Размещено на http://www.allbest.ru/

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН НААН УКРАЇНИ

УДК: 546.48/.73-06:616.45-001.1/.3-085.246.2:546.26]-092.9

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ВПЛИВ СОЛЕЙ КАДМІЮ І КОБАЛЬТУ НА ВИНИКНЕННЯ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕСУ В БІЛИХ ЩУРІВ ТА КОРЕКЦІЯ ПОРУШЕНЬ МЕТАЛОКОМПЛЕКСАМИ Й ЕНТЕРОСОРБЕНТОМ "ФІБРАБЕТ"

03.00.04 - Біохімія

ЧОРНА МАРІЯ ВОЛОДИМИРІВНА

Львів - 2010

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Тернопільському державному медичному університеті імені І.Я. Горбачевського МОЗ України.

Науковий керівник:

Гонський Ярослав Іванович, доктор медичних наук, професор, Тернопільський державний медичний університет імені І.Я. Горбачевського МОЗ України, професор кафедри медичної біохімії та клініко-лабораторної діагностики.

Офіційні опоненти:

Антоняк Галина Леонідівна, доктор біологічних наук, професор, Львівський національний університет імені Івана Франка МОН України, професор кафедри конструктивної географії та картографії;

Ерстенюк Ганна Михайлівна, доктор біологічних наук, професор, Івано-Франківський національний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри біологічної та медичної хімії.

Захист відбудеться "20" квітня 2010 р. о 12⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин НААН України (79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту біології тварин НААН України (79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38).

Автореферат розісланий "18" березня 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради О.І. Віщур.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Важкі метали, в тому числі кадмій та кобальт, як і інші хімічні забрудники, потрапляють у середовище існування людини і тварин не тільки в результаті природних процесів, але й, головним чином, внаслідок інтенсивного розвитку промисловості, нераціонального використання природних ресурсів та урбанізації життя суспільства. Зокрема, джерелами антропогенного забруднення кадмієм є стічні води, згоряння відходів, вугілля, бензину, виробництво мінеральних добрив, кадмієво-нікелевих акумуляторів, виплавка та електролітична очистка цинку (Jin T. et al., 2003; Гребняк М.П., 2007). Забруднення кобальтом можливе при виробництві скла, фарфору, цементу, постійних магнітів, у металургії при виплавці сталі й твердих сплавів (Bucher J.R. et al., 1999; Талакин Ю.Н., 2007). Також можливе одночасне надходження сполук кадмію та кобальту в атмосферу при спалюванні відходів на сміттєпереробних заводах, їх використанні для виробництва фарб та барвників, виплавці сплавів з підвищеною стійкістю та міцністю, виготовленні ювелірних виробів, кольорового скла і посуду (Трахтенберг И.М., 1994; Бабанин И., 2008).

Молекулярними мішенями, тобто об'єктами дії іонів важких металів, є: гемовмісні білки, в тому числі ферменти, субстрати вільнорадикального окиснення ліпідів і білків, системи антиоксидантного захисту, ферменти транспорту електронів і синтезу АТФ, білки клітинних мембран та їх іонні канали (Антоняк Г.Л. та співавт., 2007; Губський Ю.І. та співавт., 2008.).

Підвищене надходження іонів важких металів викликає в організмі стан оксидативного стресу, що характеризується збільшенням продукції активних форм кисню, активацією процесів вільнорадикального окиснення ліпідів і білків, пригніченням системи антиоксидантного захисту (Воробьева Е.Н., 2005; Гаврилюк С.О. та співавт., 2005).

Зважаючи на ці обставини, триває пошук препаратів з високою ефективністю до хелатування іонів важких металів. Металокомплекси амінокислот з металами-мікроелементами можуть мати таку активність, а також проявляти антиоксидантну дію (Михалків М.М., 2002; Острівка О.І., 2007). Преднізолон як препарат глюкокортикоїдів пригнічує активність лізосомних ферментів, чим зменшує прояви запалення та вільнорадикального окиснення (ВРО), чинить гальмівний вплив на активність фосфоліпази А ₂ та утворення ліпотропінів у печінці, які зменшують інтенсивність окиснювальних процесів. Застосування ентеросорбентів дозволяє зв'язувати токсичні елементи ще в кишківнику (Гранківська С.С., 2002; Вершинин А.С., 2008). Однак такі способи зниження токсичної дії солей кадмію та кобальту на організм вимагають глибшого вивчення та обґрунтування. Це зумовлює актуальність проведених експериментальних досліджень та вказує на доцільність пошуку нових засобів корекції патологічних змін, які виникають внаслідок токсичного впливу важких металів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є складовою частиною планової наукової міжкафедральної теми "Особливості порушень метаболічних процесів в організмі тварин, уражених солями кадмію та іншими ксенобіотиками, і способи їх корекції" кафедр медичної біохімії та клініко-лабораторної діагностики, загальної гігієни та екології Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського (№ держреєстрації 0195U023938). При її виконанні автор дослідила ураження організму тварин солями кадмію і кобальту та вивчила ефективність застосування металокомплексів та ентеросорбенту "Фібрабет" з метою корекції метаболічних порушень.

Мета і завдання дослідження. З'ясувати вплив інтоксикації солями кадмію та кобальту на утворення активних форм кисню і перебіг вільнорадикальних процесів у крові та печінці щурів, вивчити можливість корекції цих порушень за допомогою металокомплексів та ентеросорбенту "Фібрабет".

Відповідно до поставленої мети було визначено такі завдання дослідження:

1. Вивчити в динаміці продукцію активних форм кисню у тканинах щурів за умов впливу солей кадмію, кобальту та їх поєднання.

2. Дослідити стан вільнорадикального окиснення ліпідів і білків у щурів, інтоксикованих солями кадмію і кобальту.

3. Дати оцінку впливу солей кадмію та кобальту на активність прооксидантних і оксидазних ферментів у тканинах щурів.

4. Оцінити функціонування деяких ланок антиоксидантної системи за умов інтоксикації щурів солями кадмію і кобальту окремо та в комбінації.

5. Вивчити вплив преднізолону і металокомплексів амінокислот на процес утворення радикалів у тварин з кадмій-кобальтовою інтоксикацією та вибрати найефективніший з них для подальшого дослідження.

6. Обґрунтувати доцільність використання комбінації тирозинату цинку та ентеросорбенту "Фібрабет" з метою корекції біохімічних порушень у тварин з інтоксикацією, викликаною одночасним введенням кадмію і кобальту хлоридів.

Об'єкт дослідження - токсичне ураження білих щурів кадмію хлоридом, кобальту хлоридом та за їх комбінації.

Предмет дослідження - рівень утворення вільних радикалів, показники вільнорадикального окиснення ліпідів і білків, функціонування антиоксидантної системи в щурів, уражених важкими металами, і після корекції тирозинатом цинку та ентеросорбентом "Фібрабет".

Методи дослідження: біохімічні (спектрофотометричні), хімічні (синтез металокомплексів амінокислот), УФ-спектроскопія (визначення спектрів поглинання тирозинату цинку), статистичні (метод варіаційної статистики з використанням t-критерію Стьюдента).

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше, на основі комплексного дослідження, встановлено, що отруєння тварин внаслідок поєднання кадмію хлориду та кобальту хлориду інтенсифікує утворення активних форм кисню (супероксид-аніон радикала, гідроксильного радикала, пероксиду водню) і активацію процесів вільнорадикального окиснення ліпідів та білків. Вивчено коригувальний вплив преднізолону, тирозинату міді, тирозинату цинку, гістидинату цинку і глутамату магнію з вітаміном В ₆ на утворення радикалів та виявлено найбільшу ефективність за умов введення тирозинату цинку. Вперше показано, що введення даного металокомплексу знижує показники вільнорадикального окиснення ліпідів та білків як у плазмі крові, так і в печінці уражених тварин. Доведено більш ефективний вплив комбінованої дії тирозинату цинку та ентеросорбенту "Фібрабет", застосованих з метою корекції біохімічних порушень за одночасного введення солей кадмію і кобальту.

Практичне значення отриманих результатів. Результати проведених досліджень розширюють і поглиблюють існуючі уявлення про механізми токсичного впливу іонів кадмію та кобальту на організм і відкривають шляхи для вдосконалення методів діагностики та корекції отруєнь організму важкими металами за допомогою ентеросорбентів і антиоксидантів. Дані про рівень продукції активних форм кисню, зокрема супероксид-аніон радикала, гідроксильного радикала та пероксиду водню, можна застосовувати як додатковий діагностичний критерій для оцінки тяжкості перебігу експериментального токсичного ураження організму важкими металами. Металокомплекси амінокислот з Cu, Zn та Mg, зважаючи на їх виразну антиоксидантну дію, можуть бути рекомендовані для подальшого вивчення і використання з метою корекції біохімічних порушень за патології, що супроводжується активацією вільнорадикальних процесів.

Результати досліджень впроваджено в навчальний процес на кафедрах медичної біохімії та клініко-лабораторної діагностики, фармакології з клінічною фармакологією, загальної гігієни та екології, фармацевтичної хімії Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського, кафедрі хімії Тернопільського національного педагогічного університету імені Володимира Гнатюка, кафедрі харчової біотехнології і хімії Тернопільського державного технічного університету імені Івана Пулюя та кафедрі біологічної та медичної хімії Івано-Франківського національного медичного університету, що підтверджено відповідними актами впровадження.

Особистий внесок здобувача. Автор особисто здійснила пошук і аналіз наукових джерел, самостійно провела експериментальні дослідження, статистичний аналіз одержаних результатів, написала та оформила всі розділи дисертації. Завдання, висновки та інтерпретацію окремих результатів сформульовано з допомогою наукового керівника. У наукових роботах, опублікованих у співавторстві, автору належать опрацювання даних літератури та результати експериментальних досліджень.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, які включено до дисертації, оприлюднено на підсумкових науково-практичних конференціях "Здобутки клінічної і експериментальної медицини" (Тернопіль, 2006, 2008, 2009), науковій конференції "Роль месенджерних систем у патогенезі патологічних процесів різної етіології" (Тернопіль, 2007), XІІ і ХІІІ Міжнародних медичних конгресах студентів і молодих вчених (Тернопіль, 2008, 2009), І Науково-практичній конференції "Актуальні питання патології за умов дії надзвичайних факторів на організм" (Тернопіль, 2008). вільнорадикальне окиснення кадмій металокомплекс

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових робіт (2 одноосібно), з яких 4 - у фахових наукових виданнях, 7 - у матеріалах конференцій.

Структура дисертації. Дисертація містить такі розділи: вступ, огляд літератури, матеріали і методи дослідження, результати власних досліджень, аналіз та узагальнення результатів дослідження, висновки, список використаних джерел (всього 325 найменувань, з яких 87 - латиною), 8 додатків. Роботу викладено на 160 сторінках комп'ютерного набору (основна частина становить 119 сторінок) і проілюстровано 24 таблицями та 33 рисунками, які займають 21 сторінку.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури висвітлено характеристику основних активних форм кисню (АФК), їх роль та вплив на організм, механізми дії солей кадмію і кобальту на вільнорадикальне окиснення ліпідів, білків та функціонування антиоксидантної системи. Описано можливості застосування коригувальних чинників за даного ураження.

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проведено на 162 білих безпородних щурах-самцях масою 180-200 г, яких утримували у віварію на стандартному раціоні.

Токсичне ураження викликали шляхом одноразового внутрішньо-шлункового введення щурам водного розчину кадмію хлориду в дозі 7 мг/кг маси тіла (1/12 LD₅₀) та кобальту хлориду в дозі 5 мг/кг (1/12 LD₅₀) (Губский Ю.И. и соавт., 1993). З метою корекції порушень через годину після введення кадмію та кобальту хлоридів вводили одноразово внутрішньо-м'язово преднізолон у дозі 1 мг/кг або внутрішньо-шлунково металокомплекси в таких дозах: тирозинат міді - 2,0 мг/кг, тирозинат цинку - 0,36 мг/кг, гістидинат цинку - 0,34 мг/кг, глутамат магнію з вітаміном В _6-1,5 мг/кг. Ентеросорбент "Фібрабет" тварини отримували щодоби протягом усього дослідження в дозі 1 г/кг. Розрахунок доз металокомплексів амінокислот проводили з огляду на концентрації мікроелементів у сироватці крові щурів (Михалків М.М., 2002; Скальный А.В., 2001; Громова О.А., 2004). Металокомплекси синтезовано на кафедрі медичної біохімії та клініко-лабораторної діагностики Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського з відповідних амінокислот та гідроксидів металів, які брали в еквімолярних концентраціях.

Комплексоутворення між тирозином і цинком підтверджено за допомогою УФ-спектроскопії і проявляється підвищенням оптичної густини металокомплексу в максимумі поглинання при 293 нм порівняно із самим тирозином. Одержаний хелат стійкий у слабколужному середовищі, розкладається в кислому.

Усіх піддослідних тварин було поділено на такі групи: І - інтактні (контрольні); ІІ - уражені CdCl₂; ІІІ - уражені CoCl₂; IV - уражені CdCl₂ + CoCl₂; V - уражені CdCl₂ + CoCl₂, з корекцією преднізолоном; VІ - уражені CdCl₂ + CoCl₂, з корекцією тирозинатом міді; VII - уражені CdCl₂ + CoCl₂, з корекцією тирозинатом цинку; VIII - уражені CdCl₂ + CoCl₂, з корекцією гістидинатом цинку; IX - уражені CdCl₂ + CoCl₂, з корекцією глутаматом магнію з вітаміном В₆; X - уражені CdCl₂ + CoCl₂, з корекцією ентеросорбентом "Фібрабет" і металокомплексом тирозинатом цинку. Декапiтацiю щурів здійснювали під тіопенталовим наркозом через 1, 4, 7 та 10 діб від моменту введення отрут. Досліджували плазму крові й тканину печінки, з якої на холоді готували 10 % гомогенат на фосфатному буфері (рН=7,4).

Продукцію супероксид-аніон радикала (О₂) визначали за тестом з нітросинім тетразолієм у печінці зі специфічними індукторами НАДФН і НАДН для оцінки, відповідно, ролі мікросом та мітохондрій в цьому процесі (Почерняева В.Ф. и соавт., 2005). Швидкість утворення гідроксильного радикала (ОН) вивчали за його здатністю окиснювати 2-дезоксирибозу, що розпадається до малонового діальдегіду. Останній з тіобарбітуровою кислотою дає забарвлений комплекс (Ткаченко М.М. та співавт., 2002). Вміст пероксиду водню (Н₂О₂) визначали спектрофотометричним методом за знебарвленням перманганату калію при внесенні кислоторозчинної фракції, що містить Н₂О₂ (Данилович Ю.В., 2004). Прооксидантний статус оцінювали за активністю фосфоліпази А₂ (ФЛА₂) [КФ 3.1.1.4], яка здатна каталізувати реакцію відщеплення від лецитину жирних кислот, вміст яких визначали шляхом титрування лугом за присутності фенолфталеїну (Гутилин С. А., 1975). Активність цитохромоксидази (ЦХО) [КФ 1.9.3.1]визначали методом (Кривченкова Р.С., 1977), який полягає в окисненні ферментом диметил-п-фенілендіаміну і б-нафтолу з утворенням забарвленого продукту, зокрема індофенолового синього. Рівень вільнорадикального окиснення ліпідів оцінювали за вмістом ТБК-активних продуктів (ТБК АП) (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977) та концентрацією дієнових кон'югатів (ДК), які екстрагували в гептан-ізопропаноловій суміші й реєстрували при = 232 нм (Волчегорский И.А. и соавт., 1989). Для оцінки вмісту окиснювально модифікованих білків (ОМБ) фотометрично визначали концентрацію альдегідо- та кетонопохідних білків нейтрального (ОМБ ₃₇₀) й основного (ОМБ ₄₃₀) характеру за відповідними спектрами поглинання 2,4-динітрофенілгідразонів (Мещишен І.Ф., 1999). Активність супероксиддисмутази (СОД) [КФ 1.15.1.1]досліджували методом (Чевари С., 1985), який полягає у здатності СОД конкурувати з нітросинім тетразолієм за супероксидні аніони, що утворюються в результаті аеробної взаємодії НАДН з феназинметасульфатом. Концентрацію сечової кислоти визначали із застосуванням стандартної добірки реактивів фірми "Філісит Діагностика" (м. Дніпропетровськ).

Цифровий матеріал піддавали статистичному аналізу з використанням t-критерію Стьюдента (Ланкин Г.Ф., 1990). Зміни вважали вірогідними при р<0,05, р<0,02, р<0,01, р<0,001. Для розрахунків застосовували комп'ютерну програму Excel (Microsoft).

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Особливості оксидативного стресу при ураженні щурів комбінацією кадмію та кобальту хлоридів. Результати досліджень показали, що комбіноване ураження щурів кадмію і кобальту хлоридами викликало більші порушення, ніж за дії кожного з них окремо. Зокрема встановлено, що за одночасного впливу солей важких металів значно інтенсивніше відбувалося утворення супероксид-аніон радикала, гідроксильного радикала та пероксиду водню у тканинах тварин (табл.). Максимальне утворення О₂ було зафіксовано на 4-ту добу дослідження в мітохондріальному електронно-транспортному ланцюгу за стимуляції НАДН. Меншу інтенсивність мали загальна (нестимульована) продукція О₂ та генерування його в мікросомальному електронно-транспортному ланцюгу за стимулювання НАДФН. Отже, найбільша роль в утворенні О₂ належить мітохондріям, що і узгоджується з результатами інших авторів (Виноградов А.Д., 1999; Cadenas E. et al., 2000). За нормального перебігу метаболізму радикали кисню не накопичуються в клітинах, однак їх вміст може зростати, якщо підвищується швидкість утворення або знижується здатність клітини до нейтралізації АФК. За цих умов О₂ зазнає перетворень, що призводять до утворення інших високореакційних сполук, які можуть завдати прямої шкоди клітині (Болдырев А.А., 2001).

Таблиця. Продукція активних форм кисню в печінці щурів, уражених комбінацією CdCl₂ та CoCl₂ (M±m, n=6)

За наявності ферменту супероксиддисмутази О₂ перетворюється в Н₂О₂ (Поберезкина Н.Б., 1989), концентрація якого у плазмі крові зростала вже на 1-шу добу дослідження при комбінованому ураженні щурів сполуками важких металів. За звичайних умов Н₂О₂ розкладається під дією ферментів каталази й глутатіонпероксидази, тому його концентрація в біологічних рідинах не є високою. Різке зростання вмісту цього метаболіту, можливо, зумовлене взаємодією іонів важких металів із SH-групами ферментів-антиоксидантів і, як наслідок, зниженням їх активності (Casalino E. et al., 2002). За комбінованого введення сполук металів спостерігається і найвище утворення ОН, який, як відомо, є найбільш реакційноздатною частинкою серед АФК (Ткаченко М.М. та співавт., 2005). Максимального рівня продукція цього радикала досягала на 4-ту добу після введення солей кадмію та кобальту, що було у 3,2 раза більше, ніж у контролі (p<0,001).

У наших дослідженнях за впливу солей кадмію та кобальту зростає активність прооксидантного ферменту ФЛА ₂, що становила 247 (p<0,001) і 562 % (p<0,001) від рівня інтактних тварин на 1-шу та 4-ту доби відповідно. Це, можливо, відбувається тому, що внаслідок пошкодження мембран із структур ендоплазматичного ретикулума надходять іони Са²⁺, які активують ФЛА₂. Остання, у свою чергу, каталізує відщеплення жирних кислот від молекул фосфоліпідів, чим полегшує доступ вільних радикалів до ненасичених зв'язків цих кислот, що призводить до інтенсифікації процесів ПОЛ (Adibhatla R.M. et al., 2006; Reid R.C., 2005).

При зміні умов функціонування дихального ланцюга, зокрема при зниженні активності ЦХО внаслідок порушення конформації активного центру ферменту, в ньому стає можливим одноелектронне відновлення кисню, що призводить до утворення О₂ (Скулачев В.П., 2001). З результатів досліджень видно, що під впливом вивчених токсикантів відбувається вірогідне пригнічення активності ЦХО, а саме: в 1,29 рази на 1-шу добу та в 1,4 рази на 4-ту добу експерименту порівняно з інтактними тваринами. Ці дані свідчать про порушення електронного транспорту в термінальній ділянці дихального ланцюга і узгоджуються з виявленим максимальним утворенням вільних радикалів у цей термін.

Підвищення продукції АФК може зумовлювати порушення структури мембранних ліпідів, особливо тих, що містять ненасичені подвійні зв'язки. Так, при поєднаному ураженні солями кадмію і кобальту рівень ДК у плазмі крові та печінці був вірогідно вищим протягом усього експерименту, ніж у контролі. Найбільший вміст ТБК АП зафіксовано у печінці на 4-ту добу від моменту ураження. Значення цього показника становило 283 % від рівня, характерного для інтактних тварин. У подальші терміни експерименту спостерігалася тенденція до зниження концентрації ТБК АП, але зміни залишалися вірогідно вищими (p<0,001), ніж показники у контролі.

Вільні радикали здатні взаємодіяти з білками по всій довжині поліпептидного ланцюга, порушуючи їх структуру, що призводить до агрегації або фрагментації білкової молекули. Карбоксильні групи білків під дією АФК перетворюються в карбонільні, які, у свою чергу, можуть взаємодіяти з аміногрупами, утворюючи шифові основи. Останні в кінцевому результаті спричиняють утворення поперечних зв'язків між молекулами білків, що змінює їх активність (Дубініна О.Ю., 2001). Найвищий вміст ОМБ ₃₇₀ та ОМБ ₄₃₀ було зафіксовано на 4-ту добу експерименту, відповідно, в 1,95 (p<0,001) й 1,63 рази (p<0,001) більше, ніж у контролі.

Як відомо, для захисту від дії радикалів в організмі існує антиоксидантна система, яка містить ферментативні й неферментативні компоненти (Бєленічев І.Ф. та співавт., 2002; Казимирко В.К., 2004). Одним із основних її ензимів є СОД, яка інактивує супероксидні радикали кисню. Найбільше пригнічення активності даного ферменту встановлено у тварин, уражених CdCl₂ та CoCl₂ в комбінації. Уже через 24 год після введення солей металів активність СОД у щурів цієї групи становила 79 % (p<0,02) порівняно з контролем, а на 4-ту - знизилася до 67 % (p<0,001). Пригнічення активності СОД, можливо, зумовлене зв'язуванням SH-груп ферменту іонами важких металів і порушенням структури її молекули, а також підвищенням концентрації Н₂О₂, який, як відомо, є інгібітором реакції дисмутації О₂ (Поберезкина Н.Б., 1989).

Сечова кислота як неферментативний компонент антиоксидантної системи може реагувати з вільнорадикальними частинками, утворюючи малоактивні радикали уратів (Squadrito G.L. et al., 2000; Атаман Ю.О., 2007). У нашому експерименті концентрація цієї кислоти різко знижувалася і найменшого значення досягала на 4-ту добу, що було у 2,3 рази менше, ніж в інтактних щурів. Очевидно, зниження концентрації сечової кислоти в плазмі крові пов'язане з активацією механізмів захисту від АФК еритроцитів, моноцитів та лімфоцитів (Курашвили Л.В., 2003).

Підсумовуючи одержані результати з використанням літературних даних (Гонський Я.І., 2005; Калиман П.А. и соавт., 2005; Губський Ю.І. та співавт., 2008), можна запропонувати узагальнену схему метаболічних порушень, які розвиваються при потраплянні сполук кадмію та кобальту в організм (рис. 1).

Рис. 1. Узагальнена схема патогенної дії кадмію та кобальту

Вплив преднізолону і металокомплексів амінокислот на утворення активних форм кисню у тварин, уражених комбінацією солей кадмію та кобальту. З метою корекції порушень, викликаних комбінованою дією солей кадмію та кобальту, ми використали преднізолон і металокомплекси амінокислот. Для вибору чинника, який проявляв би найбільшу ефективність, вивчено їх вплив на продукцію АФК.

Результати експерименту показали, що введення піддослідним тваринам преднізолону і металокомплексів призводило до зниження продукції О₂*, ОН та Н₂О₂ (рис. 2). Встановлено, що за зменшенням здатності пригнічувати активовані токсикантами вільнорадикальні реакції застосовані чинники можна розмістити в ряд: тирозинат цинку > тирозинат міді > глутамат магнію з вітаміном В₆ > гістидинат цинку > преднізолон. При введенні ураженим щурам тирозинату цинку продукція О₂* в середньому знизилася на 20 %, ОН - на 33 %, а вміст Н ₂О ₂ - на 38 %, що дозволило вибрати цю сполуку для подальшого вивчення коригувального впливу на процеси пероксидного окиснення ліпідів та білків, а також стану антиоксидантної системи.

Рис. 2. Вплив преднізолону і металокомплексів на утворення пероксиду водню в плазмі крові та гідроксильного радикала в печінці тварин, уражених комбінацією кадмію та кобальту хлоридів (M±m, n=6): - інтактні; - уражені CdCl2 + CoCl2; - уражені, з корекцією преднізолоном; - уражені, з корекцією тирозинатом Cu; - уражені, з корекцією тирозинатом Zn; - уражені, з корекцією гістидинатом Zn; - уражені, з корекцією глутаматом Mg з вітаміном В 6

Вплив тирозинату цинку та ентеросорбенту "Фібрабет" на окиснювальні процеси у тварин з кадмій-кобальтовою інтоксикацією. Враховуючи те, що введення тирозинату цинку не призводить до повної нормалізації рівня АФК, наступним етапом наших досліджень було вивчення впливу цього металокомплексу та ентеросорбенту "Фібрабет" на метаболічні порушення у тварин, уражених кадмієм і кобальтом. Відомо, що у разі перорального отруєння важкими металами ефективним неінвазивним методом детоксикації є ентеросорбція. Сорбент "Фібрабет" створений проф. Я.І. Гонським на кафедрі медичної біохімії та клініко-лабораторної діагностики Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського і рекомендований МОЗ України як харчова біологічно активна добавка (Свідоцтво № 7.09.2951 від 25.11.1997 р.), одержана з насіннєвих оболонок пшениці (висівки) та гречки, насіння льону, білої глини (каоліну) та соку буряка столового. Отже, крім сорбуючих речовин, ентеросорбент "Фібрабет" у своєму складі також містить вітаміни, мікроелементи та природні антиоксиданти.

Результати експерименту показали, що додаткове застосування ентеросорбції ефективніше знижувало утворення АФК, ніж використання тільки тирозинату цинку, але до рівня, характерного для інтактних тварин, дані показники не наближалися.

У дослідженнях встановлено, що введення тирозинату цинку та ентеросорбенту "Фібрабет" позитивно впливає й на інші патологічні процеси, зумовлені дією солей важких металів. Зокрема, вивчені коригувальні чинники вплинули на суттєвіше зниження активності ФЛА₂, а саме: у 2,18 рази на 1-шу добу та у 3,13 рази на 4-ту добу досліджень порівняно з тваринами, яким корекцію не проводили. Ми вважаємо, що такий ефект, можливо, спричинений мембраностабілізуючими властивостями використаного металокомплексу та, як наслідок, зниженням рівня іонів Са²⁺ у внутрішньоклітинному просторі (Гордеева А.В. и соавт., 2003).

Крім того, додаткове застосування ентеросорбції у тварин з інтоксикацією іонами Cd²⁺ і Co²⁺ підвищило рівень активності ЦХО - термінального ферменту оксидазного окиснення. На 1-шу добу дослідження активність ЦХО зросла на 22 %, а на 4-ту - на 27 % порівняно з ураженими щурами, що становило, відповідно, 94 та 91 % від рівня інтактних тварин.

Оскільки в ході експерименту із застосуванням тирозинату цинку та поєднанням його з ентеросорбентом спостерігалося значне зменшення продукції АФК, це позначилося і на процесах ліпопероксидації. При введенні лише тирозинату цинку зафіксовано зниження концентрації ДК і ТБК-активних продуктів у плазмі крові та печінці щурів. Поєднана дія металокомплексу й ентеросорбенту "Фібрабет" призвела до нормалізації вмісту ДК і ТБК АП у плазмі крові та більш значного зниження цих показників у печінці.

Для повнішого вивчення антиоксидантних властивостей тирозинату цинку важливо було дослідити його вплив на процеси окиснення білків. Введення його тваринам з кадмій-кобальтовою інтоксикацією знизило рівень ОМБ як нейтрального, так і основного характеру, але більшою мірою це стосувалося ОМБ ₄₃₀. Щодо додаткового застосування ентеросорбції, то за цих умов показники ОМБ ₃₇₀ та ОМБ ₄₃₀ зменшилися і вірогідно не відрізнялися від рівня, характерного для інтактних тварин. Ефективніший вплив досліджуваних чинників на процеси вільнорадикального окиснення білків, ніж ліпідів, можливо, зумовлений включенням тирозину в процес синтезу білка і, таким чином, відновленням білоксинтезуючої функції печінки, пригнічення якої спостерігалося за інтоксикації кадмію та кобальту хлоридами.

Проведені експерименти показують, що при застосуванні комбінації коригувальних чинників активність СОД у печінці уражених щурів вірогідно зростала (p<0,001) і досягла 99 % на 1-шу добу та 96 % - на 4-ту від рівня, характерного для інтактних щурів. Зафіксовано також більш виразне підвищення вмісту сечової кислоти, ніж при використанні тільки тирозинату цинку, а саме: на 87 % на 1-шу добу та на 70 % - на 4-ту від рівня в уражених тварин. Хоча концентрація цього неферментативного антиоксиданту зростала, її значення залишалося нижчим від рівня інтактних щурів як на 1-шу добу, так і на 4-ту.

Узагальнюючи отримані результати досліджень, можна стверджувати, що за введення отруєним кадмію та кобальту хлоридами щурам тирозинату цинку спостерігалась тенденція до пригнічення оксидативного стресу. Ефективність металокомплексу, можливо, пов'язана з тим, що тирозин, завдяки фенольному гідроксилу, може взаємодіяти з радикалами й обривати ланцюгові реакції їх утворення (Казимирко В.К., 2004), а додаткове введення в організм іонів цинку впливає на процес адсорбції Cd²⁺ і пригнічує його всмоктування (Chmielnicka J., Sowa B., 1996).

Ефективніше зниження продукції радикалів та процесів, які ними ініційовані, відбувалося за додаткового застосування ентеросорбції. Роль ентеросорбенту полягала у зв'язуванні ще в шлунку іонів кадмію та кобальту, а також інших токсичних метаболітів і, таким чином, попередженні їх прооксидантних властивостей. Це підтвердилось зниженням до рівня інтактних тварин активності ФЛА₂, показників продуктів ліпопероксидації та ОМБ. Введення тирозинату цинку разом з ентеросорбентом також сприяло ефективнішому відновленню показників антиоксидантної системи.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення і новий шлях вирішення наукового завдання, що полягає у встановленні особливостей процесів утворення радикалів і стану вільнорадикального окиснення ліпідів та білків у тварин, отруєних кадмію хлоридом, кобальту хлоридом та за їх комбінації. З метою корекції порушень, спричинених токсикантами, вперше застосовано металокомплекси та вивчено їх вплив на продукцію активних форм кисню. Досліджено вплив тирозинату цинку на метаболічні порушення в організмі уражених щурів окремо та в поєднанні з ентеросорбентом "Фібрабет".

У результаті вирішення наукового завдання зроблено такі висновки:

1. Отруєння тварин як кадмію хлоридом, так і кобальту хлоридом супроводжувалось посиленням процесів утворення вільних радикалів. Найвищого рівня продукція активних форм кисню у печінці досягала на 4-ту добу дослідження за комбінованого ураження вказаними важкими металами, а саме: загальна продукція супероксид-аніон радикала становила 219 % (p<0,001), від мікросомального ланцюга - 126 % (p<0,01), від мітохондріального ланцюга - 176 % (p<0,001), виходячи з рівня інтактних щурів. Концентрація пероксиду водню в експериментальних щурів вірогідно збільшувалася у 2,26 рази, а утворення гідроксильного радикала - в 3,06 рази відносно показника контрольних тварин.

2. Під впливом кадмію хлориду, кобальту хлориду та їх комбінації вірогідно підвищувалася активність прооксидантного ферменту фосфоліпази А ₂, максимальні значення якої було відзначено на 4-ту добу дослідження. У той самий період активність цитохромоксидази зазнавала інгібування, що супроводжувалось максимальною продукцією активних форм кисню.

3. У всіх серіях експерименту спостерігалося зростання інтенсивності процесів вільнорадикального окиснення ліпідів. Найвищого рівня його показники досягли в печінці за одночасного введення солей кадмію та кобальту, зокрема вміст дієнових кон'югантів збільшився у 2,82 рази (p<0,001) на 1-шу добу, продуктів, що реагують з тіобарбітуровою кислотою, - в 2,83 рази (p<0,001) на 4-ту добу порівняно з рівнем в інтактних тварин. Концентрація альдегідо- та кетонопохідних нейтрального (ОМБ₃₇₀) й основного (ОМБ₄₃₀) характеру максимального значення досягла на 4-ту добу від моменту ураження і становила, відповідно, 195 (p<0,001) та 163 % (p<0,001) від рівня контролю.

4. Пригнічення антиоксидантної системи спричинене комбінованим впливом важких металів, збігалося в часі з найбільшим утворенням вільних радикалів. Активність супероксиддисмутази знижувалася до 67 % (p<0,001), а концентрація сечової кислоти - до 44 % (p<0,001) порівняно з рівнем, характерним для інтактних тварин.

5. Застосовані з метою корекції процесів утворення вільних радикалів металокомплекси та преднізолон за зниженням ефективності можна розмістити в такій послідовності: тирозинат цинку > тирозинат міді > глутамат магнію з вітаміном В₆ > гістидинат цинку > преднізолон.

6. Застосування тирозинату цинку в щурів з комбінованим ураженням кадмію та кобальту хлоридами сприяло зниженню інтенсивності процесів ліпопероксидації і більшою мірою - процесів окиснення білків. Більш виразний позитивний вплив металокомплексу відзначено при введенні його разом з ентеросорбентом "Фібрабет", що проявлялось у нормалізації активності фосфоліпази А ₂ на 1-шу добу дослідження та вмісту окиснювально модифікованих білків, вірогідному зниженні концентрації продуктів ліпопероксидації у середньому в 1,7 рази (p<0,001).

Практичні рекомендації:

1. Зважаючи на встановлені антиоксидантні властивості металокомплексів, таких, як тирозинат міді, тирозинат цинку, гістидинат цинку і глутамат магнію з вітаміном В ₆, можна рекомендувати поглиблене подальше вивчення їх коригувальної дії.

2. З метою корекції активованих важкими металами процесів утворення радикалів і вільнорадикального окиснення ліпідів та білків в організмі тварин рекомендується застосовувати тирозинат цинку. Для досягнення більшої ефективності можна рекомендувати комбінацію тирозинату цинку з ентеросорбентом "Фібрабет".

3. Використовувати результати проведених досліджень у навчальному процесі на кафедрах патологічної фізіології, медичної біохімії та клініко-лабораторної діагностики, фармакології, фармацевтичної хімії, загальної гігієни і екології Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського та інших медичних вузів України.

СПИСОК ДРУКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Чорна М.В. Вплив металокомплексу тирозинату цинку та ентеросорбенту "Фібрабет" на генерацію активних форм кисню та окиснювальну модифікацію білків у щурів, уражених хлоридами кадмію та кобальту / М.В. Чорна // Медична хімія. - 2008. - Т. 10, № 4. - С. 118-122.

2. Чорна М.В. Корекція металокомплексами вільнорадикальних порушень в організмі щурів, уражених кадмію та кобальту хлоридами / М.В. Чорна // Світ біології та медицини. - 2009. - № 2. - С. 102-106.

3. Гонський Я.І. Динаміка вмісту активних форм кисню і вільнорадикального окиснення ліпідів та білків у щурів, уражених хлоридами кадмію та кобальту / Я.І. Гонський, М.В. Чорна // Медична хімія. - 2008. - Т. 10, № 1. - С. 102-105. (Здобувач провела всі експериментальні дослідження, здійснила статистичну обробку їх результатів, оформила статтю до друку).

4. Стан прооксидантної та антиоксидантної систем у тварин, уражених хлоридами кадмію та кобальту, і за їх поєднання / М.В. Чорна, Я.І. Гонський, О.І. Острівка, Н.А. Василишин // Наукові записки Терн. нац. пед. ун-ту. Серія: Біологія. - 2008. - № 4 (38). - С. 128-132. (Здобувач провела дослідження з визначення показників активності системи антиоксидантного захисту, здійснила статистичну обробку їх результатів, підготувала матеріал до друку).

5. Вплив комбінації солей кадмію і свинцю на ліпідні компоненти печінки / Я.І. Гонський, І.Р. Бекус, С.О. Ястремська, М.В. Чорна // Здобутки клінічної і експериментальної медицини: ХLІХ підсумкова науково-практична конф., 2 черв. 2006 р.: тези доп. - Тернопіль: Укрмедкнига, 2006. - С. 151-153. (Здобувач провела дослідження з визначення концентрації ТБК-активних продуктів, здійснила статистичну обробку їх результатів).

6. Вплив поєднаної дії хлоридів кадмію та кобальту на вміст активних форм кисню у щурів / Я.І. Гонський, М.В. Чорна, М.І. Борис, І.Р. Бекус // Медична хімія: Роль месенджерних систем у патогенезі патологічних процесів різної етіології: конф., 12-13 лист. 2007 р.: тези доп. - 2007. - Т. 9, № 4. - С. 75. (Здобувач провела визначення швидкості утворення вільних радикалів, здійснила статистичну обробку результатів дослідження).

7. Криницька І. Вплив карнітину хлориду на показники протеїназно-інгібіторної системи у щурів за умови гострого алкогольного отруєння на тлі інтоксикації солями кадмію та свинцю / І. Криницька, І. Бекус, М. Чорна // XІІ Міжнародний медичний конгрес студентів і молодих вчених, 31 бер. -2 квіт. 2008 р.: тези доп. - Тернопіль, 2008. - С. 177. (Здобувач здійснила статистичну обробку результатів експериментальних досліджень, брала участь в підготовці роботи до друку).

8. Чорна М.В. Вплив хлориду кобальту на генерацію гідроксильного радикала та стан антиоксидантної системи у тварин / М.В. Чорна, І.Р. Бекус, Н.А. Василишин // Здобутки клінічної і експериментальної медицини: підсумкова науково-практична конф., 13 черв. 2008 р.: тези доп. - Тернопіль: Укрмедкнига, 2008. - С. 132. (Дисертант виконала всю експериментальну частину роботи, здійснила статистичну обробку та узагальнення результатів).

9. Чорна М.В. Вплив хлориду кадмію на формування оксидативного стресу у щурів / М.В. Чорна, М.І. Куліцька, І.Р. Бекус // Здобутки клінічної і експериментальної медицини: Актуальні питання патології за умов дії надзвичайних факторів на організм: І науково-практична конф., 6-7 лист. 2008 р.: тези доп. - 2008. - № 2. - С. 160. (Здобувач провела всі експериментальні дослідження, підготувала тези до друку).

10. Чорна М. Корекція тирозинатом цинку та ентеросорбентом "Фібрабет" вільнорадикальних порушень в організмі щурів з кадмій-кобальтовою інтоксикацією / М. Чорна, М. Куліцька, І. Бекус // XІІІ Міжнародний медичний конгрес студентів і молодих вчених, 27-28 квіт. 2009 р.: тези доп. - Тернопіль, 2009. - С. 169. (Дисертант виконала всю експериментальну частину роботи, здійснила статистичну обробку та узагальнення результатів).

11. Чорна М.В. Застосування тирозинату цинку з метою корекції деяких показників антиоксидантної системи у щурів, уражених солями кадмію та кобальту / М.В. Чорна, Я.І. Гонський, І.Р. Бекус // Здобутки клінічної і експериментальної медицини: підсумкова науково-практична конф., 4 черв. 2009 р.: тези доп. - Тернопіль: Укрмедкнига, 2009. - С. 150-151. (Автор провела всі експериментальні дослідження, систематизувала результати).

АНОТАЦІЯ

Чорна М.В. Вплив солей кадмію і кобальту на виникнення оксидативного стресу в білих щурів та корекція порушень металокомплексами й ентеросорбентом "Фібрабет". - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. Інститут біології тварин НААН України. - Львів, 2010.

Робота присвячена вивченню впливу солей кадмію та кобальту окремо та в комбінації на утворення активних форм кисню, вільнорадикальне окиснення ліпідів і білків та функціонування деяких ланок антиоксидантної системи, а також дослідженню цих процесів за умов корекції металокомплексом тирозинатом цинку та ентеросорбентом "Фібрабет".

Встановлено, що за комбінованої дії важких металів в організмі тварин утворення вільних радикалів відбувається інтенсивніше, ніж за дії кожного з них окремо. Кадмію та кобальту хлориди виступають активаторами ланцюгового пероксидного окиснення ліпідів і білків, а також розбалансовують систему антиоксидантного захисту.

Використання тирозинату цинку з метою корекції зазначених метаболічних порушень сприяє зменшенню утворення радикалів, пригніченню вільнорадикального окиснення ліпідів та білків, а також відновленню активності антиоксидантних ферментів. Поєднана дія тирозинату цинку й ентеросорбенту "Фібрабет" призводить до ефективнішого зменшення продукції вільних радикалів, показників ліпопероксидації та окиснювальної модифікації білків.

Ключові слова: активні форми кисню, вільнорадикальне окиснення ліпідів і білків, антиоксидантна система, кадмію хлорид, кобальту хлорид, тирозинат цинку, ентеросорбент "Фібрабет".

АННОТАЦИЯ

Чорная М.В. Влияние солей кадмия и кобальта на возникновение оксидативного стресса в белых крыс и коррекция нарушений металлокомплексами и энтеросорбентом "Фибрабет". - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. Институт биологии животных НААН Украины. - Львов, 2010.

Работа посвящена изучению влияния солей кадмия и кобальта изолированно и в комбинации на образование активных форм кислорода, свободнорадикальное окисление липидов и белков, состояние некоторых звеньев антиоксидантной системы, а также исследованию этих процессов при коррекции металлокомплексом тирозинатом цинка и энтеросорбентом "Фибрабет".

Обнаружено, что при комбинированном действии кадмия и кобальта хлоридов в организме животных происходит более интенсивное образование свободных радикалов, чем при действии каждого из них отдельно, о чем свидетельствует повышение продукции супероксид-анион радикала, гидроксильного радикала и концентрации перекиси водорода. Показано, что интоксикация тяжелыми металлами приводит к активации фосфолипазы А ₂ и снижению активности цитохромоксидазы. Кадмия и кобальта хлориды выступают активаторами цепного пероксидного окисления липидов и белков, что подтверждается повышенной концентрацией диеновых конъюгатов, ТБК-активных продуктов, а также содержанием альдегидо- и кетонопроизводных белков нейтрального и основного характера. При кадмий-кобальтовой интоксикации происходит разбалансирование функционирования системы антиоксидантной защиты, которое сопровождается ингибированием активности супероксиддисмутазы и снижением концентрации мочевой кислоты.

С целью коррекции процессов образования свободных радикалов были использованы преднизолон и синтезированные нами металлокомплексы: тирозинат меди, тирозинат цинка, гистидинат цинка и глутамат магния с витамином В ₆. За способностью подавлять активированные токсикантами свободнорадикальные реакции примененные вещества можно разместить в ряд: тирозинат цинка > тирозинат меди > глутамат магния с витамином В ₆ > гистидинат цинка > преднизолон. Тирозинат цинка как самое эффективное корригирующее средство использовано для последующего изучения.

Применение металлокомплекса привело к снижению активности фосфолипазы А ₂, процессов липопероксидации и свободнорадикального окисления белков. Также наблюдалась тенденция к возобновлению активности супероксиддисмутазы, цитохромоксидазы и содержания мочевой кислоты.

Результаты исследований показали, что дополнительное применение энтеросорбции более эффективно снижает образование активных форм кислорода, чем введение только тирозината цинка. Но даже при применении двух способов коррекции продукция свободных радикалов не достигала уровня интактных животных. Использование тирозината цинка и энтеросорбента "Фибрабет" у животных с комбинированным поражением кадмия и кобальта хлоридами способствовало нормализации процессов липопероксидации, но большее положительное действие отмечено на процессы окисления белков. Примененные корригирующие средства имели также эффективное влияние на ферментативное и неферментативное звенья антиоксидантной системы, что сопровождалось повышением активности супероксиддисмутазы и концентрации мочевой кислоты.

Результаты проведенных исследований расширяют и углубляют существующие представления о механизмах токсичного влияния кадмия и кобальта на организм и открывают пути для совершенствования методов диагностики и коррекции отравлений организма тяжелыми металлами с помощью энтеросорбентов и металлокомплексов с антиоксидантными свойствами.

Ключевые слова: активные формы кислорода, свободнорадикальное окисление липидов и белков, антиоксидантная система, кадмия хлорид, кобальта хлорид, тирозинат цинка, энтеросорбент "Фибрабет".

SUMMARY

Chorna M.V. The influence of cadmium and cobalt salts on origin of oxidative stress for white rats and correction of violations of metal complex and enterosorbent "Fibrabet". - Manuscript.

The dissertation for obtaining the scientific degree of a candidate of biologic science by specialty 03.00.04 - biochemistry. Institute of Animal Biology NAAS of Ukraine. - Lviv, 2010.

This scientific work is devoted to researching influence of cadmium and cobalt salts, both isolated and in combination, on the generation of oxygen active forms, free radical oxidation of lipids and proteins and state of some links of antioxidant system, and also to researching of these processes and their correction by metal complex of zinc tyrosinate and enterosorbent "Fibrabet".

It was determined that combinated influence of heavy metals in the animals' organisms more intensive radical formation, than for actions each of them separately. It was determined that intoxication by xenobiotics causes activation of prooxidant enzyme phospholipase A₂ and inhibition of oxidized enzyme cytochromoxidase activity. Cadmium and cobalt chlorides are activators of chain peroxide oxidation of lipids and proteins, and also violate the functioning of antioxidant protection system.

The usage metal complex of zinc tyrosinate with the purpose of correction of the noted biochemical violations, promotes the decreasing of radical formation, free radical of lipids and proteins oxidation and proceeding oxidized and antioxidant enzymes activity. The combination of zinc tyrosinate and enterosorbent "Fibrabet" influence causes more effective positive changes in the intoxicated organism.

Key words: oxygen active forms, free radical oxidation of lipids and proteins, antioxidant system, cadmium chloride, cobalt chloride, zinc tyrosinate, enterosorbent "Fibrabet".

Размещено на Allbest.ru