Визначення амілолітичної (декстринуючої) активності

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство освіти і науки України

Національний університет харчових технологій

Кафедра біохімії та екологічно контролю

Науково-дослідна робота

"Визначення амілолітичної (декстринуючої) активності"

Підготувала Ляшенко М.В.

Перевірив Береза Л.В.

Київ 2014 р.

Вступ

Виробництво ферментів займає одне з провідних місць у сучасній біотехнології та належить до галузей промисловості, об'єм продукції яких інтенсивно зростає, а сфера застосування постійно розширюється. Такий швидкий розвиток пов'язаний з тим, що ферменти є високоактивними, нетоксичними біокаталізаторами білкового походження, без яких неможливе здійснення багатьох біохімічних процесів та життя в цілому.

Пізнання ролі ферментів для всього живого на Землі стало основою для становлення та розвитку технології ферментних препаратів як науки та для створення промислового виробництва ряду ферментних препаратів. Власне їх застосування допомогло суттєво змінити, інтенсифікувати та вдосконалити існуючі технології, а також створити нові високоефективні процеси. Застосування ферментних препаратів різного ступеня чистоти дозволило не лише покращити показники багатьох біотехнологічних процесів, але й вдосконалити виробництво кормів, зробити ефективнішою дію синтетичних миючих засобів, покращити якість косметичних препаратів, створити ряд специфічних, чутливих та точних аналітичних методів, налагодити виробництво лікарських і профілактичних засобів для медичної промисловості.

Характеристика

Амілолітичні ферменти об'єднують велику групу ферментів, які здійснюють гідроліз переважно б-(1,4)-Глікозидних зв'язків амілози, амілопектину, глікогену та інших мальтоолігосахаридів. До групи амілолітичних ферментів відносяться наведені нижче і деякі інші ферменти:

КФ 3.2.1.1 б-амілаза

КФ 3.2.1.2 в-амілаза

КФ 3.2.1.3 Глюкоамілаза

КФ 3.2.1.41 Пуллуланаза

КФ 3.2.1.68 Ізоамілаза

КФ 3.2.1.20 б-глюкозидази

КФ 3.2.1.11 Декстраназа

КФ 2.4.1.19 Амілаза Bacillus macerans (циклодекстроглюканотрансфераза)

Амілази бувають двох типів: ендо-і екзоамілази. Чітко вираженої ендоамілазою є б-амілаза, здатна до розриву внутрішньомолекулярних зв'язків у полімерних ланцюгах субстрату. Глюкоамілаза і в-амілаза є екзоамілазами, тобто ферментами, що атакують субстрат з нередукуючого кінця.

Субстратами для дії амілаз є крохмаль, що складається з амілози і амілопектину, продукти часткового гідролізу крохмалю і глікоген. Крохмаль - рослинний полісахарид з дуже складною будовою, що складається з 13-30% амілози і 70-85% амілопектину. Обидва компоненти неоднорідні, їх молекулярна маса (М. м.) коливається в широких межах і залежить від природи крохмалю. Амілоза - це необертающийся полімер, в якому залишки глюкози Сполучених б-1,4-Глікозидний зв'язком; ступінь полімеризації близько 2000. У "аномальних" амілози з однією-двома б-1,6-зв'язками полімеризація може зрости до 6000. Амілоза практично не має відновлюючої здатності, тому.

Всі роди і види мікроскопічних грибів характеризуються нитковидною будовою тіла і специфічною будовою плодоносних органів.

Класифікація ферменту б-амілаза (1,4-б-D-глюканглюканогідролаза) є ендоамілазою, що викликає гідролітичні розщеплення б-1,4-глікозидних зв'язків всередині полімерного субстрату. Це водорозчинний білок, що має властивості глобуліну і має молекулярну масу 45-60 кДа. Всі б-амілази відносяться до металоензимів, вміст у них Са коливається від 1 до 30 г-атом / 1 г-моль ферменту. Повне видалення Са приводить до інактивації ферменту. Глутамінова і аспарагінова кислоти становлять 25 мас. % Від маси білка. Залежно від виду мікроорганізму властивості б-амілаз можуть сильно відрізнятися не тільки за механізмом дії на субстрат і по кінцевим продуктам, але і за оптимальними умовами для прояву максимальної активності. Присутність в промислових препаратах протеїназ знижує каталітичну активність б-амілази. У результаті впливу б-амілази на перших стадіях в гідролізаті накопичуються декстрини, потім з'являються тетра- і тримальтоза, що не зафарбовуються йодом і які дуже повільно гідролізуються б-амілазою до ди- і моносахаридів[5]

Механізм дії б-амілази[2]

в-амілаза (в -1,4-глюкан мальтогідролаза, КФ 3.2.1.2) - активний білок, що володіє влатсивостями альбуміну. Каталітичний центр ферменту має сульфгідрильні і карбоксильні групи і імідозольний цикл залишків гістидину. в-Амілаза -екзофермент кінцевої дії, що виявляє спорідненість до передостаннього в -1,4-зв'язку з нередукуючого кінця лінійного ділянки амілози і амілопектину.

На відміну від б-амілази в-амілаза практично не гідролізують нативний крохмаль, тоді як клейстеризований крохмаль гідролізуєтся нею з утворенням мальтози в-конфігурації. Якщо гідролізу піддається амілоза, то гідроліз йде повністю до мальтози. Незначна кількість декстринів може здіснюватися при гідролізі "аномальної" амілози, тому що гідроліз в-амілазою йде тільки по лінійній ланцюга до б -1,6-зв'язків. Якщо субстратом для в-амілази служить амілопектин, то гідроліз йде в значно меншому ступені. в-Амілаза відщеплює фрагмент з нередукуючим кінцем ділянки від зовнішніх лінійних гілок, які мають по 20-26 глюкозних залишків, з утворенням 10-12 молекул мальтози. Гідроліз призупиняється на передостанній б -1,4-зв'язку, що межує з б -1,6-зв'язком. У гідролізаті накопичується 54-58% мальтози, решту становлять високомолекулярні декстрини, що містять значну кількість б -1,6-зв'язків - так звані в -декстрини.

в-амілази виявляють більшу стабільність у відсутність іонів Са 2+. Молекулярна маса в-амілази рослин досить висока, вона складає від 50000 до 200000. Фермент може складатися з однієї або чотирьох субодиниць до 50 000 кожна. Фермент містить SH-групи та чутливий до дії важких металів. Вважається, що (в-амілазу має високу здатність до нескінченої атаки субстрату. Для амілози середньої молекулярні маси в одному при з'єднанні ферменту до субстрату можливо відчеплення до чотирьох залишків мальтози. При збільшенні молекулярної маси субстрату можлива і більша кількість місць атаки.

Принциповий механізм дії в-амілази[2]

Глюкоамілаза (1,4-б-D-глюканглюкогідролаза) широко расрозлогий в природі. Вона синтезується багатьма мікроорганізмами і утворюється в тканинах тварин. У літературі фермент відомий під різними назвами: амілоглюкозідаза, г-амілаза, лізосомальних б-глюкозидази, кисла мальтаза, матулаза, екзо-б-1,4-глюкозидази. Глюкоамілаза каталізує послідовне відщеплення кінцевих залишків б-D-глюкози з нередуцірующих решт субстрату. Цей фермент проявляє екзогенний механізм впливу на субстрат. Багато глюкоамілази володіють також здатністю гідролізувати б-1,6-глюкозідние зв'язку. Однак це відбувається в тому випадку, коли за б-1,6-зв'язком слід б-1,4-зв'язок, тому декстран ними не гідролізується. Глюкоамілаза значно швидше гідролізують полімерний субстрат, ніж оліго-і дисахариди. Майже всі глюкоамілази є глікопротеїдів, що містять від 5 до 35% вуглеводів, які складаються з оліго-, ди- і моносахаридів.

Майже всі глюкоамілази є глікопротеїдів, що містять від 5 до 35% вуглеводів, які складаються з оліго-, ди-і моносахаридів. Угле ¬ водний компонент може бути цілісним фрагментом або ж розбитими на індивідуальні сполуки, які прикріплюються до білка через треонін і серин. Наприклад, у глюкоамілази A. niger їх 20. Більшість відомих глюкоамілаз має оптимум при рН 4,5-5,2, рідше - при 5,7-6,0, в основному для дріжджових глюкоамілаз[8].

Принциповий механізм дії глюкоамілази

Просторова структура глюкоамілази

Діючи на ціле крохмальне зерно, альфа - амілаза атакує його, розпушуючи його поверхню і утворюючи канали і борозенки, як би розколюючи зерно на частини. Клейстерізованний крохмаль гідролізується нею з утворенням неокрашиваємих йодом продуктів - в основному низькомолекулярних декстринів.

Ферменти - та -амілази гідролізують лише зв'язки 1 - 4. Фермент -амілаза діє на крохмаль невпорядковано, розщеплюючи зв'язки незалежно від місця їх розташування в молекулі, -амілаза діє на кожен другий зв'язок з боків вільних кінців молекули, утворюючи мальтозу, але в амілопектині дія її розповсюджується лише до розгалужень молекули. В результаті утворюються мальтоза та крупні декстрини (-декстрини). Якщо в середовищі присутня і -амілаза, то вона розщепляє крупні декстрини, забезпечуючи можливість подальшої дії -амілази. Присутність -амілази посилює активність -амілази. Отже, активність двох амілаз при їх спільній дії вище суми активностей кожної з них окремо, тобто тут має місце синергічна дія двох амілаз.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Розрізняються - та -амілази і чутливістю до температури та реакції середовища.

-амілаза більш стійка до підвищеної температури, але чутлива до підкислення рН середовища. Це використовується в хлібопекарській промисловості, де продукти дії -амілази - низькомолекулярні декстрини - знижують якість хліба.

Оскільки у пророслому зерні пшениці та жита міститься активна -амілаза, то в процесі бродіння тіста, яке замісили з борошна пророслого зерна, накопичується значна кількість декстринів, що надають хлібу низьку еластичність, недостатню пористість, неприємний смак. Оскільки -амілаза чутлива до зниження кислотності, то тісто замішують на рідких дріжджах або молочнокислих заквасках. Це забезпечує накопичення в тісті підвищеної кількості молочної кислоти, що пригнічує дію -амілази.

Але амілаза має і позитивне значення у хлібопекарській, пивоварній, спиртовій, текстильній промисловості. Бродіння тіста та накопичення в ньому СО 2, що розрихлює його та надає хлібу рівномірну пористість та об'єм, залежать від присутності у тісті зброджених дріжджами цукрів, що, в свою чергу, залежить від швидкості накопичення мальтози під впливом амілази на крохмаль. Хоча надто енергійна дія -амілази пророслого зерна погіршує якість хліба.

Солод, що застосовується при виготовленні пива та оцукрюванню заторів у спиртовій промисловості, є джерелом активної амілази, що каталізує перетворення крохмалю в мальтозу.

При спільній дії - та -амілаз крохмаль гідролізується на 85 - 95 %. Негідролізований крохмаль представляє собою залишки із зв'язками 1 - 6 і так звані аномальні структури, на які не діють ці ферменти. Розщеплення зв'язків 1 - 6 здійснює фермент оліго-1,6-глюкозидаза та амілопектин-1,6-глюкозидаза.

Механізм дії

Одиниці активності

Активність виражають в каталах. Катал - це каталітична активність, яка здійснює хімічне перетворення 1 моля субстрату за 1 с. Частіше виражають активність в частках каталу (мілікаталах - мл-кат, мікрокаталах - мк-кат.).

Так, якщо активність ферменту становить 2 мк-кат, це значить, що у пробі міститься така кількість ферменту, яка може здійснити перетворення 2 мкмоль субстрату за 1 с.

Число одиниць ферменту, яка припадає на 1 мг білка ферментного препарату, називається питомою активністю.

Молекулярна активність - це кількість молекул субстрату, яка перетворюється за 1 хв однією молекулою ферменту.

Активність у каталах використовують для порівняння активності різних препаратів одного й того ж ферменту, а для порівняння активності різних ферментів використовують молекулярну активність.

В харчовій промисловості використовують свої одиниці активності, активність називають здатністю: амілолітична здатність (така кількість ферменту, яка каталізує розщеплення 1 г розчинного крохмалю до декстринів, які не забарвлюються йодом за 1 год при 300С), протеолітична активність(кількість ферменту, необхідна для утворення 1 мг амінного азоту з білка за 1 годину) тощо.

Промислове одержання

До розвитку ферментної промисловості головним промисловим джерелом отримання амілаз в європейських країнах було проросле зерно (солод). Для медичних цілей амілази отримували з тваринної сировини. В даний час головним джерелом амілаз є прокаріоти, особливо бактерії, гриби і найрідше дріжджі. фермент біотехнологія глюкоамілаз

Серед бактеріальної мікрофлори найбільш ефективними продуцентами є такі мікроорганізми: Вас. subtilis, Вас. diastaticus, Вас. mesentericus, Вас. macerans і Вас. polymycus та ін.

Особливість застосування бактерій у виробництві - їх здатність утворювати високоактивну термостійку б-амілазу. Для розрідження крохмалю також застосовуються амілолітичні препарати, що містять б-амілазу: б-амілаза гідролізує внутрішні альфа-1,4-глікозидні зв'язки крохмалю, приводячи до швидкого зниження в'язкості клейстеризованих розчинів крохмалю, тим самим забезпечуючи підготовку сусла до дії глюкоамілази. Кінцевими продуктами дії бактеріальної альфа-амілази на крохмаль є низькомолекулярні розчинні декстрини з невеликим змістом моно-і дисахаридів (глюкози і мальтози).

Відомо більше 100 видів дріжджів, які добре ростуть на крохмалі як на єдиному джерелі вуглецю. Серед них особливо виділяються два види, які утворюють як глюкоамілази, так і в-амілази, ростуть на крохмалі з високим економічним коефіцієнтом і можуть не тільки асимілювати, але і зброджувати крохмаль: Schwanniomyces occidentalis і Saccharomycopsis fibuliger. Обидва види - перспективні продуценти амілолітичних ферментів на крохмалевмісних відходах.

Для отримання амілаз широко застосовують мікроскопічні гриби роду Aspergillus, видів: niger, oryzae, usamii, awamori, batatae, роду Rhizopus, видів: delemar, tonkinensis, niveus, japonicum та ін, А також окремі штами Neurospora grassa і Mucor.

Мікроскопічні гриби дуже широко поширені в природі; основне місце їх проживання - грунт.

Всі роди і види мікроскопічних грибів характеризуються нитковидною будовою тіла і специфічною будовою плодоносних органів.

Вик амілази в харчовій промисловості

У виробництві спирту Як основний ферментовмісний матеріал раніше застосовували солод, який від початку виникнення спиртової промисловості використовували для оцукрювання крохмалю сировини і який з успіхом було замінено на культури мікро-міцетів з активним амілолітичним комплексом ферментів [43]. Застосування у процесі виробництва спирту грибної амілази замість солоду дозволяє: а) зекономити десятки тисяч тонн високоякісного зерна; б) підвищити вихід спирту; в) різко скоротити в часі процес одержання ферментного препарату. Як відомо, для одержання активного зернового солоду потрібно 7-8 діб, для вирощування ж культури гриба й отримання з неї препарату ферменту - кілька десятків годин; г) зменшити кількість виробничих площ, а також усіх видів енергії.

У пивоварінні Амілази використовують замість зернового солоду. Смакові якості пива при цьому практично не змінюються. Для застосування у пивоварінні найбільш придатними є ферменти грибного походження (A. Oryzae), що дозволяє заощадити десятки тисяч тонн ячменю. Якщо у виробництві пива зменшити кількість солоду і збільшити кількість ферментного препарату до 4-5%, то можна взагалі обійтися без солоду і з не-солодженої сировини одержати сусло, яке майже не відрізнятиметься від сусла, виготовленого із солоду. Якщо затір у процесі такого способу виробництва піддати гідротермічній обробці певного режиму, то він набуває смаку й аромату солоду.

Амілолітичні ферменти також використовують у Крохмале-патоковій промисловості Для виготовлення глюкозної і мальтозної патоки [43]. У цьому разі застосування амілаз різноманітне. Насамперед, за їхньою участю може бути отримана розчинна форма крохмалю. За допомогою бактеріальних і рослинних амілаз вдається одержати мальтозну і глюкозну патоки, зокрема з кукурудзяного і маїсового борошна, а також чисту глюкозу. Різні види паток використовують головним чином у кондитерському виробництві, де вони перешкоджають кристалізації сахарози і лактози, поліпшують консистенцію виробів і збільшують терміни їх зберігання, а також у виробництві морозива, консервованих фруктів і варення, безалкогольних напоїв, столових сиропів тощо.

У крохмале-патоковій промисловості ферментативний гідроліз має переваги перед кислотним завдяки ряду переваг, таких як специфічність реакції, стабільність продуктів, нижчі енергетичні потреби [44].

У хлібопекарській промисловості Амілолітичні ферментні препарати застосовують як біологічні поліпшувачі якості хліба: значно покращуються смак, аромат, забарвлення кірки, збільшується питомий об'єм, пористість, вміст цукру. Крім того, вони інтенсифікують біохімічні й мікробіологічні процеси, прискорюючи процес тістоведення. б-Амілазу А. оrуzae Додають у разі недостатнього вмісту амілаз у борошні. Амілаза гідролізує крохмаль тіста, а утворювана при цьому мальтоза слугує субстратом для пекарських дріжджів у процесі заквашування. Низька термостійкість б-амілазиА. оrуzae Має позитивне значення, дозволяє уникнути деградації м'якуша у процесі випікання.

У виробництві різних виробів із круп'яних продуктів Амілази застосовують для попереднього оброблення сировини, з якої виробляють харчовий продукт у вигляді пластівців чи зерен або круп'яних концентратів. Готові продукти після гідролізу набувають поліпшених смакових якостей, збагачуються розчинними цукрами, компоненти їх краще перетравлюються і засвоюються.

У виробництві овочепродуктів, зокрема пюре, супів, різних форм сушених овочів, крохмаль так само модифікують. Процес має ряд технологічних переваг: для супів і пюре - необхідне розрідження за збереження сухої речовини у продуктах; для сушених овочів - деяке прискорення процесу висушування. В усіх випадках повніше використовується сировина.

Відходи кондитерської промисловості Часто містять значні кількості крохмалю, особливо це стосується відходів виробництва цукерок. За допомогою бактеріальних і грибних амілаз можна виділити з них цукри і використовувати їх.

Дитяча їжа. На сьогодні в деяких країнах налагоджено випуск нових харчових продуктів, які попередньо оброблені ферментами. Так, під час виготовлення дитячої їжі крохмаль чи білки частково гідролізу-ють амілолітичними чи протеолітичними ферментами. Це значно полегшує перетравлення і засвоєння зазначених цінних речоОгляди

Хід роботи

Принцип методу ґрунтується на гідролізі 1,0 %-го буферного розчину крохмалю під впливом амілолітичних ферментів. Кінець реакції контролюють візуально за йодною пробою. За часом, протягом якого проходить розщеплення крохмалю до продуктів, що не забарвлюються йодом, визначається амілолітична активність препарату.

Хід роботи. У конічну колбу місткістю 50-100 мл вносять піпеткою 20 мл 1,0 %-го розчину крохмалю і занурюють у водяну баню з температурою 30°C (±0,2°C). Загальний об'єм реакційної суміші завжди має дорівнювати 30 мл, і якщо на аналіз беруть менше 10 мл ферментного розчину, то об'єм, якого не достає, доповнюємо дистильованою водою, яку приливають перед додаванням ферментного розчину.

Через 10 хв витримування в бані у колбу вносять ферментний розчин при ретельному перемішування і точно за секундоміром відмічають час. За початок реакції беруть час, коли з піпетки виллється половина вмісту. Через кожну хв.(або частіше) після початку реакції скляною паличкою відбирають краплину рідини і на білій порцеляновій пластинці з'єднують її з раніше нанесеною краплиною робочого розчину йоду.

Реакція розщеплення крохмалю вважається закінченою, коли йод перестане давати зміну забарвлення при з'єднанні з краплиною дослідної рідини (протягом перших 10 с).

Час, за який проходить розщеплення крохмалю до продуктів, що не забарвлюються йодом, можна встановити від 3 до 20 хв., але надійніші результати отримують у межах від 5 до 12 хв.

Примітка. Якщо час зникнення забарвлення менше 3 хв., то визначення повторюють з меншою кількістю розчину ферменту, наприклад - 2 мл. В цьому разі пробірку чи колбу з 20 мл крохмалю вносять 8 мл дистильованої води. Під час аналізу дуже активних препаратів концентрації розчинів роблять меншими (0,1 г в 200 або 500 мл).

Якщо час зникнення забарвлення становить більше 20 хв., то готують розчин більшої концентрації, наприклад 1:50 чи 1:100, а рідину можна не розбавляти зовсім.

У разі зникнення забарвлення з межах 3-5 хв. проби відбирають кожна 15 с; 5-10 хв. - кожні 30 с.; а понад 10 хв. - кожну хвилину.

Скляну паличку після кожної проби промивають дистильованою водою і витирають чистим некрохмаленим рушником.

Розрахунок АЗ проводять за формулою

Де 0,2 - кількість крохмалю в реакційній суміші, г; 60 - коефіцієнт перерахунку на 1 год; а - кількість ферментного препарату, введеного в реакційну суміш, грами повітряно-сухої речовини або мілілітри рідинних об'єктів; t - час, за який пройшло розщеплення крохмалю до нездатних забарвлюватися йодом продуктів, хв..; 1 - перерахунок на 1 г повітряно-сухого препарату або 1 мл розчину.

Висновок

З вище сказаного стає зрозумілим, що важливою ланкою на біотехнологічному ринку було є та буде виробництво ферментних препаратів. По даним досліджень об'єм російського та українського ринків ферментних препаратів на сьогоднішній день складає приблизно 50 млн доларів США. Здебільшого спрямування ринку йде на задоволення потреб спиртової галузі виробництв та кормового виробництва. Але також набирає обертів і потреба у ферментах в медичній та інших промисловостях. З кожним роком розвиток ринку досягається шляхом збільшення ефективності продукованих ферментів, розробка нових, більш дешевих методів виробництва, пошуку нових галузей використання готового продукту.

У науково-дослідних організаціях постійно проводиться робота з поліпшення ефективності виробництва ферментних препаратів, в основному по підвищенню активності, зрілої культури. Це досягається не тільки селекцією штамів мікроорганізмів, але і вдосконаленням умов культивування, в тому числі і зміною складу живильного середовища.

Тому, можна зробити висновок, що амілолітичні ферментні препарати з кожним роком стають все більш використовуваними.

Список використаної літератури

1. А.А. Анісімова. Основи біохімії: Підручник для студ. биол. спец. ун-тов/под ред. - М.: Выс. шк., 1986. - с.133-140

2. Галич И.П. Амилазы микроорганизмов. - Киев: Наук. думка, 1987. - 192 с.

3. Кретович В.Л. Биохимия растений: Учеб.-2-е узд., перераб. И доп; для биол. Спец. Ун-тов. - М.: Высш. Шк., 1986.-503 с., ил.

4. Матвеева И.В. Микроингредиенты и качество хлеба // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. - 2000. - №1. - с. 28-31.

5. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты: пер.англ.- М.: Мир, 1982.- т.1.- с. 370-375

6. Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. Биологическая химия: Учебник.- М.: Медицина, 1990.- 115с.

Размещено на Allbest.ru