Современные средства и методы экспериментальных исследований в пищевой промышленности

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерства образования и науки РФ

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования

Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики

Кафедра: микробиологические процессы в пищевой промышленности. Бумажное хроматография

Современные средства и методы экспериментальных исследований в пищевой промышленности

Выполнил:

магистрант 1-го курса

Группа и5365

Ниёзов Ш. Р.

Проверил:

Сучкова Е.П.



Содержание

хроматография сорбция фракционирование

Введение

1. Литературный обзор. Классификация хроматографических методов

1.1 Классификация по агрегатному составу фаз

1.2 Классификация по принципу фракционирования

1.3 Классификация по расположению неподвижной фазы

1.4 Классификация по способу элюции

2. Ход работы

2.1 Разделение красителей из растений методом бумажной хроматографии

Заключение

Список литературы



Введение

Хроматография - процесс, основанный на многократном повторении актов сорбции и десорбции вещества при перемещении его в потоке подвижной фазы вдоль неподвижного сорбента. Разделение сложных смесей хроматографическим способом основано на различной сорбируемости компонентов смеси. В процессе хроматографирования так называемая подвижная фаза (элюент), содержащая анализируемую пробу, перемещается через неподвижную фазу. Обычно неподвижная фаза представляет собой вещество с развитой поверхностью, а подвижная - поток газа или жидкости, фильтрующейся через слой сорбента. При этом происходит многократное повторение актов сорбции - десорбции, что является характерной особенностью хроматографического процесса и обуславливает эффективность хроматографического разделения. Хроматографический метод анализа был впервые применён русским учёным-ботаником Михаилом Семеновичем Цветом в 1900 году. Он использовал колонку, заполненную карбонатом кальция для разделения пигментов растительного происхождения. Первое сообщение о разработке метода хроматографии было сделано Цветом 30 декабря 1901 года на XI Съезде естествоиспытателей и врачей в С.-Петербурге. Первая печатная работа по хроматографии была опубликована в 1903 году, в журнале Труды Варшавского общества естествоиспытателей. В 1907 году Цвет демонстрирует Немецкому Ботаническому обществу образец хроматографа -- прибора для осуществления процесса хроматографии. В 1910-1930 годы метод был незаслуженно забыт и практически не развивался. В 1952 году Дж. Мартину и Р. Синджу была присуждена Нобелевская премия по химии за создание метода распределительной хроматографии. С середины 20 века и до наших дней хроматография интенсивно развивалась и стала одним из наиболее широко применяемых методов анализа.



1. Литературный обзор. Классификация хроматографических методов

Всем хроматографическим методам присущи некоторые общие характеристики, позволяющие изложить элементы их обобщенной теории. Однако необходимо рассмотреть специфические особенности различных вариантов хроматографического фракционирования. Это, с одной стороны, позволит за теоретическими рассуждениями все время видеть реальные черты хроматографического эксперимента, а с другой -- даст возможность ввести классификацию хроматографических методов. Существует несколько классификаций методов хроматографии: по принципу фракционирования; по способу элюции и т.д. (рис.1).

Рис. 1

1.1 Классификация по агрегатному составу фаз

Как ясно следует из названия, данная классификация основана на различиях в агрегатных состояниях, применяемых в хроматографии подвижных и неподвижных фаз. В данной классификации все виды подразделяются на 3 основных вида по агрегатному состоянию используемой подвижной фазы: газовая (ГХ, GH), жидкостная (ЖХ, LH) и сверхкритическая флюидная хроматография (подвижная фаза - полярный газ (СО2, NH3 и т.д.) сжатый до жидкого состояния) - что совершенно естественно, т.к. именно подвижная фаза растворяя в себе пробу определяет спектр разделяемых и анализируемых веществ. Совершенно логичным следующим уровнем классификации является классификация по агрегатному состоянию используемой неподвижной фазы, отвечающей за взаимодействие и разделение веществ (рис. 2)

Рис. 2

А) Газовая хроматография.

Газовая хроматография (ГХ) - хроматография, в которой подвижная фаза находится в состоянии газа или пара - инертный газ (газ-носитель). Неподвижной фазой является высокомолекулярная жидкость, закрепленная на пористый носитель или на стенки длинной капиллярной трубки, или только твердое пористое вещество, заполняющее колонку, вследствие чего газовая хроматография подразделяется на газо-жидкостную и газо-твердофазную. Газовая хроматография - универсальный метод разделения смесей разнообразных веществ, испаряющихся без разложения. При этом компоненты разделяемой смеси перемещаются по хроматографической колонке с потоком газа-носителя. По мере движения разделяемая смесь многократно распределяется между газом-носителем (подвижной фазой) и неподвижной фазой. Принцип разделения - неодинаковое сродство веществ к летучей подвижной фазе и стационарной фазе в колонке. Компоненты смеси селективно задерживаются последней, поскольку сродство их к этой фазе различно, и таким образом разделяются (компонентам с большим сродством требуется большее время для выхода из неподвижной фазы, чем компонентам с меньшим сродством). Затем вещества выходят из колонки и регистрируются детектором. Сигнал детектора записывается в виде хроматограммы автоматическим потенциометром (самописцем) или же регистрируется компьютером (рис. 3).

Метод ГХ - один из самых современных методов многокомпонентного анализа, его отличительные черты -- экспрессность, высокая точность, чувствительность, автоматизация. Метод позволяет решить многие аналитические проблемы. Количественный ГХ анализ можно рассматривать как самостоятельный аналитический метод, более эффективный при разделении веществ, относящихся к одному и тому же классу (углеводороды, органические кислоты, спирты и т.д.).

Рис 3. Пример разделения смеси газов с использованием ГХ



Этот метод незаменим в нефтехимии (бензины содержат сотни соединений, а керосины и масла - тысячи), его используют при определении пестицидов, удобрений, лекарственных препаратов, витаминов, наркотиков и др. При анализе сложных многокомпонентных смесей успешно применяют метод капиллярной хроматографии, поскольку число теоретических тарелок для 100 м колонки достигает (2--3)*105. Возможности метода ГХ существенно расширяются при использовании реакционной газовой хроматографии (РГХ), вследствие того что многие нелетучие, термонеустойчивые или агрессивные вещества непосредственно перед введением в хроматографическую колонку могут быть переведены с помощью химических реакций в другие -- более летучие и устойчивые. Химические превращения осуществляют чаще на входе в хроматографическую колонку, иногда в самой колонке или на выходе из нее перед детектором. Значительно удобнее проводить превращения вне хроматографа. Недостатки метода РГХ связаны с появлением новых источников ошибок и возрастанием времени анализа. Реакционную хроматографию часто используют при определении содержания микроколичеств воды. Вода реагирует с гидридами металлов, с карбидом кальция или металлическим натрием и др., продукты реакции (водород, ацетилен) детектируются с высокой чувствительностью пламенно-ионизационным детектором. К парам воды этот детектор малочувствителен. Широко применяют химические превращения в анализе термически неустойчивых биологических смесей. Обычно анализируют производные аминокислот, жирных кислот С10-C20, сахаров, стероидов. Для изучения высокомолекулярных соединений (олигомеры, полимеры, каучуки, смолы и т.д.) по продуктам их разложения используют пиролизную хроматографию. В этом методе испарение пробы заменяют пиролизом. Карбонаты металлов можно проанализировать по выделяющемуся диоксиду углерода при обработке их кислотами. Методом газовой хроматографии можно определять металлы, переводя их в летучие хелаты. Особенно пригодны для хроматографированияхелаты 2-, 3- и 4-валентных металлов с b-дикетонами. Лучшие хроматографические свойства проявляют b-дикетонатыBe(II), Al(III), Sc(III), V(III), Cr(III). Газовая хроматография хелатов может конкурировать с другими инструментальными методами анализа. ГХ используют также в препаративных целях для очистки химических препаратов, выделения индивидуальных веществ из смесей. Метод широко применяют в физико-химических исследованиях: для определения свойств адсорбентов, термодинамических характеристик адсорбции и теплот адсорбции, величин поверхности твердых тел, а также констант равновесия, коэффициентов активности и др. При помощи газового хроматографа, установленного на космической станции "Венера-12", был определен состав атмосферы Венеры. Газовые хроматографы устанавливают в жилых отсеках космических кораблей: организм человека выделяет много вредных веществ, и их накопление может привести к большим неприятностям. При превышении допустимых норм вредных веществ автоматическая система хроматографа дает команду прибору, который очищает воздух.

Б) Жидкостная хроматография.

Жидкостная хроматография (ЖХ) - способ (метод) хроматографического разделения, в котором подвижной фазой является жидкость и разделяемые вещества находятся в постоянном равновесии между подвижной и неподвижной фазой. По типу неподвижной фазы различают: жидкостно-жидкостную, жидкостную-твердофазную и жидкостно-гелевую хроматографии. Сфер применения ЖХ почти так же много, как велико количество направлений человеческой деятельности, где необходимо изучить состав различных растворов или выделить какое-либо вещество из жидкости. Практически незаменима ЖХ при определении и фракционировании высокомолекулярных лабильных соединений биологического происхождения: нуклеиновых кислот и белков. По началу, основным недостатком метода, по сравнению с ГХ, была его низкая разрешающая способность, обусловленная несколькими причинами: высокой вязкостью подвижных фаз, и, следовательно, низкой скоростью диффузии; неоднородностью подвижных фаз; ограничения в длине колонки и т.д. Но значительный прогресс в производстве высокоточных приборов (в первую очередь насосов), сорбентов и вычислительной техники привел к появлению метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), сравнимого по числу теоретических тарелок с газовой хроматографией (N ~ 100000). Основным отличием ВЭЖХ отклассической колоночной ЖХ является использование мелкодисперсных (<10 mkm) сорбентов на основе жестких матриц (зачастую из силикагеля) и высоких скоростей потока.

В) Сверхкритическая флюидная хроматография.

Сверхкритическим флюидом (СКФ) - называют состояние вещества, при котором исчезает различие между жидкой и газовой фазой. Любое вещество, находящееся при температуре и давлении выше критической точки является сверхкритическим флюидом. Свойства вещества в сверхкритическом состоянии промежуточные между его свойствами в газовой и жидкой фазе. Так, СКФ обладает высокой плотностью, близкой к жидкости, и низкой вязкостью, как и газы. Коэффициент диффузии при этом имеет промежуточное между жидкостью и газом значение. Вещества в сверхкритическом состоянии могут применяться в качестве заменителей органических растворителей в лабораторных и промышленных процессах. Наибольший интерес и распространение в связи с определенными свойствами получили сверхкритическая вода и сверхкритический диоксид углерода (рис.4).

Рис. 4. Фазовая диаграмма двуокиси углерода



Сверхкритическая флюидная хроматография имеет ряд преимуществ переджидкостной хроматографией и газовой хроматографией. В ней возможно применение универсальных ПИД-детекторов (в отличие от ЖХ), разделение термически нестабильных веществ и нелетучих веществ (в отличие от ГХ). На данный момент, несмотря на все преимущества, не нашла широкого применения (за исключением некоторых особых областей, таких как разделение энантиомеров и высокомолекулярных углеводородов). Несмотря на высокую чистоту получаемых соединений, высокая стоимость оборудования делает современного СКФ хроматографию применимой только в случае очистки или выделения дорогих веществ. Очень перспективна и активно внедряется СКФ хроматография, например, в медицине. В таблице приведены критические параметры и молярная масса для практически наиболее применимых веществ.

Таблица. Критические параметры различных растворителей (Reidetal, 1987).
Растворитель	Молекулярная масса	Критическая температура, Tкрит	Критическое давление, Pкрит	Критическая плотность, скрит
	г/моль	K	МПа (атм.)	г/см3
Диоксид углерода(CO2)	44.01	303.9	7.38 (72.8)	0.468
Вода (H2O)	18.015	647.096	22.064 (217.755)	0.322
Метан (CH4)	16.04	190.4	4.60 (45.4)	0.162
Этан (C2H6)	30.07	305.3	4.87 (48.1)	0.203
Пропан (C3H8)	44.09	369.8	4.25 (41.9)	0.217
Этилен (C2H4)	28.05	282.4	5.04 (49.7)	0.215
Пропилен (C3H6)	42.08	364.9	4.60 (45.4)	0.232
Метанол (CH3OH)	32.04	512.6	8.09 (79.8)	0.272
Этанол (C2H5OH)	46.07	513.9	6.14 (60.6)	0.276
Ацетон (C3H6O)	58.08	508.1	4.70 (46.4)	0.278
Аммиак (NH3)	17.03	405.3	11.35 (115.7)	0.322
Ксенон (Xe)	131.29	289.5	5.84 (58.4)	1.110

Одним из наиболее важных свойств сверхкритического состояния - это способность к растворению веществ. Изменяя температуру или давления флюида можно менять его свойства в широком диапазоне. Так, можно получить флюид, по свойствам близкий либо к жидкости, либо к газу. Так, растворяющая способность флюида увеличивается с увеличением плотности (при постоянной температуре). Поскольку плотность возрастает при увеличении давления, то меняя давление можно влиять на растворяющую способность флюида (при постоянной температуре). В случае с температурой зависимость свойств флюида несколько более сложная - при постоянной плотности растворяющая способность флюида также возрастает, однако вблизи критической точки незначительное увеличение температуры может привести к резкому падению плотности, и, соответственно, растворяющей способности. Сверхкритические флюиды неограниченно смешиваются друг с другом, поэтому, при достижении критической точки смеси система всегда будет однофазной. Приблизительная критическая температура бинарной смеси может быть рассчитана как среднее арифметическое от критических параметров веществ

Tc (mix) = (мольная доля A) x TcA + (мольная доля B) xTcB.

Если необходима большая точность, то критические параметры могут быть рассчитаны с использованием уравнений состояния, например с помощью уравнения Пенга-Робинсона. Уникальная способность сверхкритического флюида растворять большие объемы газа, в особенности H2 и N2, в купе с высоким коэффициентом диффузии, делает его использование в качестве растворителя химических реакций его чрезвычайно перспективным. Изменение температуры и давления позволяют влиять на свойства растворителя и маршрут реакции, что делает возможным более высокие выходы целевого продукта. Также следует заметить, что использование CO2 абсолютно экологично.



1.2 Классификация по принципу фракционирования

В любом хроматографическом процессе фигурируют неподвижная и подвижная фазы, между которыми распределяются молекулы фракционируемой смеси веществ. Под основным принципом фракционирования будем подразумевать природу физического, химического или биологического явления, обусловливающего такое распределение.

А) Адсорбционная хроматография.

Разделение методом адсорбционной хроматографии осуществляется в результате взаимодействия вещества с адсорбентами, такими, как силикагель или оксид алюминия, имеющими на поверхности активные центры. Различие в способности к взаимодействию с адсорбционными центрами разных молекул пробы приводит к их разделению на зоны в процессе движения с подвижной фазой по колонке. Достигаемое при этом разделение зон компонентов зависит от взаимодействия, как с растворителем, так и с адсорбентом. В основе сорбции на поверхности адсорбента, имеющего гидроксильные группы, лежит специфическое взаимодействие между полярной поверхностью адсорбента и полярными (или способным поляризоваться) группами или участками молекул. К таким взаимодействиям относят диполь-дипольное взаимодействие между постоянными или индуцированными диполями, образование водородной связи вплоть до образования р-комплексов или комплексов с переносом заряда. Возможным и достаточно частым в практической работе является проявление хемосорбции, которая может привести к значительному повышению времени удерживания, резкому снижению эффективности, появлению продуктов разложения или необратимой сорбции вещества.

Изотермы адсорбции веществ имеют линейную, выпуклую или вогнутую форму. При линейной изотерме адсорбции пик вещества симметричен и время удерживания не зависит от размера пробы. Чаще всего изотермы адсорбции веществ нелинейны и имеют выпуклую форму, что приводит к некоторой асимметрии пика с образованием хвоста. Наибольшее применение в ВЭЖХ находят адсорбенты из силикагеля с разным объемом пор, поверхностью, диаметром пор. Значительно реже используют оксид алюминия и крайне редко -- другие адсорбенты, широко применяющиеся в классической колоночной и тонкослойной хроматографии. Основная причина этого -- недостаточная механическая прочность большинства прочих адсорбентов, не позволяющая упаковывать их и использовать при повышенных давлениях, характерных для ВЭЖХ. Полярные группы, обусловливающие адсорбцию и находящиеся на поверхности силикагеля и оксида алюминия, по свойствам близки. Поэтому обычно порядок элюирования смесей веществ и элюотропный ряд растворителей для них одинаковы. Однако различие химического строения силикагеля и оксида алюминия иногда приводит к появлению различий в селективности -- тогда предпочтение отдают тому или другому адсорбенту, более подходящему для данной конкретной задачи. Например, оксид алюминия обеспечивает большую избирательность при разделении некоторых многоядерных ароматических углеводородов. Предпочтение, отдаваемое обычно силикагелю по сравнению с оксидом алюминия, объясняется более широким выбором силикагелей по пористости, поверхности и диаметру пор, а также значительно более высокой каталитической активностью оксида алюминия, нередко приводящей к искажению результатов анализа вследствие разложения компонентов пробы либо их необратимой хемосорбции.

Б) Аффинная хроматография.

Относительно слабое обратимое взаимодействие между молекулами биполимеров и сорбентом может осуществляться за счет сил биологического сродства. Такие силы действуют, например, между ферментом и его субстратом или ингибитором, антигеном и антителом, гормоном и рецептором и т. д. Для осуществления фракционирования по биологическому сродству, т. е. методом аффинной хроматографии, один из «партнеров» такой пары химически закрепляют на матрице «биоаффинного» сорбента, а сорбцией и элюцией второго «партнера» управляют путем изменения условий биологического взаимодействия в результате введения в элюент солей, мочевины, детергентов, конкурирующих молекул или изменения его рН (рис. 5).

Рис. 5

В большинстве случаев имеет место не хроматографический процесс фракционирования смеси веществ, а очистка одного из них путем избирательной сорбции, промывки и последующей десорбции. Впрочем, возможны варианты и истинной хроматографии, использующей явление аффинного взаимодействия. При этом фракционированию подвергается смесь близко родственных биологических макромолекул, различающихся по своему сродству к одному тому же аффинному сорбенту.

Иногда явление биологического сродства используется только в процессе элюции. В этом случае вещество связывается с поверхностью твердого сорбента за счет ионного взаимодействия или сил адсорбции, а элюцию осуществляют путем увеличения его сродства к элюенту, куда вводят биологически родственные (в указанном выше смысле) молекулы. Такой процесс было бы точнее называть аффинной элюцией. Имеются примеры, когда один из партнеров аффинной пары имеет не биологическое происхождение, а представляет собой, например, сложный краситель, пространственная конфигурация которого имитирует какую-либо биологическую структуру. Аффинная хроматография отличается чрезвычайно высокой избирательностью, присущей биологическим взаимодействиям. Нередко одна хроматографическая процедура позволяет очистить нужный белок в тысячи раз. Это оправдывает затраты усилий на приготовление аффинного сорбента, что не всегда оказывается легкой задачей ввиду опасности утраты биологическими молекулами способности к специфическому взаимодействию в ходе их ковалентного присоединения к матрице. Очистку белков и нуклеиновых кислот на аффинных сорбентах часто ведут не на колонках, а в объеме -- методами центрифугирования и декантации. Одной и разновидностью афинной хроматографии является металхелатная хроматография, основанная на образовании комплексов между нанесенным на сорбент ионом металла, например кадмия или никеля (никель-хелатная хроматография), и специфичеким линкером, обычно 6-10 остатков гистидина, химически связанным с целевым белком (рис. 6). Особенно часто данный метод применяется при очистке генноинженерных белков, генетический код которых заклонирован в специально сконструированы еплазмиды. В результате чего молекула белка экспрессируется с присоединённым полигистидиновым концом, за счет которого она специфически связывается ионом металла при нанесении на колонку, а примеси при этом не задерживаются, что позволяет достичь очень большой чистоты целевого продукта при минимальных затратах.

Также, при необходимости, возможно, провести ренатурацию связанных с сорбентом белков, например, обратным градиентом мочевины после чего элюировать уже чистый биологически активный белок.



Рис. 6. Прикрепление белка с гистидиновой зацепкой к грануле в аффинной колонке

Около 10 гистидиновых остатков присоединены к белку с помощью генетической инженерии, например, сочетанием сайт специфического мутагенеза с полимеразной цепной реакцией (ПЦР) (см. Nolting, 1999b). Гистидиновые остатки прочно связываются с гранулами, сделанными из никель-хелатирующей смолы.

Также возможен несколько иной вариант аффинной хроматографии, в котором неправильно свернутый белок с помощью шаперонов сворачивается правильным образом и элюируется буферным раствором (рис. 7).

Рис. 7

Исправление свертывания дорогих, плохо сворачивающихся, белков: шапероны, называемые также шаперонинами, прикреплены к гранулам, и развернутый или неправильно свернутый белок пропускается сквозь колонку. Шаперон взаимодействует с образцом белка и катализирует его сворачивание в правильной конформации.

В) Гель-фильтрация.

В этом простейшем варианте хроматографии молекулы фракционируемых веществ не должны обладать никаким специальным сродством к неподвижной или подвижной фазам. Неподвижная фаза здесь представлена жидкостью, находящейся внутри пористых гранул,-- точно такой же, как и жидкость подвижной фазы, протекающей между ними. Благодаря силам сцепления с поверхностью пространственной сетки полимера или иного пористого материала, образующего гранулы, жидкость внутри них остается неподвижной и не увлекается течением подвижной фазы. В подавляющем большинстве случаев применения гель-фильтрации для биологических целей рабочей жидкостью служат водно-солевые растворы, а материалы гранул гидрофильны. Переход молекул вещества из подвижной фазы в неподвижную и обратно за счет диффузии ничем не затруднен. Иная ситуация складывается внутри гранул. Здесь диффузия более или менее затруднена из-за столкновений молекул диффундирующего вещества с нитями пространственной сетки полимера или стенками пор. Если размеры молекул соизмеримы со средним диаметром каналов в гранулах, то эти затруднения становятся весьма существенными и диффузия тормозится. Может сложиться и такое положение, когда часть внутреннего объема гранул, т. е. часть объема неподвижной фазы (а иногда и весь этот объем), оказывается недоступной для молекул вещества, растворенного в подвижной фазе. Различие степени доступности объема неподвижной фазы для молекул различных компонентов исходной смеси веществ является фактором, определяющим возможность их фракционирования. Очевидно, что оно будет происходить по размерам молекул (рис. 8). Если в составе смеси имеются очень крупные молекулы, вовсе не проникающие внутрь гранул, то они будут выходить из колонки или достигать края хроматографической пластины вместе с передним фронтом подвижной фазы («фронтом элюции»). В то же время мелкие молекулы, свободно диффундирующие внутрь гранул, часть времени будут находиться в неподвижной фазе. Статистически эта часть времени одинакова для всех молекул такого размера и зависит от соотношения объемов жидкости в неподвижной и подвижной фазах. Таким образом, все мелкие молекулы, достигнут конца хроматографического пути более или менее одновременно и заведомо позднее, чем крупные. Молекулы промежуточных размеров, для которых из-за разброса значений эффективных диаметров пор внутри гранул неподвижной фазы доступна только часть ее объема, должны, очевидно, перемещаться вдоль колонки или пластины с промежуточной скоростью.

Рис. 8. Гель-фильтрационная хроматография

Малые молекулы в образце могут проникать внутрь гранул, вследствие этого они протекают через колонку медленнее. Крупные молекулы, которые не могут проникнуть в гранулы через поры, проходят сквозь колонку быстрее, чем более мелкие. Правильный размер пор и свойства растворителя являются решающими для хорошего разделения.

Это явление первоначально было названо «гель-фильтрацией», поскольку в качестве пространственной сетки использовали полимерные гели. Однако эти гели относительно легко деформируются и для хроматографии при высоком давлении непригодны, поэтому их стали заменять жесткими материалами, в частности пористым стеклом и силикагелем. Иногда для этого варианта хроматографии вводят термин «эксклюзивная хроматография» («exclusion» -- исключение; имеется в виду исключение из гранул крупных молекул). Поскольку сейчас силикагель явно вытесняет пористое стекло, мы сохраним для рассматриваемого варианта хроматографии прежнее название -- гель-фильтрация.

Очевидно, что размеры молекул связаны с их массами, но отнюдь не целиком ими определяются. Это особенно важно учитывать в случае макромолекул, размеры которых могут существенно зависеть от плотности упаковки полипептидной или полинуклеотидной цепи. В ограничении свободы диффузии через пространственную сетку пор внутри гранул немалую роль может играть и форма молекулы. Очевидно, что сферическая глобула будет диффундировать иначе, чем молекула такого же объема, но вытянутая в виде палочки.

Как во всех хроматографических разделениях излишняя длина колонки приводит к размыванию пика (рис. 9).

Рис. 9. Уширение полос в колонке из-за чрезмерной длины колонки. Так называемая эффективная часть колонки является достаточной для разделения. Слишком длинные колонки не улучшают очистку, но вызывают разбавление образца из-за уширения полос.

Рис. 9

Гель-фильтрационная хроматография является также вспомогательным методом для оценки молекулярной массы молекул. Несмотря на то, что для этого существуют гораздо более точные методы, например, масс-спектрометрия, гель-фильтрация оказывается полезной для измерения равновесий мономер-мультимер при микромолярных (мкМ) концентрациях биомолекул (рис. 10).

Рис. 10

Молекулы с известной молекулярной массой дают возможность оценить молекулярную массу неизвестной молекулы. В данном случае для исследуемой молекулы наблюдаются два пика, что указывает на равновесие мономер-димер. Пористые материалы для гель-фильтрации чаще всего выпускаются в виде сферических гранул целого набора диаметров с различными средними размерами пор.

Г) Ионообменная хроматография.

Этот процесс сходен с адсорбционной хроматографией вследствие того, что задержание молекул вещества в неподвижной фазе обусловлено их связыванием с поверхностью твердого гидрофильного материала сплошных или пористых гранул, находящихся в контакте с жидким элюентом. Однако в этом варианте хроматографии задержание происходит не за счет молекулярной адсорбции, а в результате электростатического взаимодействия разноименно заряженных ионов.

На всех наружных и внутренних поверхностях твердых гранул вдоль нитей полимеров и гелей, образующих пространственную сетку, более или менее равномерно распределены ковалентно связанные с этими поверхностями ионогенные группы. В омывающем их водном элюенте они диссоциируют, образуя сетку одноименно заряженных неподвижных ионов. Если молекулы компонентов фракционируемой смеси тоже способны ионизироваться при растворении, причем так, что их суммарный заряд имеет противоположный знак, то они связываются с неподвижными ионогенными группами силами электростатического взаимодействия, оказываясь тем самым фиксированными в неподвижной фазе. Связь эта обратима: ионы одних компонентов могут замещаться на другие или вытесняться находящимися в элюенте контрионамиионогенных групп сорбента, а также специально вводимыми для этой цели в элюент ионами. Происходит обмен ионов, поэтому сорбенты описанного типа называют ионообменниками (ионитами).

Выбор ионообменного сорбента для очистки белка в значительной степени зависит от изоэлектрической точки белка -- pi. При значениях рН, превышающих pi белка, его молекулы приобретают в целом отрицательный заряд и способны адсорбироваться анионным обменником. При рН ниже pi белок будет адсорбироваться катионным обменником. Например, если pi = 4, то в большинстве случаев целесообразно подобрать сорбент, который способен связывать белок при рН > 4. Поскольку при рН > 4 такой белок заряжен отрицательно, то сорбент должен быть анионообменником, например, с диэтиламиноэтильной функциональной группой (ДЭАЭ). Можно было бы использовать рН < 4 и катионообменник, но многие белки в таких условиях нестабильны, либо образуют агрегаты. Если, напротив, белок, который мы хотим очистить, имеет pi = 10, то он будет заряжен положительно в условиях, пригодных, как правило, для ионообменной хроматографии, т. е. при рН около 7. Таким образом, в общем, для белка такого типа мы должны выбрать катионообменный сорбент, например, с карбоксиметильной функциональной группой (КМ), которая при нейтральном рН заряжена отрицательно.

Адсорбирующая способность сорбента сильно зависит от рН и от pi разделяемых белков (рис. 11), но также от качества сорбента, прилагаемого давления и от числа прогонов колонки. Чтобы увеличить срок службы сорбента, его следует тщательно промыть, хранить в подходящем растворителе и не применять рН и давление вне предписанных допустимых пределов.

Рис. 11. Зарядовые свойства анионо- и катионообменников

Анионообменник с ДЭАЭ имеет значительную емкость при низких и средних значениях рН=1-6; катионообменник с КМ имеет высокую емкость при высоких и средних значениях рН=6-14.

На представленном рисунке показаны профили сил удерживания т.н. "слабых" ионообменников, емкость которых значительно зависит от рН подвижной фазы. Также широко распространены "сильные" катионообменники, практически не меняющие свою емкость в широком диапазоне рН. В этих ионитах в качестве ионогенных групп используются или остатки сильных кислот (например, серной) в катионообменниках, или сильные основания (например, четвертичные амины) в анионообменниках. В первом случае катионообменник имеет рабочий интервал рН равен 1-14, а во втором случае - 1-11. На практике при выборе силы обменника следует учитывать множество факторов, например, крупные белковые молекулы могут в неподходящих условиях необратимо связываться с "сильными" анионитами. Разрешающая способность хроматографического разделения зависит преимущественно от типа биомолекул, типа и качества сорбента, ионной силы градиента при элюции, от температуры и от геометрии колонки.

Как уже отмечалось, возможность фракционирования компонентов смеси веществ обусловлена здесь различием в значениях их суммарных зарядов. Последние зависят как от числа и характера ионогенных групп в молекулах, так и от полноты их диссоциации, которую можно контролировать путем выбора рН и ионной силы элюента. Чем больше в данных условиях элюции суммарный заряд того или иного компонента смеси, тем сильнее его взаимодействие с ионообменником и тем медленнее он мигрирует вдоль колонки. Так, на рисунке 12 представлен пример разделения аминокислот, имеющих разный заряд.

Рис. 12. Разделение имеющих разный заряд аминокислот

На очерченный здесь основной процесс ионообменной хроматографии влияет ряд дополнительных факторов. Среди них, кроме уже фигурировавшей ранее затрудненной (особенно для крупных молекул) диффузии внутри гранул, следует назвать возможность неионной адсорбции на поверхности матрицы ионообменника. Однако при правильном выборе материала обменника, и в частности его пористости, основную роль в процессе фракционирования играет явление ионного обмена.

Схема типичного прибора для ионообменной хроматографии представлена на рисунке 13.



Рис. 13. Типичная установка ионообменной жидкостной хроматографии для очистки белков

После загрузки образца насос создает солевой градиент для элюции образца.

Д) Распределительная хроматография.

Строго говоря, так следует назвать хроматографический процесс, в котором неподвижная и подвижная фазы представлены двумя несмешивающимися или частично смешивающимися жидкостями. Если в системе двух контактирующих между собой жидкостей такого рода растворять какое-либо вещество, то его концентрация в этих растворителях будет одинакова только в том случае, если оба они обладают одинаковой растворяющей способностью, т. е. одинаковым сродством к веществу. В противном случае молекулы вещества будут переходить из одной жидкости в другую до тех пор, пока не установится равновесие, которому будет отвечать более высокая концентрация этих молекул в той жидкости, растворяющая способность которой выше. Если такие жидкости представляют собой неподвижную и подвижную хроматографические фазы, то распределение вещества между фазами происходит в соответствии с растворимостями в них компонентов исходной смеси, причем для каждого компонента -- независимо от всех других (если, разумеется, свойства самих растворителей при этом не изменяются). Чем выше сродство данного компонента к неподвижной фазе, тем медленнее он мигрирует вдоль колонки или пластинки. Жидкость неподвижной фазы, как и при гель-фильтрации, может быть просто иммобилизована внутри пористых гранул, или, например, быть прочно связана с волокнами набухшей целлюлозы, или же покрывать тонкой пленкой гранулы из сплошного материала и поверхность пор внутри них. Покрытие может осуществляться за счет смачивания, сорбции или химическим путем. В последнем случае нередко «пленка» жидкости сводится к мономолекулярному слою вещества, способного удерживать близ своей поверхности молекулы компонентов фракционируемой смеси в соответствии со степенью их сродства к нему. В этом случае соотношении растворимостей говорить трудно, так что лучше оперировать только понятиями «сродства» того или иного компонента к неподвижной и подвижной фазам, что, впрочем, с позиций теории хроматографии сведется к точно такой же, как при истинном растворении, количественной характеристике равновесного распределения фракционируемого материала между двумя фазами. Если в процессе распределительной хроматографии участвуют две истинные жидкости, то для осуществления равновесного распределения вещества они сами тоже должны быть в равновесии между собой, т. е. в случае частичной их растворимости друг в друге должны быть взаимно насыщенными.

Очень часто одна из фаз обогащена органическим растворителем, в то время как другая является в основном водной. Естественно, что в этом случае фракционирование веществ идет по степени их гидрофобности. Исторически сложилось так, что «нормальным» расположением фаз называют такое, при котором неподвижной является водная фаза. За счет смачивания (набухания) она легко фиксируется на гидрофильных матрицах (целлюлозе, полиакриламидном или декстрановом гелях, диатомовых землях, силикагеле и др.). В состав подвижной фазы в этом случае входят органические растворители. При обратном расположении фаз, когда на твердой матрице фиксируют пленку органического растворителя, а подвижная фаза представляет собой водный раствор, распределительную хроматографию называют хроматографией в обращенных фазах (ХОФ). В английской литературе ее обозначают RPC (reversed phasechromatography). ХОФ при высоком давлении нередко осуществляют таким образом, что неподвижная фаза вместо пленки органического растворителя представлена монослоем молекул жирного или ароматического ряда, химически закрепленных на поверхности твердой матрицы силикагеля. В качестве матриц для ХОФ с истинно жидкой неподвижной фазой часто используют предварительно силиконированные диатомовые земли типа кизельгуров.

1.3 Классификация по расположению неподвижной фазы

А) Колоночная хроматография.

Если пористые гранулы геля или сорбента для любого типа хроматографии заполняют стеклянную или металлическую колонку, то говорят о хроматографии на колонке, или «колоночной хроматографии», хотя последнее выражение относится к категории укоренившегося жаргона. Хроматографию на колонке во многих случаях теперь ведут при очень большом давлении подачи элюента (до 300--400 атм.), что позволяет уменьшить диаметр гранул до 5--10 мкм с вытекающими отсюда (см. ниже) существенными преимуществами в быстроте и качестве фракционирования микроколичеств исходного вещества. За это приходится расплачиваться использованием дорогостоящих стальных прецизионных колонок и специальной аппаратуры, но в случае серийных анализов такие затраты себя оправдывают. Жидкостную хроматографию на колонках при высоком давлении условимся сокращенно обозначать ЖХВД (ВЭЖХ). В английской литературе принято обозначение HPLC, которое расшифровывают как «highpressure (иногда -- high performance) liquid chromatography».

Б) Тонкослойная хроматография.

Тонкий (0,1--0,5 мм) слой гранул, адсорбированных или иным образом закрепленных на поверхности пластинки из стекла или пластика, позволяет осуществлять хроматографию в тонком слое, или «тонкослойную хроматографию» (ТСХ). Английское обозначение TLC (thinlayer chromatography). Движение жидкой фазы происходит за счет капиллярных сил (рис. 14).

Рис 14. Принцип тонкослойной хроматографии

Тонкослойная хроматография имеет несколько способов, связанных, в основном, с видом движения растворителей.

А. Восходящая тонкослойная хроматография.

Б. Нисходящая тонкослойная хроматография.

В. Горизонтальная тонкослойная хроматография.

Г. Радиальная тонкослойная хроматография.

Восходящая тонкослойная хроматография.

Этот вид хроматографии наиболее распространен и основан на том, что фронт хроматографической системы поднимается по пластинке под действием капиллярных сил. Для этого метода используется наиболее простое оборудование, так как в качестве хроматографической камеры можно использовать любую емкость с плоским дном и плотно закрывающейся крышкой, в которую свободно помещается хроматографическая пластинка.

Метод восходящей тонкослойной хроматографии имеет ряд своих недостатков. Например, скорость поднятия фронта по пластинке происходит неравномерно, т.е. в нижней части она самая высокая, а по мере поднятия фронта уменьшается. Это связано с тем, что в верхней части камеры насыщенность парами растворителя меньше, поэтому растворитель с хроматографической пластинки испаряется интенсивнее, следовательно, уменьшается его концентрация и скорость движения замедляется. Для устранения этого недостатка по стенкам хроматографической камеры до начала хроматографирования прикрепляют полоски фильтровальной бумаги, по которым поднимающаяся хроматографическая система насыщает парами камеру по всему объему.

Недостатком также можно считать необходимость следить за фронтом растворителя, так как возможно "убегание" лини фронта растворителя до верхнего края. В таком случае определить значение Rf уже невозможно.

Радиальная тонкослойная хроматография.

Радиальная тонкослойная хроматография заключается в том, что в центр пластинки наносится исследуемое вещество и туда же подается система, которая движется от центра к краю пластинки.

Нисходящая тонкослойная хроматография.

Этот метод хроматографии основан на том, что фронт хроматографической системы опускается по пластинке в основном под действием сил тяжести, т.е. фронт подвижной фазы движется сверху вниз. Для этого метода в верхней части хроматографической камеры крепится кювета с хроматографической системой, из которой с помощью фитиля на хроматографическую пластинку поступает растворитель, который стекает, и происходит хроматографирование исследуемого образца.

К недостаткам этого метода можно отнести усложнение оборудования. Этот метод используется в основном в бумажной хроматографии.

Горизонтальная тонкослойная хроматография.

Этот метод наиболее сложен в аппаратурном оформлении, но наиболее удобен. Так, в хроматографической камере пластинка размещается горизонтально, и подача системы происходит на один край пластинки с помощью фитиля. Фронт растворителя движется в противоположную сторону. Есть еще один прием, позволяющий предельно упростить камеру. Для этого хроматографическую пластинку на алюминиевой основе слегка изгибают и помещают в камеру. В данном случае система будет поступать с двух сторон одновременно. Для этой цели подходят только пластины с алюминиевой подложкой, так как пластиковая и стеклянная основа "несгибаема", т.е. не сохраняет форму.

К достоинствам этого метода можно отнести то, что в горизонтальной кювете насыщение парами системы происходит гораздо быстрее, скорость движения фронта постоянная. А при хроматографировании с двух сторон, фронт не "убегает".

1.4 Классификация по способу элюции

А) Фронтальный анализ.

Фронтальный анализ состоит в непрерывном пропускании анализируемой смеси через слой сорбента в колонке. Если анализируемая смесь состоит из двух компонентов А и В, изотерма сорбции которых линейная, и наиболее слабо сорбирующегося газа Е, то последний заполняет весь объем колонки и покидает ее в чистом виде. При этом на хроматограмме фиксируется горизонтальная линия (нулевая линия) (рис. 15). Если компонент А сорбируется слабее чем компонент В, то после насыщения сорбента веществом А из колонки начинает выходить смесь этого вещества с газом Е. На хроматограмме появляется ступень, высота которой соответствует концентрации А в Е на выходе из колонки. Эта концентрация может быть равна или больше исходной концентрации А. Наконец, когда сорбент насыщается также и веществом В, из колонки начинает выходить смесь газа, содержащая все исходные компоненты, а на хроматограмме появляется вторая ступень, высота которой соответствует суммарной исходной концентрации веществ А и В.

Так называется вариант хроматографического процесса, когда раствор смеси компонентов непрерывно подается на вход хроматографической колонки. На выходе ее в этом случае появляются один за другим несколько «фронтов» элюата. За первым из них следует чистый, быстрее других мигрирующий в данной системе компонент смеси, отличающийся, очевидно, наименьшим сродством к неподвижной фазе. Второй фронт отмечает добавление к нему следующего по подвижности компонента. За третьим фронтом следует уже смесь трех компонентов, высота которой соответствует суммарной исходной концентрации веществ А и В. В настоящее время по вполне понятным причинам фронтальный анализ почти вышел из употребления и применяется лишь в отдельных, специальных случаях.

Рис. 15. Схема образования зон при фронтальном анализе и распределения концентрации в зонах

В случае более сложной смеси исходная концентрация всех компонентов достигается после насыщения сорбента всеми ее компонентами. Таким образом, число ступеней на хроматограмме фронтального анализа равно числу сорбирующихся компонентов смеси. Следовательно, фронтальный метод позволяет выделить из смеси в чистом виде только одно, наиболее слабо сорбирующееся вещество. Поэтому для аналитических и тем более препаративных целей фронтальный метод применяется лишь в особых случаях. Фронтальный метод используется также для определения физикохимических характеристик вещества, в частности, для определения изотерм сорбции.

Б) Вытеснительная хроматография.

В этом варианте в колонку или на стартовую линию хроматографической пластинки наносят определенную порцию раствора исходной смеси веществ, а затем ведут элюцию раствором вещества, обладающего заведомо большим сродством к неподвижной фазе хроматографической системы, чем любой из компонентов смеси. Происходит вытеснение их из неподвижной фазы, причем в первую очередь тех, которые обладают меньшим сродством к сорбенту, а затем и всех остальных. Элюент выталкивает все компоненты смеси впереди себя наподобие поршня. Так как они выходят в подвижную фазу концентрированными, то между ними также идет конкуренция за связь с неподвижной фазой. Компоненты, уступающие другим в силе сродства к этой фазе, оттесняются еще вперед, где сорбируются, но только до тех пор, пока их опять не вытеснят компоненты, обладающие большим сродством к сорбенту. В результате такого чередования сорбции и вытеснения компоненты смеси будут выходить из колонки один за другим в порядке возрастания силы их связи с неподвижной фазой. Ясно, что при этом зоны соседних компонентов будут соприкасаться или даже немного перекрываться друг с другом (рис. 16).

Рис. 16. Схема образования зон в вытеснительном методе и распределения концентрации веществ в зонах

В отличие от хроматографической элюции, в вытеснительном методе компоненты смеси не разбавляются промывающим веществом, вследствие чего их концентрация не только не уменьшается, но даже увеличивается. Для аналитического фракционирования метод непригоден, но хорош для препаративного или полупромышленного разделения веществ, поскольку емкость колонки здесь используется очень эффективно.

В) Бумажная хроматография.

Вид хроматографии, основанный на различии в скорости перемещения компонентов анализируемой смеси по бумаге в потоке растворителя (элюента). Хроматограммой в этом случае называют картину расположения хроматографических зон на бумаге после завершения разделения. В бумажной хроматографии используется главным образом специальная хроматографическая бумага, которая должна быть максимально однородной и содержать только целлюлозные волокна. Она может служить неподвижной фазой или инертным носителем неподвижной фазы. В распределительной бумажной хроматографии неподвижная фаза - адсорбированная бумагой вода или неполярные органические растворители, которыми пропитывают бумагу (вариант с обращенными фазами), а элюент - соответственно смеси органических растворителей с водой, часто содержащие также компоненты, комплексообразующие и другие вещества, или водные растворы неорганических кислот и солей. Скорость перемещения компонентов зависит от коэффициента их распределения между фазами и от соотношения объемов этих фаз. В адсорбционной бумажной хроматографии разделение компонентов смеси происходит благодаря различию в их сорбируемости адсорбентом - бумагой. В качестве элюента используются главным образом смеси органических растворителей с водой. В ионообменной бумажной хроматографии используют бумагу, пропитанную ионообменными смолами. Скорость миграции компонентов в этом случае зависит главным образом от констант ионного обмена и рН элюента. Осадочная БХ осуществляется на бумаге, импрегнированной раствором реагента-осадителя, образующего с разделяемыми веществами малорастворимые соединения. Скорость движения компонентов определяется произведениями растворимости этих соединений. В лигандообменной бумажной хроматографии бумагу предварительно обрабатывают растворами ионов металлов, например Сu2+ при разделении аминов и аминокислот. При этом компоненты перемещаются в зависимости от констант устойчивости их комплексных соединений с ионами металлов. На практике часто реализуются одновременно несколько механизмов разделения.

Бумажная хроматография осуществляется в стеклянных хроматографических камерах или других закрытых сосудах. Для улучшения воспроизводимости их часто кондиционируют, покрывая внутренние стенки фильтровальной бумагой, смоченной соответствующим растворителем. В камеру помещают лоток с элюентом, в который опускают край хроматографической бумаги после нанесения на нее пробы разделяемых веществ (обычно объемом 1-10 мкл). Элюент движется под действием капиллярных и гравитационных сил. По расположению бумаги и направлению тока элюента различают восходящую, нисходящую и горизонтальную бумажную хроматографию. Хроматографирование можно проводить также в центробежном поле или в условиях градиента температуры, что увеличивает эффективность и скорость разделения. В так называемой двумерной бумажной хроматографии пробу наносят в один из углов квадратного листа и после завершения хроматографирования в одном элюенте бумагу высушивают и, повернув на 90°, погружают в другой элюент. На двумерной хроматограмме получают до n2 хроматографических зон, где n - число зон, образующихся при обычной (одномерной) бумажной хроматографии. После подъема растворителя на определенную высоту бумагу вынимают из камеры, высушивают и выявляют хроматографические зоны. Если зоны не окрашены, хроматограмму опрыскивают растворами специфических реагентов, образующих с компонентами разделяемой смеси окрашенные или флуоресцирующие соединения. Используют также ферментативные и биологические методы детектирования, например, для выявления ферментов хроматограмму обрабатывают раствором соответствующих субстратов. Радиоактивные вещества обнаруживают, экспонируя хроматограмму на рентгеновскую пленку. Положения хроматографических зон в бумажной хроматографии характеризуют величиной Rf, представляющей собой отношение пути, пройденного центром хроматографической зоны, к пути, пройденному фронтом растворителя:

Rf=1/[1 + (KdVs/Vm)],

где Кs и Vт - объемы соответственно неподвижной и подвижной фаз, Кd - коэффициент распределения вещества между этими фазами. Погрешность определения Rf около 5%. В стандартизованных условиях эта величина постоянна для каждого вещества и используется для его идентификации. Количественный анализ проводят непосредственно на хроматограммах или после отделения вещества хроматографических зон от целлюлозной основы. В первом случае компоненты определяют с помощью сканирующей денситометрии, флуориметрии, фотометрии или по размеру хроматографических зон, а также активационными методами (при использовании последних двух методов зоны предварительно вырезают). Пределы обнаружения веществ в зонах по окрашенным производным составляют 0,1-10 мкг, флуориметрически -10-3-10-2 мкг, активационным методом - 10-4-10-10 мкг. Отделение компонентов от целлюлозной основы осуществляют экстрагированием, сжиганием бумаги или кипячением ее в смеси кислот. Затем компоненты определяют любым подходящим методом, обычно спектрофотометрическим, титриметрическим или кинетическим. Погрешность количественного анализа не превышает 10%. С помощью бумажной хроматографии можно разделить и анализировать практически все классы химических соединений, в том числе аминокислоты, сахара, стероиды. Кроме того, бумажная хроматография в сочетании с двумерным электрофорезом используется как микропрепаративный метод разделения природных веществ, в частности пептидов. Достоинства бумажной хроматографии: возможность разделения малых количеств (0,001-1 мкг) веществ, высокая чувствительность, простота аппаратуры. Недостаток метода: сильное размывание хроматографических зон, связанное с неоднородностью бумаги. Вследствие этого, для разделения сложных смесей веществ, необходимо использовать листы длиной около 1 м, что приводит к увеличению длительности эксперимента (для двумерной бумажной хроматографии до 15-20 ч) и большому расходу растворителя.