препарату ІІ складала 80%. 12-Ліпоксигеназу (12-ЛО) отримано із лейкоцитів свині за модифікованим методом [Clayes, 1985] за схемою, яка складалась з екстракції, центрифугування та іонообмінної хроматографії на DEAE-Toyopearl.

Стаціонарну швидкість (Vst) ліпоксигеназного каталізу визначали спектрофотометрично за кінетикою оптичного поглинання =235 нм, що відповідає максимальному поглинанню спряженого дієнового хромофору в молекулі гідропероксиду [Gibian M., Vanderberger B., 1987]. Стандартна реакційна суміш містила (5-ЛО): натрій-фосфатний буферний розчин (0,1 М, рН 6,9) або натрій-ацетатний буферний розчин (0,1 М, рН 5,0), 0,02 % Lubrol PX, 0,1 мМ лінолеву кислоту (ЛК). Фосфатидну кислоту (ФК) розчиняли в 1% Lubrol PX. Реакцію ініціювали додаванням 16 мкг 5-ЛО (препарат І) або 6 мкг препарату ІІ. Стандартна реакційна суміш (12-ЛО): трис-НСІ буферний розчин (0,1 М, рН 8,0), 0,02 % Lubrol PX, 0,07 мМ ЛК. Реакцію ініціювали додаючи 0,05 мг ферменту. Термоінкубацію 5-7,6 мкг 5-ЛО (препарат ІІ) проводили без та у присутності 15 або 50 мкМ ФК при 30єС, 40єС, 50єС, 60єС та 70єС при рН 6,9 та 5,0 відповідно. Реакцію ініціювали 0,1 мМ ЛК, з попереднім охолодженням до 25єС. При побудові кінетичних залежностей використовували середні значення Vst, які визначали мінімум з трьох вимірювань (різниця між величинами становила не більше 5 %).

Константу іонізації бромтимолового синього (БТС) визначали спектрофотометрично при =620 нм [Гордон Дж., 1979] в інтервалі рН 4,5-10,0.

Розміри міцел із молярним співвідношенням ЛК/Lubrol PX=0,3/1 та ЛГК/ЛК/ Lubrol PX=0,03/0,3/1 визначали методом гель-фільтрації на сефадексі G-200 за допомогою калібрувальної кривої за визначеними маркерними білками [Остерман Л.А., 1985].

Для більшості розрахованих констант було визначено середнє квадратичне відхилення (у) від середньої арифметичної величини (М) Статистично достовірною вважали різницю при р?0,05.

Вплив фосфатидної кислоти на реакцію окиснення лінолевої кислоти 5-ліпоксигеназою з бульб картоплі. Регуляція ліпідами активності ліпоксигеназ активно досліджується [Pande A.H., 2005, Харитоненко Г.І. та ін., 2008, Бутович И.А. та ін., 1999, 1992]. Раніше було показано активуючий вплив фосфатидної кислоти на активність 5-ЛО з картоплі у міцелярній системі [Бутович І.А. та ін., 1991], але характер взаємодії фосфоліпіду з ферментом не досліджувався.

Вивчення кінетики ферментів ліпідного обміну in vitro передбачає застосування систем, що моделюють умови гетерофазного каталізу. В своїй роботі ми використовували охарактеризовані раніше міцели, створені 0,34 мМ неіонним детергентом Lubrol PX [Бутович І.А. та ін., 2001, 1991]. Вивчення впливу рН реакційного середовища на активність 5-ЛО у присутності 50 мкМ ФК (рис.1) виявило появу додаткового рН оптимум 5,0 (крім стандартного для 5-ЛО з бульб картоплі 6,9), що свідчить про участь додаткових двох іоногенних груп ферменту в реакції каталізу у присутності ФК. Розраховані за рівнянням: Vst=(Vst)opt1/(1+[H+]/K2+K1/[H+])+(Vst)opt2/(1+[H+]/K4+K3/[H+], значення (Vst)opt1, (Vst)opt2 склали 18,3 та 59,13 мкМ/хв та рК1, рК2, рК3 і рК4 - 6,36, 7,47, 4,23 і 5,81 відповідно (рК іонізації ЛК складає 7,58, а ФК - 8,5). Поява додаткового рН оптимуму 5,0 та значна активація 5-ЛО при 50 мкМ ФК (15-20 разів) узгоджується з підвищенням активності однієї з основних ізоформ фосфоліпази D (ФК є одним з продуктів цього ферменту) в умовах підкислення середовища до рН 4,5-5 у клітині при дії на рослинну клітину різних еліситорів [Тарчевский И.А., 2002]. Можливо, молекули фосфоліпіду при взаємодії з ферментом здатні проявляти компенсаційний вплив на утворення 5-ліпоксигеназних метаболітів in vivo в умовах закиснення примембранного цитозолю на ранніх етапах відповіді клітини на біотичні та абіотичні фактори.

S-подібна залежність Vst ліпоксигеназної реакції від концентрації субстрату ЛК при рН 5,0, так само як при 6,9, вказує на позитивну кооперативність ферменту щодо субстрату (рис. 2). Обраховані за рівнянням Хіла значення коефіцієнта Хіла (h) щодо ЛК становлять 3,34±0,22 (рН 6,9) та 5,61±0,88 (рН 5,0), тобто при закисненні середовища, до алостеричного центру 5-ЛО може приєднуватись до двох додаткових молекул субстрату ЛК. Значення концентрації напівнасичення [S]0,5 зменшується з 106,2 (рН 6,9) до 43,26 мкМ (рН 5,0), що в деякій мірі може свідчити про зростання спорідненості ЛК до молекули ферменту при рН 5,0 у порівнянні з рН 6,9. Зміна рН з 6,9 до 5,0 впливає на значення максимальної швидкості реакції (Vmax), зменшуючи Vmax з 3,67 до 0,53 мкмоль/хв.



Рис. 1 Залежність стаціонарної швидкості (Vst) ферментативного окиснення 100 мкМ ЛК від рН реакційного середовища: 1 - без ФК; 2 - 50 мкМ ФК

Рис. 2 Вплив ФК на залежність стаціонарної швидкості реакції (Vst) окиснення ЛК 5-ЛО від концентрації субстрату при рН 5,0: без ФК (1); 15 мкМ ФК (2); 30 мкМ ФК (3); 50 мкМ ФК (4)

Дослідження впливу 15-50 мкМ ФК на субстратну залежність стаціонарної швидкості ліпоксигеназної реакції при рН 5,0 продемонструвало вплив ФК за

алостеричним механізмом (рис. 2). Присутність ФК зменшує h щодо субстрату ЛК з 3 до 2 (табл. 1), тобто із збільшенням концентрації ефектора з молекулою ферменту зв'язується від 3 до 4 молекул ФК, які здатні заміщувати відповідну кількість молекул субстрату в алостеричному центрі 5-ЛО. Алостеричні ефекти фосфатидної кислоти описані для інших ферментів ліпідного обміну, зокрема, для фосфоліпази D, фосфоліпази С-г1 [Geng D. et al., 1998, Jones G.A. et al., 1993]. Збільшення концентрації ФК викликає зростання значення Vmax з 0,53 мкмоль/хв без ФК до 10,37 мкмоль/хв у присутності 50 мкМ ФК, майже в 20 разів.

Таблиця 1 Вплив ФК на кінетичні параметри 5-ліпоксигеназної реакції окиснення ЛК при рН 5,0

[ФК], мкМ	Vmax, мкмоль/хв	[S]0,5, мкМ	коефіцієнт Хіла щодо ЛК, h
0	0,53±0,02	43,26±1,35	5,61±0,88
15	5,10±0,23	29,30±2,13	2,84±0,54
30	5,30±0,21	14,59±1,41	1,92±0,35
50	10,37±0,93	16,77±3,15	1,39±0,28

Аналіз залежності Vst окиснення ЛК від концентрації ФК при концентраціях ЛК 25-200 мкМ (рН 5,0) виявив кооперативність 5-ЛО по відношенню до молекул ефектора - фосфатидної кислоти (рис. 3). В умовах дефіциту субстрату ФК здатна стимулювати ферментативну активність за рахунок приєднання від 3 до 4 молекул активатора в алостеричному центрі 5-ЛО, при цьому значення h по ефектору змінюється з 4 (25 та 50 мкМ ЛК) до 3 (100мкМ ЛК) (табл. 2), а значення Vmax відповідно зростає. Таким чином, за умов недостатності субстрату реакції присутність фосфоліпіду має компенсаторну дію на фермент і це призводить до підтримання певного рівня ліпоксигеназних продуктів за умов малих кількостей субстрату - лінолевої кислоти.



Рис. 3 Залежність стаціонарної швидкості (Vst) ферментативного окиснення ЛК від концентрації ФК (рН 5,0): 25 мкМ ЛК (1); 100 мкМ ЛК + 100 мкМ 4-гідрокси-ТЕМПО (2); 50 мкМ ЛК (3); 100 мкМ ЛК (4); 200 мкМ ЛК (5)

Таблиця 2 Кінетичні параметри 5-ліпоксигеназного окиснення ЛК у присутності 50 мкМ ФК при рН 5,0.

[ЛК], мкМ	Vmax, мкмоль/хв.	[А]0,5, мкМ	коефіцієнт Хіла щодо ФК, h
25	1,63±0,15	23,40±2,17	3,36±0,59
50	3,55±0,16	13,53±0,71	3,54±0,48
100	4,80±0,22	18,62±1,59	2,84±0,46
200	9,04±0,41	11,04±0,79	3,73±0,89

При рН 6,9 вплив ФК на перебіг ліпоксигеназної реакції менш виразний - активація в 1,3-1,5 рази при менших концентраціях ефектора (10-15мкМ), що можливо пояснити мінорністю ФК у складі біологічних мембран (менше 1% від загальної кількості фосфоліпідів) та здатністю здійснювати тонкий регуляторний вплив у малих концентраціях на активність ферменту при фізіологічних значеннях рН. ФК суттєво не змінює значення кінетичних параметрів при рН 6,9, але зберігається алостерична регуляція, а саме - з алостеричним центром ферменту здатна взаємодіяти одна молекула ФК і принаймні 3 молекули субстрату. Тобто, незважаючи на різний рН реакційного середовища, для ФК зберігається здатність до алостеричних ефектів відносно 5-ЛО з бульб картоплі.

Наведені факти алостеричного впливу ФК на фермент 5-ЛО при нейтральних та кислих значеннях рН, поява додаткового рН оптимуму ферменту у присутності ФК, як наслідок залучення двох додаткових іоногенних груп ліпоксигенази в процес каталізу, дають підстави припустити що відбуваються певні конформаційні зміни білка при взаємодії з ФК.

Особлива структура активного центру ЛО обумовлює мобільність субстрату протягом каталізу, що веде до вивільнення радикальних інтермедіатів. Неферментативне перетворення суміші всіх можливих позиційних та просторових стереоізомерів первинно окиснених продуктів ЛО блокуються вловлювачами вільних радикалів [Butovich I.A. та ін., 2000, Харченко О.В. та ін., 2001, Vovk A.I., Kharchenko O.V. et al, 2004, Харченко О.В. та ін. 2005]. Використання 4-гідрокси-ТЕМПО дозволило дослідити вірогідність зміни рівня специфічності продуктів 5-ліпоксигеназного перетворення ЛК у присутності фосфоліпіду. 100 мкМ 4-гідрокси-ТЕМПО інгібує на 15-50% ферментативне перетворення ЛК у діапазоні 30-80 мкМ ФК (рис. 4, крива 2) при рН 5,0. Тобто, від 15 до 50% продукту, що фіксується в ході реакції, утворюється внаслідок неферментативної трансформації первинних продуктів 5- ЛО окиснення ЛК в залежності від кількості присутнього фосфоліпіду. Можливо, молекули ФК, приєднуючись до алостеричного центру ферменту, сприяють зміні конформації білкової молекули, що полегшує дисоціацію продукту реакції з активного центру. Подібна ситуація спостерігається при впливі іншого алостеричного регулятора 5-ЛО з бульб картоплі синтетичного походження - додецилсульфату натрію [Харитоненко Г.І. та ін., 2008]. Внесення 15 або 50 мкМ ФК в реакційну суміш при рН 6,9 та 5,0 відповідно збільшує рівень специфічних для ліпоксигеназного каталізу продуктів на 20% (рис. 4). Ці дані можуть свідчити, що за нормальних умов життєдіяльності та закисненні цитозолю клітини ФК здатна впливати на активність ферменту, зменшуючи утворення неспецифічних продуктів та підтримуючи на певному рівні ліпоксигеназні метаболіти у клітині.

Рис. 4 Залежність залишкової активності 5-ЛО від концентрації 4-гідрокси-ТЕМПО без та з ФК (рН 5,0 та 6,9 відповідно) при 100 мкМ ЛК: без ФК рН 5,0 (1); 50 мкМ ФК рН 5,0 (2); без ФК рН 6,9 (3); 15 мкМ ФК рН 6,9 (4)

Вплив ФК може бути зумовлений зміною фізико-хімічних параметрів міцел. Є дані, що додавання молекул ФК в ліпідний бішар створює оптимальну плавучість мембранної моделі [Wang X. et al., 2006], що може призводити до стабілізації структури ферменту, як було показано для нікотинацетилхолінового рецептора [DaCosta C.J.B. et al., 2004]. Вплив ФК також може здійснюватись за рахунок здатності ФК слугувати донором протонів, необхідних для ліпоксигеназного каталізу. Відомо щонайменше три протоно-залежні реакції в ліпоксигеназному циклі: стадія активації жирних кислот, протонування гідропероксид-аніона та анаеробна активація “resting”Fe2+-ліпоксигенази [Gardner H.W. et al., 1991].

Термоінактивація 5-ліпоксигенази з бульб картоплі та вплив фосфатидної кислоти на енергію активації процесу денатурації. Для подальшого дослідження впливу ФК на 5-ЛО окиснення ЛК вперше було застосовано методичний підхід, який полягав у вивченні кінетики термоінактивації ферменту у присутності фосфоліпіду. Термоінкубацію 5-ЛО проводили у натрій-фосфатному (0,1 М; рН 6,9) та натрій-ацетатному (0,1 М; рН 5,0) буферних розчинах без та у присутності 15 та 50 мкМ ФК відповідно. Нахил кривих у кооординатах: логарифм залишкової активності ферменту від часу дозволяє обрахувати константу швидкості термоінактивації першого порядку (k) (табл. 3).

Таблиця 3 Значення констант швидкості термоінактивації (k) 5-ліпоксигенази та енергії активації денатурації ферменту Еа (M±m (n=3,4))

умови	k*103, c-1	Еа, кДж/моль
	300С	400С	500С	600С	700С
без ФК, рН 6,9		0,0076 ±0,0002	0,23 ±0,02	0,76 ±0,02	2,76 ±0,02	175,6
15 мкМ ФК, рН 6,9		0,0600 ±0,0047	0,53 ±0,023	6,10 ±0,07	73,90 ±2,60	205,03
без ФК, рН 5,0	0,175 ±0,030	0,25 ±0,04	0,43 ±0,05	1,10 ±0,05		48,3
50 мкМ ФК, рН 5,0	1,367 ±0,070	5,60 ±0,30	41,56 ±7,10	96,33 ±5,95		124,9

Швидкість інактивації 5-ЛО залежала від рН реакційного середовища, значення констант швидкості k термоінактивації при рН 6,9 значно менші ніж при рН 5,0. Таке зростання констант інактивації при кислому рН розчину пояснюється тим, що при рН, близькому до ізоелектричної точки ферменту - 4,94, молекула білка може знаходитись у достатньо розгорнутому вигляді та легко денатурувати навіть при невисоких температурах.

Енергію активації термоінактивації (Еа) 5-ЛО розраховано згідно рівняння Арреніуса (рис. 5). Еа для рН 6,9 у 3,6 рази вище за Еа при рН 5,0. У літературі описані випадки, коли швидкість інактивації залежить від рН [Anthon G.E. et al., 2002] та складу розчину, в якому знаходиться фермент. Температурний діапазон, який обрано для дослідження, залежав від значення рН середовища. При нейтральному рН розчину фермент більш стабільний; інактивація 5-ЛО не відбувається при 300С протягом 120 хв.

Рис. 5 Залежність логарифма константи швидкості термоінактивації 5-ЛО від оберненого значення температури при рН 6,9 та 5,0 без та у присутності фосфатидної кислоти: 50 мкМ ФК рН 5,0 (1); без ФК рН 5,0 (2); 15 мкМ ФК рН 6,9 (3); без ФК рН 6,9 (4)

У свою чергу присутність фосфоліпіду ФК суттєво змінює значення k та Еа. Значення обох параметрів зростають у присутності фосфоліпіду при рН 6,9 та 5,0. При рН 6,9 значення Еа збільшується у 1,16 раз, а при рН 5,0 енергія активації денатурації зростає у 2,6 раз, що аналогічно закономірності впливу ФК на активність 5-ЛО (при рН 6,9 активність ферменту зростає у 1,5 рази, при рН 5,0 збільшення активності у 15-20 рази). Подібним чином на Еа 5-ЛО впливає присутність іншого алостеричного регулятора синтетичного походження додецилсульфату натрію [Харитоненко Г.І. та ін., 2008], який викликає зростання Ea інактивації ферменту у 2,5-3,7 рази. Такий вплив може свідчити про певні конформаційні перебудови молекули ферменту при взаємодії з алостеричним ефектором. Базуючись на дослідженнях впливу ФК на структуру в-лактоглобуліну [Cornell D.G., 1982 et al.] можна припустити, що ця сполука викликає перебудову нативної структури, направлену на збільшення б-спіральних ділянок. Результати проведених досліджень свідчать, що взаємодія 5-ЛО з алостеричним ефектором ФК впливає на термодинамічні параметри термоінактивації ферменту.

Оскільки при концентрації ФК, з якою проводилась інкубація ферменту, здатна утворювати міцели (ККМ для ФК при рН 5,0 - 0,13 мМ, а при рН 8 - 0,77 мМ), взаємодія між ферментом та ФК під час термоінкубації відбувається на межі розподілу фаз вода:міцела, де може виникати зсув приповерхневого значення рН. Такі події відповідно можуть призводити до зміни заряду та конформації молекули білка та умов каталізу. Для визначення можливих змін рН на поверхні міцел ФК було досліджено іонізацію ліпофільного індикатора бромтимолового синього (БТС). Крива іонізації БТС у присутності міцел ФК (рис. 6, крива 2) при рН 5,0-6,0 характеризується зсувом у кислу область рН приблизно на одиницю, що свідчить про залуження приповерхневого шару міцел. Подібний зсув спостерігається при рН 7,5-8,5 у лужну область на ~0,5 одиниць, порівняно з водним розчином (рис.6, крива 1), що вказує на закиснення приповерхневого шару.

Рис. 6 Криві іонізації бромтимолового синього: 1 - водний розчин; 2 - міцели ФК

Наші дослідження показали, що ефективність впливу ФК на активність ферменту залежить від рН реакційної суміші та визначається ступінню іонізації фосфоліпіду. Виходячи із значень рК ФК 3,8 та 8,5 при досліджуваних значеннях рН 6,9 та 5,0 молекули фосфатидної кислоти знаходяться у частково депротонованій формі. Очевидно, що із збільшенням депротонованої частки молекул ФК вплив на активність ферменту зменшується (при нейтральних значеннях рН розчину). З іншого боку, ізоелектрична точка 5-ЛО відповідає рН 4,94. Отже, за умов наближених до ізоелектричної точки ферменту, частка іонізованих груп білка значно менша ніж при нейтральному значенні рН. Наведені факти вказують, що визначальними при взаємодії ферменту з алостеричним регулятором є гідрофобні зв'язки. Такий механізм взаємодії ФК з 5-ЛО пояснює здатність ферменту приєднувати від 4 до 3 молекул ефектора при рН 5,0 у випадку недостатності субстрату, яка виражається у позитивній кооперативності ферменту щодо ФК.

Моделювання впливу лінолелгідроксамової кислоти на ліпоксигенази в системах in vitro. 5-ЛО картоплі викликає особливий науковий інтерес як модель та альтернатива до ЛО ссавців. Для вияснення механізму каталізу 5-ЛО як ферменту, активність якого залежить від мембранного оточення, було вперше запропоновано та охаратеризовано in vitro систему змішаних міцел, утворених молекулами неіонного детергенту Lubrol РХ та ЛК - загальна концентрація компонентів зростала при збереженні сталого молярного співвідношення компонентів, що призводило до утворення так званого „суперсубстрату”.

Методом гель-фільтрації на сефадексі G-200 охарактеризували агрегатний стан “суперсубстрату” в міцелярних системах із молярним співвідношенням ЛК/Lubrol PX=0,3/1 (тип І) та в міцелярних системах, які містили інгібітор 5-ЛО лінолеїл-гілроксамову кислоту (ЛГК) - ЛГК/ЛК/Lubrol PX=0,03/0,3/1 (тип ІІ) та ЛГК/ЛК/Lubrol PX=0,12/0,3/1 (тип ІІІ). Молекулярні маси змішаних міцел типу І із загальною концентрацією субстрату ЛК 50, 100, 200, 2000 мкМ та з 10 мкМ ЛГК склали 177 000 - 212 000 Да (рис. 7), тобто зміна загальної концентрації субстрату в межах 50-2000 мкМ та додаткове внесення інгібітора ЛГК несуттєво впливає на значення молекулярної маси. Отримані значення радіусів Стокса змішаних міцел склали 4,83-5,79 нм для всіх проаналізованих типів агрегатів. Система на основі змішаних міцел неіоногенної поверхнево активної речовини - Lubrol PX та ЛК із сталим молярним співвідношенням може застосовуватись для дослідження кінетики ліпоксигеназного каталізу під час гетерогенного окиснення ПНЖК на поверхні розподілу фаз вода:ліпід.

Рис. 7 Молекулярна маса змішаних міцел ЛК/Lubrol PX з постійним молярним співвідношенням 0,3. Загальна концентрація ЛК міцел типу 1: 50 мкМ (1); 100 мкМ (2); 200 мкМ (3); 2000 мкМ (4); міцели типу 2 (5)

Субстратна залежність стаціонарної швидкості 5-ЛО окиснення ЛК у складі змішанних міцел із сталим молярним співвідношенням типу І, типу ІІ та тип ІІІ має форму кривих, характерних для субстратного інгібування (рис.8). Для подальшого кінетичного аналізу було застосовано лінієрізацію результатів у координатах [S]/Vst від [S] (рис. 9). За такої обробки даних залежності мають вигляд параболи.

Рис. 8 Залежність стаціонарної швидкості (Vst) ферментативного окиснення ЛК у складі змішаних міцел; І - міцели типу І; ІІ - міцели типу ІІ; ІІІ - міцели типу ІІІ (рН 6,3); IV - міцели типу І (рН 5,0)

Рис. 9 Субстратна залежність ферментативного окиснення ЛК у складі змішаних міцел типу І; типу ІІ; типу ІІІ в координатах {[S]/Vst; [S]}

Використовування діапазону малих концентрацій субстрату, де спостерігається майже строга лінійність залежності Vst ліпоксигеназної реакції від концентрації субстрату, дає можливість оцінити значення Vmax та уявну Кm/ [Cornish-Bowden A., 2004].

Аналіз експериментальних даних в координатах {1/[S]n0+[S]n0/KsKns; 1/V} для значень n=1,2,3 показав, що лінійний характер залежності відповідає n=2, при цьому справджується тотожність [Березин И.В., 1976]

,

тобто кількість додаткових молекул субстрату, які приєднуються до фермент-субстратного комплексу, дорівнює двом.

Відповідно, за умов інгібування ферментативної реакції субстратом (без та у присутності інгібітора) - ЛК фермент-субстратний комплекс має найбільш вірогідний склад ES3.

Рис. 10 Субстратна залежність ферментативного окиснення ЛК у складі змішаних міцел типу І; типу ІІ; типу ІІІ, в координатах {Vst ; lg [S]}

Експериментальні значення швидкості в координатах {Vst ; lg [S]0} (рис. 10) мають дзвоноподібний несиметричний (права гілка кривої значно крутіше за ліву) вигляд, що дає підстави вважати, що інгібування ліпоксигеназної реакції відбувається при приєднанні декількох молекул субстрату до фермент-субстратного комплексу [Березин И.В., 1976] і описується наступною схемою:

Якщо зв`язування додаткових молекул субстрату n з фермент-субстратним комплексом характеризується константою рівноваги Kns, тоді рівняння швидкості ферментативної реакції, яка перебігає в стаціонарному режимі, матиме наступний вигляд:

, (2)

де Vst - стаціонарна швидкість реакції, Vmax- максимальна швидкість реакції, Ks - субстратна константа, Kns- константа рівноваги, n- кількість додаткових молекул субстрату, які зв`язуються з фермент-субстратним комплексом. Розраховані за рівнянням (2) значення кінетичних параметрів ліпоксигеназної реакції з урахуванням n=2 (табл.4) показують, що максимальна швидкість окиснення ЛК, що каталізується 5-ЛО, у присутності інгібітора суттєво знижується, а кількість додаткових молекул лінолевої кислоти є незмінною, що говорить про відсутність конкуренції між ЛГК та ЛК за місця зв'язування субстрату з фермент-субстратним комплексом. Інгібіторний вплив ЛГК пояснюється здатністю до утворення комплексу ЛГК-Fe3+-5-ЛО, хелатуючи атом заліза, як було показано раніше за допомогою ЕПР-методу [Butovich I.A., 2002].

Таблиця 4 Вплив лінолелгідроксамової кислоти на кінетичні параметри реакції ферментативного окиснення лінолевої кислоти у складі змішаних міцел типу І, ІІ та ІІІ

	І	ІІ	ІІІ
Vmax, мкмоль/хв	26,47±1,21	14,56±0,52	10,08±0,46
Ks, мкМ	102±16,06	59,75±10,47	53,72±7,5
Kns, мМ	7586060±150524	5314520±958684	2012270±506753
n	2	2	2

Застосування способів графічного зображення рівняння Міхаеліса-Ментен [Cornish-Bowden A., 2004] для області низьких концентрацій субстрату, де спостерігається прямолінійна залежність Vst від зростаючої кількості “суперсубстрату” для всіх типів змішаних міцел у координатах {1/Vst;1/[S]}, {Vst;-lg[S]}, {[S]/Vst;[S]} дозволило обрахувати кінетичні константи. Присутність інгібітора у системі із зростаючою кількістю міцел пропорційно змінює величини Km/ та Vmax, що може свідчити про вплив ЛГК у даній системі за змішаним або безконкурентним типом інгібування. Характер впливу інгібітора на залежність між концентрацією ЛК та швидкістю ферментативної реакції вказує на безконкурентний тип інгібування ЛГК реакції 5-ЛО окиснення лінолевої кислоти у складі змішаних міцел типу І.

Дослідження впливу 13-гідроксиду ЛГК та 13-гідропероксиду ЛГК на активність 5-ЛО з бульб картоплі та 12-ліпоксигенази з лейкоцитів свині показали, що окиснені форми ЛГК виступають не менш ефективними інгібіторами вищезгаданих ферментів (рис. 11). Значення ІС50 для 13-гідроксиду ЛГК становить 4 мкМ для 5-ЛО, а ІС50 13-гідропероксиду ЛГК 0,7 мкМ для 12-ЛО. Для 5-ЛО ефективність 13-гідропероксиду ЛГК є такою ж як для неокисненої форм ЛГК (ІС50 для ЛГК 7 мкМ), більш того, наступна форма трансформації - 13-гідроксид ЛГК демонструє значні інгібіторні властивості (рис. 11, крива 1). Для іншого ферменту - 12-ЛО, ІС50 для 13-гідропероксида ЛГК становить 0,7 мкМ, що на порядок менше ІС50 для ЛГК (3,5 мкМ відповідно) (рис. 11, крива 3). Такі дані дають підстави стверджувати, що у випадку подальшої трансформації інгібітора ліпоксигеназ у клітині ефективність інгібування ЛГК не знижується та може дещо зростати, як у випадку рослинної ліпоксигенази, так і у випадку 12-ЛО тваринного походження. Ефективність інгібітора також здатна змінюватись від часу преінкубації з ферментом. 5-ЛО з бульб картоплі за оптимальних умов не окиснює ЛГК на відміну від соєвої 13-ЛО, яка здатна використовувати молекулу ЛГК в якості субстрату.

Рис. 11 Вплив окиснених форм ЛГК на окиснення ЛК ліпоксигеназами: 1 - вплив 13-гідроксиду ЛГК на 5-ЛО; 2 - вплив 13-гідропероксиду ЛГК на 5-ЛО; 3 - вплив 13-гідропероксиду ЛГК на 12-ЛО; 4 - преінкубація 15 хв. 13-гідропероксиду ЛГК з 12-ЛО



Рис. 12 Вплив 50 мкМ фосфатидної кислоти на окиснення 100 мкМ лінолевої кислоти та 10 мкМ ЛГК у міцелярній системі (0,02% луброл РХ), рН 5,0

При моделюванні умов, наближених до in vivo, а саме, внесенні 50 мкМ ФК у суміш міцел лубролу РХ без субстрату - лінолевої кислоти - при рН 5,0 спостерігається невелика активність 5-ЛО, тобто реакція окиснення ЛГК перебігає з малою швидкістю (рис. 12). При внесенні в реакційну суміш додатково 100 мкМ ЛК ця швидкість зростає. Тобто, в клітині можлива ситуація, коли при взаємодії з мембранними компонентами, фосфоліпідами, які є мікрооточенням мембранозв'язаного ферменту 5-ліпоксигенази, відбувається окиснення неспецифічних субстратів, в даному випадку, інгібітора. Є підстави вважати, що молекули ФК взаємодіють з регуляторною ділянкою ферменту, що викликає певні конформаційні зміни і 5-ЛО набуває здатність окислювати інгібітор.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що виявляється у встановленні молекулярних механізмів впливу сполук природного походження та синтетичних похідних природного субстрату лінолевої кислоти на активність ліпоксигеназ у системах, які моделюють клітинне оточення ферменту.

1. Встановлено, що фосфатидна кислота при взаємодії з 5-ліпоксигеназою у міцелярній системі виступає як алостеричний активатор, що призводить до появи додаткового рН оптимуму у кислій області.

2. Фосфатидна кислота в умовах недостатньої кількості субстрату 5-ліпоксигеназної реакції та нефізіологічних значеннях рН бере участь у підтриманні певного рівня первинних продуктів 5-ЛО окиснення лінолевої кислоти шляхом заміщення молекул субстрату в алостеричному центрі ферменту, підвищення спорідненості ферменту до субстрату та зниження частки неферментативно утворених продуктів окиснення лінолевої кислоти.

3. Взаємодія 5-ліпоксигенази з алостеричним активатором фосфатидною кислотою збільшує енергію активації термоінактивації ферменту, що може вказувати на певні конформаційні зміни ферменту, можливо, обумовленими гідрофобними взаємодіями.

4. Лінолелгідроксамова кислота виступає як безконкурентний інгібітор 5-ліпоксигенази в реакції окиснення лінолевої кислоти в модельній системі зі зростаючою кількістю міцел з постійним молярним співвідношенням лінолева кислота (лінолелгідроксамова кислота)/Lubrol РХ.

5. Вперше показано, що окиснені похідні лінолелгідроксамової кислоти мають подібні інгібіторні властивості до неокисненої форми інгібітора по відношенню до рослинних та тваринних ліпоксигеназ, а саме 5-ЛО з бульб картоплі та 12-ліпоксигенази з лейкоцитів свині.

Встановлено, що взаємодія 5-ліпоксигенази з фосфатидною кислотою призводить до окиснення неспецифічного субстрату реакції, а саме її інгібітора - лінолелгідроксамової кислоти, що може свідчити про потенційну можливість регуляції активності ферменту за участі цієї сполуки на клітинному рівні.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Роль 4-гідрокси-ТЕМПО в реакції окислення лінолевого спирту 5-ліпоксигеназою з бульб картоплі / Харченко О.В., Казачков М.Г., Скатерна Т.Д., Бутович І.А. // Біополімери і клітина. - 2001. - Т. 17, № 2. - С. 147-151.

2. Взаємодія 5-ліпоксигенази з алостеричним ефектором - додецилсульфатом натрію / Харитоненко Г.І., Скатерна Т.Д., Мельник А.К., Бабій Л.В., Харченко О.В. // Укр. біохім. журн. - 2008. - Т. 80, № 3. - С. 31-39.

3. Скатерна Т.Д. Вплив фосфатидної кислоти на реакцію окислення лінолевої кислоти 5-ліпоксигеназою з бульб картоплі / Скатерна Т.Д., Харченко О.В. // Укр. біохім. журн. - 2008. - Т. 80, № 3. - С. 21-29.

4. Моделювання дії лінолелгідроксамової кислоти на ліпоксигенази в системах in vitro / Скатерна Т.Д., Копіч В.М., Цернюк В.М., Харченко О.В. // Укр. біохім. журн. - 2009. - Т.81, № 6. - С. 60-71.

5. Скатерна Т.Д. Дослідження термоінактивації 5-ліпоксигенази з бульб картоплі та впливу фосфатидної кислоти на енергію активації процесу денатурації / Скатерна Т.Д., Харитоненко Г.І., Харченко О.В.// Укр. біохім. журн. - 2010. - Т. 82, № 2. - С. 20-26.

6. Phospholipids as possible 5-lipoxygenase regulator on membrane level / Babenko V., Butovich I., Kazachkov M., Kulinichenko A., Paliy T. (Skaterna) // Abstr. of 24th Meeting FEBS, Barcelona, Spain. - 1996. - P. 210.

7. Кинетические особенности ферментативного окисления линолевого спирта в присутствии 5-липоксигенази клубней картофеля (Solanum tuberosum L.) / Харченко О. В., Казачков М. Г., Скатерная Т. Д., Харитоненко A. И., Копич В. Н. // Межд. конф. „Современная физиология растений: от молекул до екосистем”. Материалы докладов. - Сыктывкар, 2007. - С. 153-154.

8. Скатерная Т.Д. Фосфатидная кислота как аллостерический регулятор 5-липоксигеназы из клубней картофеля (Solanum tuberosum L.) / Скатерная Т.Д., Харченко О.В. // Межд. конф. «Современная физиология растений: от молекул до экосистем». Материалы докладов. - Сыктывкар, 2007. - С. 140-141.

9. Skaternaya T.D. The effect of phosphatidic acid on potato tubers 9-lipoxygenase / Skaternaya T.D., Kharchenko O.V. // Abstr. of 2nd International Symposium Plant Growth Substances:Intracellular Hormonal signaling and Applying in Agriculture, Kyiv, Ukraine. - 2007. - P. 23.

10. Харитоненко А.И. Влияние фосфолипидов на активность 9-липоксигеназы из клубней картофеля / Харитоненко А.И., Скатерная Т.Д., Харченко О.В. // ІV Росс. симпозиум «Белки и пептиды». - Казань, 2009. - С. 224.

Размещено на Allbest.ru