Методи фарбування бактеріальних спор і капсул

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство освіти і науки України

Одеський національний політехнічний університет

Хіміко-технологічний факультет

Кафедра органічних і фармацевтичних технологій

Практична робота

за темою: «Методи фарбування бактеріальних спор і капсул»

з курсу: «Хімічна мікробіологія»

Виконав: Дідик Д.О.

Керівник: Декіна С.С.

Одеса 2014

Зміст

1. Капсула і її характеристика

2. Фарбування бактеріальних капсул

а) Фарбування по методу Романовського - Гімза

б) Фарбування по методу Мухіна

в) Фарбування по методу Буррі-Гінса

г) Фарбування розчином сафроніна (метод Ольта)

в) Фарбування методом Ребігера

3. Спори і їх характеристика

4. Фарбування бактеріальних спор

а) Фарбування по методу Пєшкова

б) Фарбування по методу Ожешко

в) Фарбування по методу Міллера

г) Забарвлення малахітовим зеленим Шеффера-Фултона

д) Фарбування по методу Бітгера

Використана література

1. Капсула і її характеристика

У багатьох бактерій із зовнішнього боку клітинної стінки розташований дифузний гомогенний слизовий шар різної товщини. Цей шар можливо виявити при певних способах фарбування або відповідному освітленні.

Капсулою називають шар, який зберігає тісний зв'язок з клітинною стінкою і служить зовнішнім покривом клітини. Товщина капсул у бактерій різна: від 0,1 мікрометрів до 10 мкм. Капсулу величиною менше 0,2 мкм часто називають мікрокапсули. Поверхневі структури типу капсул описані у пневмококів, збудників сибірки, гонореї, групи капсульних бактерій.

У багатьох видів бактерій капсула з'являється лише при визначених умовах, часто несприятливих. Збудники сибірської виразки, кашлюку, гонореї, пневмококи утворюють капсулу, потрапляючи в організм людини або тварини. У цьому випадку капсула виконує захисну роль, оберігаючи мікроб від дії антитіл, фагоцитів та інших захисних факторів організму.

Група капсульних бактерій зберігає капсулу постійно: і в організмі людини, і при її культивуванні на живильних середовищах. Хімічний склад капсул залежить від виду бактерій. Основними компонентами капсули є вода (до 98 %) і полісахариди. Захисні функції капсули різноманітні. Крім запобігання мікроба від дії захисних факторів макроорганізму, капсула захищає мікроб від припливу в клітку великої кількості рідини (осмотичний бар'єр), а також від висихання при несприятливих умовах середовища[1].

бактеріальний спора капсула фарбування

2. Фарбування бактеріальних капсул

Капсули при звичайних методах фарбування залишаються безбарвними. Це дозволяє застосовувати прості методи фарбування для виявлення капсул мікроорганізмів в мазках з органів і тканинної рідини. Наприклад, при фарбуванні метиленовим синім тканини і клітини бактерій фарбуються у блакитний колір, а навколо бактерій зберігається безбарвна зона - капсула.

а) Фарбування по методу Романовського-Гімза

Фіксований в етиловому спирті мазок, кладуть у чашку Петрі мазком донизу на підставки з склянки і соломки або сірників і наливають робочий розчин фарби Романовського-Гімза (15-20 крапель на 10 мл води). Через 15-20 хв препарат промивають водою і висушують на повітрі. Бактерії забарвлюються в темно-синій колір, капсули - в рожевий. Використовується світловий мікроскоп[2].

б) Фарбування по методу Мухіна

Фіксований препарат фарбують протягом 6-7 хв. 1%-м розчином метиленової синьки з легким підігрівом над полум'ям горілки (до появи пару). Легко промивають водою, швидко просушують фільтрувальним папером і мікроскопують. Капсула - рожева, бактеріальна клітина - синя.

в) Фарбування методом Буррі-Гінсу

Мікропрепарат з культури клебсиєлл для виявлення у них капсули можна забарвити за методом Буррі - Гінса:

1. На чисте предметне скло наноситься невелика крапля чорної туші і крапля суспензії добової агарової культури капсульних бактерій. Суміш обережно перемішується петлею, після чого іншим предметним склом робиться мазок, подібно мазку крові.

2. Після підсушування на повітрі і фіксації в полум'ї спиртівки препарат дофарбовували протягом 2 - 3 хвилин карболовым фуксином Ціля, розведеним дистильованою водою 1:1.

3. По закінченні препарат обережно промивається струменем холодної води, висушується і мікроскопують. На темному тушевому тлі будуть видимі пофарбовані мікробні клітини оточені безбарвною капсулою. При відсутності капсули, до клітки пофарбованої фуксином, чорний фон примикає впритул.

г) Фарбування розчином сафраніну (метод Ольта)

Фарбування розчином сафраніну (метод Ольта). Фіксований мазок фарбують 2%-м розчином сафраніну з підігрівом до утворення пари, фарбують 3-4 хв. Промивають водою, швидко просушують фільтрувальним папером, мікроскопують. Капсула - жовта, мікробна клітина - темно-червона. Розчин сафраніну готують перед використанням.

д) Фарбування по методу Ребігера

Мазки фарбують і фіксують одночасно. Готують розчин: 15-20 г генціанвіолету розчиняють у 100 смі 40%-го розчину формаліну. Розчин витримують 8-10 годин при температурі 20 ?С і фільтрують. Фарбують нефіксовані мазки протягом 15-20 сек., швидко промивають водою і висушують фільтрувальним папером. Капсули фіолетово-рожеві, бактерії темнофіолетові[3].

3. Спори та їх характеристика

Багато видів бактерій володіють здатністю спорооутворення, яка полягає в тому, що при настанні умов, несприятливих для життя, клітина змінює свою структуру, об'єм і форму, часто також втрачає воду.

Найвідомішим та найбільш пристосованим до екстремальних умов типом бактеріальних спор є ендоспори, що формуются всередині клітини деякими представниками типу Firmicutes, наприклад, грам-позитивними Bacillus, Anaerobacter, Heliobacterium та Clostridium. Майже в усіх випадках формується одна ендоспора, тобто це не є процесом розмноження, хоча Anaerobacter може формувати до семи ендоспор на клітину. Ендоспори мають центральне ядро, складене з цитоплазми що містить ДНК та рибосоми, оточене шаром шкірки і захищене непроникною і жорсткою оболонкою. Ендоспори не показують ніякого метаболізму і можуть витримати екстремальний фізико-хімічний тиск, наприклад високі рівні ультрафіолетового випромінювання, гамма-випромінювання, детергентів, дезинфікуючих засобів, нагрівання, тиску і висушування. У такому неактивному стані ці організми, у деяких випадках, можуть залишатися життєздатними протягом мільйонів років та виживати навіть у космічному просторі.

Інші види бактерії формують різні типи і форми спор, так метан-окислюючі бактерії роду Methylosinus формують так звані екзоспори, названі так тому, що вони формуються брунькуванням на кінці клітини. Інші типи спор, так звані «цисти», утворюються членами родів Azotobacter, Bdellovibrio (бделоцисти), і Myxococcus (міксоспори). Вони стійкі до висушування та інших шкідливих умов, але меншою мірою, ніж ендопори. Нитчасті Actinobacteria формують відтворюючі спори двох категорій: кондіціоспори, які є ланцюжками спор, сформованих з міцелієподібник ниток, та спорангієспори, які формуються в спеціалізованих мішечках, спорангіях. Часом у вигляді спор ефективніше проходить розселення, тому що частково зневоднена клітка має меншу масу і може розноситися вітром або тваринами у висушеному стані. Деякі спори, такі як міскоспори, формуються у вигляді плодових тіл, що містять багато тисяч спор, що переносяться птахами і служать для поширення бактерії на нові території [4].

4. Фарбування бактеріальних спор

Для фарбування спор, що при звичайних методах забарвлення мають вигляд нефарбованих пустот, застосовують протрави: кислоти і луги. Вони розпушують щільну оболонку спори і полегшують проникнення через неї фарби. Забарвлені спори володіють кислотостійкістю і не знебарвлюються під дією кислоти на відміну від вегетативного тіла мікробної клітини. Тому принцип забарвлення спор і кислотостійких бактерій однаковий.

а) Фарбування методом Пєшкова

(Для ендоспор)

Висушений препарат з культури грампозитивних бактерій фіксують в рідині Карнуа протягом 15 хвилин, потім промивають водою, наливають метиленовий синій за Леффлером і нагрівають до появи парів, кип'ятять 15-20 хвилин, після охолодження препарат промивають і дофарбовують 0,5 % водним розчином нейтрального червоного або фуксину за Пфейфером 30-60 секунд. Висушують за допомогою фільтрувального паперу і мікроскопують.

В результаті, зрілі ендоспори фарбуються у блакитний колір, молоді - в темно-синій, цитоплазма червона, зерна хроматину забарвлюються у фіолетовий колір.

б) Фарбування по методу Ожешко

Цей метод служить для виявлення бактеріадьних спор. Спори мають вигляд круглої або овальної форми утворень, які знаходяться в тілі мікробної клітини. Розрізняють три види розташування спор по відношенню до довгої осі палички: центральне - спору знаходиться в центрі тіла мікроба, субтермінальне - спора розташована ближче до одного з її кінців, термінальне - спору розташовується на кінці палички.

1. На висушений нефіксований мазок наливають 0,5% розчин хлористоводневої кислоти і підігрівають 1-2 хв над полум'ям спиртівки до закипання.

2. Остиглий препарат промивають водою, висушують і фіксують над полум'ям спиртівки.

3. Потім мазок наносять розчин фуксину Циля і нагрівають над полум'ям спиртівки до відходження парів.

4. Після того як препарат охолоне, знебарвлюють його 5% розчином сірчаної кислоти, промивають водою і дофарбовують метиленовим синім протягом 3-5 хв, потім промивають водою і підсушують. Спори, пофарбовані фуксином мають червоний колір, тіло мікробної клітини - синій колір.

в) Фарбування по методу Міллера

1. Фіксовані мазки поміщають на 2 хв. в хлороформ.

2. Переносять в 5% водний розчин хромової кислоти на 2 - 10 хв.

3. Промивають в проточній воді і забарвлюють карболовим фуксином 1 хв (скло при цьому підігрівають на спиртівці до появи парів).

4.Диференціюють в 5% сірчаної кислоті 5 с.

5. Добре промивають в проточній воді і підфарбовують водним розчином метиленового синього 3 хв.

6. Промивають в проточній воді, сушать і вивчають при імерсії.

Результат: спори забарвлюються в червоний колір, бактерії - в синій.

г) Забарвлення малахітовим зеленим Шеффера-Фултона

1. Мазки, фіксовані над вогнем, забарвлюють 5% водним розчином малахітового зеленого 5-10 хв.

2. Промивають в проточній воді.

3. Дофарбовуючи 1% водним розчином сафраніну 30 с.

4. Промивають водою, сушать і вивчають при масляній імерсії.

Результат: спори забарвлюються в зелений колір, бактерії - в червоний.

д) Фарбування по методу Бітгера

Нефіксований мазок обробляють 10% формаліном 10 хв, промивають проточною водою і висушують. Забарвлюють 3 хв аміачним метиленовим синім (20 мл насиченого спиртового розчину метиленового синього + 3 мл 98% розчину аміаку + 80 мл дистильованої води), нагріваючи скло над вогнем до закіпання барвника. Промивають проточною водою, дофарбовують 0,5% розчином сафраніну 3-5 хв, промивають водою, висушують і вивчають при масляній імерсії.

Результат: бактерії червоні, суперечки сині.[5]

Використана література

1. Безруков А. В. Окраска по Романовскому: к вопросу о приоритете / К 120-й годовщине открытия эффекта Романовского. - 12 с. [2]

2. Балаклiець Н.I., Циганенко А.Я., Мiнухiн В.В. - Загальна мiкробiологiя. Харкiв, 2002. [4]

3. Барыкина Р. П. и др. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. -- М.: Изд-во МГУ, 2004. -- 312 с. -- 2000 экз. -- ISBN 5-211-06103-9. -- УДК58:57.08 [3]

4. Малая медицинская энциклопедия. -- М.: Медицинская энциклопедия. 1991--96 гг. 2. Первая медицинская помощь. -- М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г. 3. Энциклопедический словарь медицинских терминов. -- М.: Советская энциклопедия. -- 1982--1984 гг. [5]

5.Мікробіологія. Бактерії. http://microbiology.ucoz.org/index/bakterii/0-11 [1]

Размещено на Allbest.ru