Акт изучения антиоксидантного действия экстрактов Silene in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

Акт изучения антиоксидантного действия экстрактов Silene in vitro

Исполнители:

ст.лаборант Ниязова Д.Т.

к.м.н. Казбекова А.Т.

д.х.н.,профессор Сейтембетов Т.С.

Вступление

Целью работы явилось изучение антиоксидантного действия экстрактов Апсаthia igniaria (Spreng.) DС. (1), Silene cretaceae Fish. (2). Silene wolgensis (Нormen) Веss.ех Spreng. (3), Silene guntensis В. Feditsch. (4), Silene fruticulosa (Раll.) Schischk (5) методами определения железо-восстанавливающего потенциала FRАР - Ferric Reduciling Antioxidant Power assey, оценки антиоксидантной активности (АОА) с о-фенантролином и определение общего количества полифенольных соединений по способу Фолина- Чокальтеу.

Эксперименты in vitro были проведены по известным методикам определения антиоксидантного эффекта индивидуальных соединений и суммарных экстрактов.

1. Определение железо-восстанавливающего потенциала (FRАР - метод)

Реактивы.

1.1. Фосфатный буфер (рН 6,6)

Взято: 2,84 г Nа2НР04 в 100мл Н20 и 2,4 г NaН2Р04 в 100мл Н20

Для приготовления 50 мл фосфатного буфера (рН 6,6) надо взять:

18,75 мл р-ра Na2НР04 и 31,25 мл р-ра NaH2Р04

1.2. 1% раствор гексацианоферрата (III) калия

1.3. 10% раствор.трихлоруксусной кислоты

1.4. 0,1% раствор FeCl3

К 1 мл исследуемых экстрактов в диапазоне концентраций 0-1 мг/мл добавляется 2,5 мл 0,2 М фосфатного буфера (рН 6,6) и 2,5 мл 1% раствора гексацианоферрата (III) калия. Реакционная смесь инкубируется в течение 20 минут при 50°С, реакция останавливается добавлением 2,5 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты и смесь центрифугируют в течение 3 минут (1,5 тыс. оборотов/мин.). Затем 2,5 мл верхнего слоя смешивается с 2,5 мл дистиллированной воды и 0,5 мл 0,1% FeCl3. Измерение оптической плотности производится при 700 им в соответствии с работой Aswatha Ram H.N. et al. (2008). антиоксидантный реагент полифенольный соединение

Полученные результаты отражены на рис.1, из которого следует, что имеет место пропорциональная зависимость между величинами оптической плотности и концентрацией всех исследованных экстрактов. Этот факт указывает на наличие в экстрактах полифенольных соединений, причем, наименее выраженная АОА наблюдается для экстракта Апсаthia igniaria (1), а для Silene cretaceae (2), Silene wolgensis (3), Silene guntensis (4) и Silene fruticulosa (5) активность более выражена. В этом ряду экстрактов на основании данных FRАР - метода можно считать, что самая высокая АОА проявляется у экстракта Silene wolgensis (3).

Рисунок 1. Динамика изменения АОА, установленной с помощью FRАР - методики

2. Измерение антиоксидантной активности растительного сырья о - фенантролиновым методом

Приготовление комплексного реагента.

К 0,198 г о-фенантролина добавляют 30-40 мл дистиллированной воды и растворяют при слабом нагревании. Навеску 0,298 г железоаммонийных квасцов растворяют в 2 мл 1М НС1, прибавляют 30-40 мл дистиллированной воды и растворяют при слабом нагревании. Приготовленные растворы переносят в мерную колбу вместимостью 100мл и доводят полученный объем до метки дистиллированной водой. После приготовления полученный реактив выдерживают при комнатной температуре не менее 12 часов.

В мерную колбу объемом 25 мл добавляем исследуемое вещество (объем и концентрация по выбору). Затем добавляем 0,25 мл комплексного реактива, содержащего о-фенантролин. Доводим объем полученного раствора до метки дистиллированной водой. Через час прибавляют 0,5 мл 0,5М NaF и по истечении еще 30 мин. измеряем оптическую плотность при 490 нм относительно дистиллированной воды в соответствии с методикой Храпко Н.В. (2007). Контрольным раствором является рабочий раствор без анализируемого вещества.

Показателем АОА исследуемых экстрактов по данной методике является величина коэффициента ингибирования (КИ), которая находится по следующему уравнению:

К И = 1 - К контр / Кисслед

Как следует из рисунка 2 самый высокий показатель КИ проявляет экстракт Silene guntensis (4), а для экстракта Апсаthia igniaria (1) этот параметр при малых концентрациях имеет нулевое значение. В отличие от результатов РКАР - метода экстракт Silene wolgensis (3) проявил меньшую АОА (0,246). уступая данному показателю (0,4458) Silene guntensis (4).

Рисунок 2. Коэффициент ингибирования исследованных экстрактов.

Таблица 1. Величины КИ в исследованных экстрактах.

3. Определение полифенольных соединений по методу Фолина-Чокальтеу

Приготовление реактива Фолина-Чокальтеу и выполнение анализа.

5 г Na2WO4 2Н20 и 1,25 г Na2МоО4, 2H20 помещали в круглодонную колбу на 200 мл, приливали 35 мл воды и хорошо перемешивали. К полученному раствору добавляют 2,5 мл 85%-ного раствора фосфорной кислоты и 5 мл концентрированной НСl (х.ч.). Колбу присоединяли к обратному холодильнику и кипятили в течение 10 ч. Затем в раствор добавляли 7,5 г Li2S04 , 5 мл воды и одну каплю брома. Раствор перемешивали и нагревали до удаления брома. После охлаждения объем доводили водой до 50 мл, фильтровали и разводили водой до получения 1 н. раствора кислоты. Кислотность определяли титрованием разведенного реактива 0,1 н раствора NaOH в присутствии фенолфталеина.

В пробирке смешивали 5,0 мл водного раствора реактива Фолина-Чокальтеу, предварительно разбавленного в пропорции 1/10, добавляли 1,0 мл экстракта и 4,0 мл 7,5% раствора карбоната натрия. После выдерживания полученного раствора в течение 60 мин при комнатной температуре с помощью спектрофотометра РД-303 АРЕL (Япония) измеряют оптическую плотность растворов при 765 нм.

Содержание полифенольных соединений рассчитывали по эквиваленту рутина, тимола, галловой и протокатехиновой кислот (Таблица 2) на основании данных калибровочных кривых (Рисунок 3).

Рисунок 3. Калибровочные кривые стандартных образцов галловой (а) и протокатехиновой (б) кислот, тимола (в), рутина (г).

С целью изучения взаимосвязи между величинами АОА и уровнем полифенольных соединений, обуславливающих антиоксидантный эффект в перекисных процессах, выполнен анализ содержания полифенольных соединений по эквиваленту галловой и протокатехиновой кислот, рутина и тимола в исследованных экстрактах по известной методике с реактивом Фолина-Чокальтеу. Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2. Содержание полифенольных соединений по эквиваленту галловой и протокатехиновой кислот, рутина и тимола в исследованных экстрактах (метол Фолина-Чокальтеу).

На основании полученных данных можно сделать вывод, что в ряду исследованных объектов выраженной АОА in vitro обладают экстракты Silene wolgensis (3) и Silene guntensis (4), а наименьшая АОА свойственна Апсаthia igniaria (1). Анализ содержания полифенольных соединений по эквиваленту галловой и протокатехиновой кислот, рутина и тимола и исследованных экстрактах по методу Фолина-Чокальтеу не показал существенных различий по содержанию полифенолов в образцах, т.о. можно констатировать, что общий антиоксидантный эффект суммарного образца зависит от качественного состава экстракта. На основании выше изложенного считаем, что экстракт Silene wolgensis следует рассматривать в качестве потенциального антиоксиданта после установления качественного состава образца, а также рекомендуем его исследовать in vivo при отсутствии токсичности.

Размещено на Allbest.ru