Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНОБРНАУКИ РОССИИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«ПЕНЗЕНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ» (ПГТА)

Кафедра «Биотехнологии и техносферная безопасность»

Дисциплина «Аналитическая химия»

КУРСОВАЯ РАБОТА

на тему: Современные методики и оборудование плоскостной хроматографии

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

ПГТА 3.280202.65.22 ПЗ

Выполнил: студент группы 10ЭК ШпедерМ.С__

Руководитель:__к.б.н., доц. Кузьмин А.А.______

Работа защищена с оценкой:__________________

Пенза 2012

Оглавление

• Введение
• 1.Сущность методов хроматографии
• 2. Тонкослойная хроматография
• 2.1 Общее описание
• 2.2 ТСХ-пластинки и сорбенты
• 2.3 Нанесение образца
• 2.4 Проявление хроматограммы
• 2.5 Просмотр хроматограммы
• 2.6 Использование ТСХ в качественном анализе
• 2.7 Выбор проявляющего растворителя (подвижной фазы)
• 2.8 Препаративная тонкослойная хроматография
• 3. Хроматография на бумаге
• 3.1 ”Бумажная” хроматография
• 3.2 Двумерная хроматография на бумаге
• 3.3 Методы проявления хроматограмм
• 3.4 Приготовление подвижной фазы
• 3.5 Нанесение вещества
• 3.6 Проявление
• 3.7 Обработка хроматограммы
• 4.Область применения и оборудования
• Библиографический список

Введение

Метод плоскостной хроматографии в настоящее время широко используется в различных областях науки и техники. Плоскостная хроматография включает в себя тонкослойную и бумажную хроматографию.

Рассмотрим для начала методы и особенности тонкослойной хроматографии, а затем перейдём к бумажной хроматографии и проведём сравнительный анализ этих двух методов.

Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) нашёл широкое применение и получил развитие вследствие ряда его преимуществ: быстрота выполнения анализа, относительная простота метода, экономичность и универсальность. Метод используют для разделения и анализа микроколичеств веществ разнообразного происхождения, определения примесей с органических соединениях, качественной и количественной оценки примесей в продуктах пищевой и химической промышленности.

Возникнув первоначально как качественный метод, хроматография в тонких слоях начинает с успехом использоваться для полуколичественного и количественного определения и анализа органических соединений.

Тонкослойная хроматография или, как её часто называют, метод хроматографии в тонком слое адсорбента к настоящему времени получила всеобщее признание. Тонкослойную хроматографию с успехом применяют в различных областях органической, аналитической и биологической химии для анализа примесей в различных технических смесях и материалах, в фармацевтической и нефтеперерабатывающей промышленности, технологии пластических масс, сельском хозяйстве.

Метод тонкослойной хроматографии был предложен в 1938 г. Н. А. Измайловым и М. С. Шрайбер для разделения и анализа в тонком слое окиси алюминия некоторых алкалоидов из экстракта лекарственных растений. Потребовалось, однако, ещё более двадцати лет, прежде чем этот метод получил всеобщее признание. С выходом в свет работы Шталя начинается новый этап в развитии хроматографии в тонких слоях. Тонкослойная хроматография становится одним из основных методов органической химии для анализа самых разнообразных органических соединений.

Хроматография на бумаге оказалась исключительно ценным способом исследования весьма малых количеств многих органических веществ, особенно в области биологической химии. Применение этого способа для разделения аминокислот, содержащихся в продуктах гидролиза белков, для изучения состава различных природных веществ и т. п. дало такие результаты, которые невозможно было получить каким-либо иным путём.

• хроматография тонкослойный сорбент растворитель
• 1. Сущность методов хроматографии

Хроматография - это способ разделения веществ, основанный на перемещении дискретной зоны вещества в потоке подвижной фазы вдоль слоя неподвижного сорбента и связанный с многократным повторением сорбционных и десорбционных процессов.

В простейшем виде хроматографическое разделение смеси осуществляется при прохождении потока жидкости или газа (под- вижной фазы ), содержащего анализируемые вещества, через колонку, заполненную сорбентом ( неподвижной фазой ). Если молекулы разных компонентов разделяемой смеси обладают различной адсорбируемостью или растворимостью, то время их пребывания в неподвижной фазе, а следовательно, и средняя скорость передвижения по колонке различны. При достаточной длине колонки это различие может привести к полному разделению смеси на составляющие ее компоненты. Причем слабо сорбируемые вещества выходят из колонки в первую очередь. Наиболее сильно сорбируемый компонент выходит из колонки последним.

Возникновение хроматографии как научного метода связано с именем русского ученого-ботаника М.С.Цвета, который впервые применил явление адсорбции для анализа зеленой части хлорофилловых пигментов листьев. В 1903 г. М.С.Цвет опубликовал статью, в которой сформулировал принцип нового метода и на-глядно показал возможность отделения зеленой части хлорофилловых пигментов от желтой и оранжевой с помощью углекислого кальция ( адсорбента ). Однако метод хроматографии не использовался вплоть до 1930 года, когда немецкие биохимики Кун, Ледерер, Винтерштейн повторили опыты Цвета и успешно разделили каротин на отдельные изомеры, предсказанные Цветом. С этого времени хроматография стала развиваться в самых разнообразных направлениях.

Первые публикации, посвященные применению метода Цвета в неорганическом анализе , относятся к 1937 году и принадлежат Швабу и его сотрудникам. В этих работах приведена методика качественного анализа смесей некоторых катионов и анионов на стеклянной колонке с оксидом алюминия. С 1938 г. широкое распространение получил метод тонкослойной хроматографии, разработанный Н.А.Измайловым и М.C.Шрайбером.

Значительные успехи в разделении и анализе неорганических веществ были достигнуты в 50-х годах, когда в практику хроматографии были введены в качестве адсорбентов ионообменные смолы, что способствовало развитию ионообменной хроматографии. В 1941 году английские ученые Мартин и Синдж предложили метод распределительной хроматографии в жидкостно-жидкостном варианте.

В 1948 г. русские ученые Е.H. Гапон и Т.Б. Гапон предложили осадочную хроматографию, основанную на различной растворимости осадков в подвижной фазе. Первая работа по газовой хро-матографии в России была выполнена Н.М. Туркельтаубом в 1949г. В 1952 году Джеймс и Мартин применили газо-жидкостную хроматографию к анализу жирных кислот. Дальнейшему развитию газовой хроматографии способствовали работы русских ученых А.A. Жуховицкого, М.C. Вигдергауза, A.B. Киселева, Д.A. Вяхирева, А.В. Березкина и других.

В настоящее время существует большое разнообразие вари-антов хроматографического метода разделения веществ.

Простота, эффективность и универсальность методов хроматографии дали возможность широко использовать ее в различных областях науки, промышленности и техники.

C помощью хроматографии возможно:

- разделение сложных смесей органических и неорганических веществ на отдельные компоненты ;

- разделение и выделение растительных и животных пигментов, изотопов, редкоземельных элементов и других веществ;

- очистка веществ от примесей;

- концентрирование веществ из сильно разбавленных растворов;

- определение молекулярной структуры некоторых соединений путем установления связи между сорбируемостью и строением данного вещества ;

- качественный и количественный анализ исследуемых веществ.

В различных вариантах хроматографии без газа-носителя также предусмотрено непрерывное движение анализируемой смеси вдоль сорбционного слоя. В случае вакантохроматографии в колонку периодически вводят небольшие порции практически несорбирующегося газа, что вызывает движение по колонке «вакансий» -- зон, в которых отсутствуют по одному из компонентов анализируемой смеси. При этом скорость «вакансии» соответствует скорости отсутствующего в этой зоне вещества.

При хромадистилляции роль неподвижной фазы играют компоненты разделяемой смеси, которую (в виде жидкости) наносят на твердый носитель. В потоке газа-носителя создаются условия для многократного испарения и конденсации, что обеспечивает разделение компонентов.

В зависимости от природы исследуемых объектов можно рассматривать молекулярную хроматографию, ионообменную (ионную) хроматографию и хроматографию надмолекулярных структур.

В зависимости от природы процесса, обусловливающего распределение сорбатов между подвижной и неподвижной фазами, различают адсорбционную, распределительную, ионообменную,, осадочную, аффинную и эксклюзионную хроматографию.

В адсорбционной хроматографии элементарным актом является адсорбция и разделение основано на различии в адсорбируемости компонентов смеси на данном адсорбенте.

В распределительной хроматографии элементарным актом: является растворение; разделение основано на различии в растворимости сорбатов в подвижной и неподвижной фазах или на различии в стабильности образующихся комплексов.

В ионообменной хроматографии разделение основано на различии констант ионообменного равновесия.

В осадочной хроматографии разделение основано на различной растворимости осадков в подвижной фазе.

Аффинная хроматография основана на биоспецифическом взаимодействии компонентов с аффинным лигандом.

В эксклюзионной хроматографии разделение основано на различии в проницаемости молекул разделяемых веществ в неподвижную (в случае гель-хроматографии неподвижной фазой служит гель) и обусловлено размерами этих молекул. Компоненты элюируются в порядке уменьшения их молекулярной массы.

В зависимости от агрегатного состояния подвижной и неподвижной фаз "различают варианты газовой и жидкостной хроматографии.

Газовой хроматографией называют хроматографический процесс, в котором подвижной фазой является газ (или пар). Варианты газовой хроматографии -- газо-адсорбционная и газожидкостная хроматография, а также промежуточные методы.

В газо-адсорбционной (точнее -- газо-твердофазной) хроматографии неподвижной фазой служит твердый адсорбент, а подвижной-- газ.

В газожидкостной хроматографии неподвижной фазой служит жидкость, нанесенная на инертный носитель, а подвижной -- газ.

К промежуточным методам относится хроматография на модифицированном сорбенте (газо-жидко-твердофазная), основанная на том, что неподвижной фазой служит твердый адсорбент, модифицированный небольшим количеством жидкости. В этом случае играют роль как адсорбция на поверхности" газ -- твердое тело (и в определенной степени -- на поверхности жидкость -- твердое тело), так и растворимость в жидкости. Существуют и другие промежуточные варианты.

Жидкостной хроматографией называют хроматографический процесс, в котором подвижной фазой является жидкость. В жидкостно-жидкостной хроматографии и подвижной, и неподвижной фазами служат жидкости. В жидкостно-адсорбционной хроматографии неподвижной фазой служит твердый адсорбент, а подвижной -- жидкость. В жидкостной хроматографии также имеются промежуточные варианты. Следует указать на некоторую условность термина «неподвижная фаза», поскольку адсорбент или абсорбирующая жидкость не всегда остаются неподвижными. Они могут перемещаться в том же направлении, что и подвижная фаза (но с другой скоростью), или в противоположном. Более того, можно говорить о распределении вещества между двумя областями одной фазы, движущимися с различными скоростями (гидродинамическая хроматография, являющаяся методом разделения коллоидных частиц).

Промежуточным между газовой и жидкостной хроматографией является вариант, когда подвижной фазой служит сжатый газ. Если подвижной фазой служит сверхкритический флюид, то этот вариант называется флюидной хроматографией.

2. Тонкослойная хроматография

Тонкослойная хроматография (ТСХ) - один из наиболее широко используемых хроматографических методов - имеет огромное значение для быстрого качественного анализа смесей, контроля реакций и определения рабочих параметров, которые следует использовать в препаративной колоночной хроматографии.

2.1 Общее описание

Разделение производят на плоской пластинке, покрытой тонким слоем сорбента - силикагелем или оксидом алюминия (рис. 1,а).

Рис.1 Тонкослойная хроматография.

Разделяемую смесь, растворенную в соответствующем растворителе, наносят в виде капель на пластинку (рис 1, б) и после испарения растворителя помещают пластинку в проявительную камеру (рис 1, в), в которую налито немного растворителя. Растворитель поднимается по слою сорбента под действием капиллярных сил. При этом различные соединения, находящиеся в смеси, поднимаются с разными скоростями в зависимости от их сродства к сорбенту. По достижении растворителем верхнего слоя сорбента соединения в идеальном случае должны полностью разделиться (рис. 1, г). Процесс разделения - это одна из форм жидкостно-адсорбционнй хроматографии.

2.2 ТСХ-пластинки и сорбенты

Пластинки для ТСХ состоят из подложки обычно стекла, а иногда пластмассы или толстой алюминиевой фольги, на которую нанесен тонкий слой сорбента толщиной примерно 0,25 мм (рис. 1, а). Сорбентом обычно служит либо силикагель, либо оксид алюминия с размером частиц до 10 - 30 мкм, к которым добавлено связующее ( до 10% гипса или крахмала), обеспечивающее прочность слоя. Пластинки бывают двух основных типов: многоразового использования и одноразовые.

Пластинки многоразового использования изготавливают из толстого стекла, на которое при помощи специального оборудования наносят сорбент, а затем после использования пластинки счищают его для повторного покрытия. Пластинки бывают разных размеров от 20 Х 5 см до дешевых пластинок, сделанных из микроскопных стекол ( 75 Х 25 мм), пригодных для контроля реакций. В учебных лабораториях обычно используют пластинки с заранее нанесенным слоем.

Одноразовые пластинки поставляются различными изготовителями с готовым слоем сорбента, нанесенным на основу из тонкого стекла, пластмассовую пластинку или алюминиевую фольгу. Особенно удобны пластинки последних двух типов, так как большие листы легко разрезать ножницами на полоски нужного размера.

Одноразовые пластинки дают лучшее разрешение, чем пластинки многоразового использования. Причем для большинства разделений вполне достаточна пластинка высотой 5 см. При работе с ними отрезают полоску размером 5 Х 20 см, проводят карандашом слабую линию на расстоянии 5 мм от длинной нижней кромки, чтобы указать, уда наносить капли образца, и затем нарезают куски соответствующего размера.

Готовые пластинки имеют определенную активность, обычно от II до III степени; их следует хранить над силикагелем.

2.3 Нанесение образца

Образец обычно наносят с помощью капилляра в виде 1 - 2%-ного раствора в летучем растворителе типа дихлорметана или эфира (избегайте полярных растворителей, например этанола); раствор удобнее всего готовить в маленьком пузырьке. Капилляр для нанесения капель легко сделать из капилляра для определения температуры плавления; для этого среднюю часть капилляра помещают в пламя горелки, а затем осторожно растягивают и ломают в месте растяжения.

Место нанесения капель в зависимости от размера пластинки должно быть на расстоянии 1 см от нижнего края на больших (5 Х 20 см) пластинках и около 5 мм на маленьких одноразовых пластинках. Важно также наносить капли достаточно далеко от нижнего края (рис. 1,б и в), чтобы они не погружались в проявляющий растворитель.

2.4 Проявление хроматограммы

Хроматограмму проявляют погружением нижнего края пластинки в проявляющий растворитель в сосуде соответствующего размера (рис. 1, в). Большие пластинки проявляют в специальных камерах (20 Х 5 см), а маленькие - в широкогорлых бутылях с завинчивающимися крышками. Камеру изнутри следует частично выложить фильтровальной бумагой, которая погружалась бы в растворитель, чтобы создать атмосферу, насыщенную парами растворителя, и свести к минимуму испарение с пластинки. При проявлении хроматограммы сначала залейте в банку столько растворителя, чтобы пятно образца оказалось над его поверхностью, а затем опустите в банку пластинку, стараясь расположить ее вертикально.

Это легко проделать с большими пластинками, но с маленькими легкими одно разовыми пластинками необходимо обращаться с большей осторожностью, используя щипцы или пинцет, для опускания и вынимания их из камеры. На время проявления камера должна оставаться закрытой. Когда фронт растворителя поднимется почти до верха пластинки, выньте ее из камеры и сразу же карандашом или шпателем отметьте положение фронта растворителя. Высушите пластинку в вытяжном шкафу.

2.5 Просмотр хроматограммы

Если соединения в образце окрашены, то после проявления их легко различить визуально, однако для бесцветных соединений требуется какой-либо метод визуализации.

Наиболее употребительный метод - введение в слой сорбента неорганического флуоресцентного агента (0,5 %). В продаже имеются такие одноразовые пластинки. При освещении такой пластинки УФ-лампой (254 нм) сорбент начинает светиться бледно-зелёным или голубым светом, а органические соединения, которые гасят флуоресценцию, выделяются в виде темных пятен.

Еще один распространенный метод состоит в использовании склянки с иодом. (В качестве склянки можно использовать эксикатор или другую емкость с плотно притертой крышкой). Она представляет собой емкость такого же размера, как и камера для проявления, куда помещено несколько кристалликов иода.

Если сухую проявленную пластинку поместить в камеру на несколько минут, пары иода растворяются в органических пятнах, окрашивая их в коричневый цвет, до тех пор, пока вся пластинка не потемнеет.

Какой бы метод не использовался для визуализации, положение пятен для проведения дальнейших измерений необходимо пометить карандашом или шпателем .

Необходимо отметить, что, хотя описанные выше методы в целом довольно эффективны, одни соединения «проявляются» сильнее, другие слабее, а некоторые иногда не видны совсем. Поэтому не принимайте относительную яркость пятен даже в качестве грубой характеристики относительных концентраций в смеси.

Имеется целый ряд реагентов, нанесение которых из пульверизатора на пластинку после проявления хроматограммы, окрашивает соединения определенных классов в различные цвета.

2.6 Использование ТСХ в качественном анализе

При конкретном наборе условий (сорбент и растворитель) характеристикой соединения является значение R_f. Таким образом, идентичность значения R_f “подлинного” образца (вещества сравнения) дает полное основание считать, что они одинаковы (см. предостережение ниже). Поскольку сорбенты различны, а состав смеси растворителей трудно воспроизвести точно, необходимо доказать, что значения R_f одинаковы. Для этого хроматографируют смесь и вещество, сравнивая рядом друг с другом на одной и той же пластинке, или добавляют небольшое количество вещества сравнения к отдельной пробе смеси, чтобы удостовериться в точном совпадении пятен.

2.7 Выбор проявляющего растворителя (подвижной фазы)

Высота, на которую поднимается по пластинке пятно соединения, зависит от сродства последнего к сорбенту и силы (полярности) проявляющего растворителя (см. табл.1).

Полярные соединения (спирты, кетоны и.т.п.) сорбируются сильно и поэтому плохо продвигаются при использовании слабых проявляющих растворителей типа гексана, тогда как неполярный углеводород типа нафталина хорошо поднимается по пластинке. Наилучший растворитель приходится находить методом проб и ошибок. Силу растворителя легче всего регулировать, используя смеси сильного и слабого растворителей. Обычно начинают с 1:1-смеси эфира (сильный растворитель) с гексаном или (60 / 80 петролейным эфиром) (слабый растворитель) и затем соответственно меняют соотношение. Очевидно, что, если чистый эфир не способен поднять «пятна» вверх по пластинке, необходимо перейти к более «сильному» растворителю. (Табл. 1)

Таблица 1. Сила некоторых растворителей для хроматографии^*

^* Приведены значения для хроматографирования на оксиде алюминия, но аналогичный порядок наблюдается и для силикагеля.

В случаях когда разделению препятствует сильное перекрывание двух пятен, даже если они хорошо поднимаются по пластинке (R_f 0,6 - 0,9), можно попытаться улучшить разделение двумя путями: 1) изменением химической природы проявляющего растворителя при сохранении его силы ( это изменит значение k' - коэффициент распределения и следовательно, б - коэффициент разделения - или 2) изменением природы неподвижной фазы, например заменой оксида алюминия на силикагель и наоборот. На практике при наличии разных пластинок последний путь часто является более эффективным и быстрым.

В случаях, когда смесь содержит несколько полярных и неполярных соединений, может потребоваться двукратное проявление. Сначала смесь проявляют в слабом растворителе для отделения неполярных соединений (полярные остаются на старте), а затем в более сильном растворителе для отделения полярных соединений (неполярные при этом сходятся вместе у фронта растворителя).

2.8 Препаративная тонкослойная хроматография

Препаративная ТСХ представляет собой пропорционально увеличенный вид аналитической ТСХ, позволяющий проводить разделение в препаративном масштабе. Используемые в ней пластинки (рис. 2) больше, чем аналитические (обычно 20 Х 20 см), и покрыты более толстым слоем сорбента (толщиной 0,5 или 1 мм). Пластинка такого размера пригодна для разделения до 100-150 мг в смеси в зависимости от трудности разделения.

Рис.2. Препаративная химия

Раствор образца наносится в виде полосы вдоль нижней кромки пластинки. Его можно наносить в виде перекрывающихся капель (с помощью пипетки или шприца) или в виде непрерывной линии (с помощью усечённой пастеровской пипетки с ватным тампоном) (рис. 3)

Рис. 3. Нанесение раствора образца на пластинку для препаративной ТСХ.

В обоих методах нанесения требуется направляющее приспособление, приподнятое над поверхностью сорбента. Для нанесения узкой однородной полосы необходима особая тщательность. Если предстоит большой объем работы по препаративной ТСХ, то желательно пользоваться механическим приспособлением для нанесения полос. Оно имеет каретку для перемещения шприца вдоль пластинки, которая автоматически распределяет раствор по ходу передвижения. Чтобы получить узкую полоску, лучше всего нанести несколько тонких полосок одна поверх другой, давая каждой высохнуть перед нанесением последующей.

После проявления пластинки компоненты обычно обнаруживают УФ-методом. Реагенты для опрыскивания и иод разрушили бы образец, поэтому отмечают движение полос, затем соскребают сорбент с пластинки.

Затем соединения извлекают, помещая соскобленный сорбент в стеклянную воронку Шота и добавляя соответствующий растворитель, обычно дихлорметан или этилацетат в зависимости от полярности соединения.

3. Хроматография на бумаге

3.1 ”Бумажная” хроматография

При бумажной хроматографии неподвижной жидкой фазой служит вода, адсорбируемая волокнами бумаги в количестве до 20%, ил другой полярный растворитель; в качестве подвижной фазы чаще всего применяют бутиловый спирт, коллидин, фенол, крезолы. Носителем служит хорошая фильтрованная бумага, достаточно однородная по толщине и плотности.

Для разделения смеси способом бумажной хроматографии каплю исследуемого раствора наносят на полоску фильтрованной бумаги шириной 15-20 мм и длиной 300-500 мм на расстоянии 20-30 мм от конца. Конец полоски погружают в соответствующий органический растворитель, предварительно насыщенной водой, а весь прибор помещают в герметическую камеру, атмосфера в которой насыщена парами органического растворителя и воды. Движение растворителя вдоль полоски бумаги, происходящее вследствие капиллярных сил, обеспечивает проявление хроматограммы, причем отдельные зоны перемещаются с различной скоростью.

3.2 Двумерная хроматография на бумаге

Еще более точные результаты получаются при помощи так называемой двухмерной хроматографии на бумаге. Для этого варианта применяют не полоски фильтрованной бумаги, а прямоугольники размером примерно 400Х500 мм. Каплю исследуемого раствора наносят вблизи одной из вершин прямоугольника, а Хроматограмму проявляют дважды различными растворителями, например фенолом и коллидином, сперва одним растворителем, а затем, после поворота на 90^?, -другим.

3.3 Методы проявления хроматограмм

Восходящая хроматография. Бумага погружается нижним концом в подвижную фазу. Подъём жидкости происходит под действием капиллярных сил.

Рис.4. Восходящая хроматография.

«+» Прибор прост, возможна количественная оценка результатов;

«-» Сила тяжести и капиллярные силы действуют в противоположных направлениях; скорость всасывания после подъема до 20 см сильно падает. Применима для веществ, имеющих достаточно большие различия в значениях R_f

Нисходящая хроматография. Бумага погружается в подвижную фазу верхним концом. Стекание жидкости происходит под действием силы тяжести.

«+» - быстрое прохождение подвижной фазы; отсутствие ограничения длины пробега пятен (проточная хроматограмма); возможно разделение веществ с незначительно отличающимися значениями R_f и количественная оценка результатов.

«-» - Прибор сложнее, чем для восходящей хроматографии.

Рис. 5. Нисходящая хроматография

Радиально-горизонтальная хроматография. Подвижная фаза непрерывно наносится в центр круглого листа бумаги.

Рис.6. Радиально-горизонтальная хроматография.

«+» - Быстрое выполнение, зоны узки и резко очерчены; большая полнота разделения, чем для первых методов.

«-» - Возможна только качественная оценка результатов; применение «свидетелей» возможно только лишь при так называемом «секретном методе» (т.е. при делении бумаги на секторы).

Примечание: R_f (ratio of fronts - отношение фронтов)

Расстояние от точки старта до середины пятна вещества

Расстояние, пройденное фронтом растворителя от точки старта

3.4 Приготовление подвижной фазы

Ниже описан простейший случай хроматографии на бумаге - восходящая хроматография с водой в качестве восходящей фазы.

Компоненты выбранной системы растворителей смешивают в указанном соотношении в делительной воронке. Две несмешивающиеся фазы доводят при помощи встряхивания до взаимного насыщения; в качестве подвижной фазы выступает органическая.

3.5 Нанесение вещества

Из бумаги определенного сорта вырезают полоску, размер которой соответствует размерам применяемого для хроматографии цилиндра. На расстоянии 3 см от нижнего края карандашом наносят маркировочную линию. На этой линии через 2 - 2,5 см друг от друга и от краев полоски помечают точки старта. Специальной пипеткой наносят каждую точку старта; при этом образуются пятна около 1 см в диаметре. Затем растворителю дают испариться.

3.6 Проявление

На дно цилиндра наливают подвижную фазу и подвешивают полоску бумаги. Оставляют ее так висеть в течение ночи, а затем нижний край полоски погружают на 0,5 см в подвижную фазу. После того как растворитель поднимется на 20 - 25 см, полоску вынимают, отмечают карандашом положение фронта растворителя и Хроматограмму высушивают.

3.7 Обработка хроматограммы

Если пятна на хроматограмме не окрашены и не флуоресцируют в ультрафиолетовом свете, Хроматограмму опрыскивают подходящими реактивами, дающими окрашивание с соответствующими компонентами при помощи пульверизатора.

4.Область применения и оборудования

Область применения

1. Анализ смесей жидких или твердых веществ, различающихся по R_f.

2. Анализ реакционных смесей, мониторинг протекания химических реакций.

3. Мониторинг проведения колоночной хроматографии и контроль чистоты отбираемых фракций.

4. Определение чистоты конечного продукта.

Типичный прибор для проведения ТСХ анализа приведен на рисунке:

1.Капилляр. Представляет собой стеклянную трубку с внутренним диаметром 0.3-1.0 мм, вытянутую в пламени (см. Видеоурок по вытягиванию капилляра, Важно! Оба конца капилляра должны быть открыты). Края капилляра должны быть ровными, чтобы не царапать слой сорбента и при легком прикосновении переносить раствор вещества на пластину. Важно! Чем уже капилляр, тем легче получить небольшое пятно вещества на пластине. В качестве капилляра также удобно использовать насадки для пипетмана (см. фото выше).

1. Ёмкость для ТСХ. Химический стакан с плоским дном, на дно которого наливается элюент слоем 4-6 мм. Для воспроизводимых результатов дно и стенки емкости выкладываются фильтровальной бумагой, которая пропитывается элюентом. Емкость закрывается крышкой (или чашкой Петри, часовым стеклом) для избежания испарения элюента.

2. Элюент.

o Требования к элюенту (см. Подбор элюента и сорбента для тонкослойной (ТСХ) и колоночной (КХ) хроматографии).

1. Выделяемые вещества не должны взаимодействовать с элюентом или разрушаться в его присутствии. Пример: гидролиз эпоксидов или ацеталей водой на силикагеле.

2. Элюент может быть или индивидуальным растворителем или смесью нескольких растворителей. Растворители должны легко удаляться после проведения анализа (поэтому диметилсульфоксид (ДМСО) или диметилформамид (ДМФА) не подходят из-за высокой температуры кипения).

3. Элюент подбирают таким образом, чтобы пятно целевого вещества выходило с Rf не более 0.5-0.6 после одного прогона хроматограммы и было хорошо дифференцировано от примесей (~0.1 R_f). Если на старте остались еще вещества (R_f = 0, "сидят на старте"), следует сменить элюент и проанализировать состав этой смеси. Иногда целевое вещество может "сидеть на старте".

4. Если под действием растворителей различной полярности (полярных (метанол, возможно с добавлением уксусной кислоты или триэтиламина) и неполярных (гексан, пентан)) вещество не сдвигается со старта или двигается с фронтом, следует перейти к другому сорбенту. Пример: R_f = 0, так ведут себя высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на силикагеле; или неполярные вещества на сорбентах с обращенной фазой. Пример: R_f = 1, так ведут себя неполярные вещества на силикагеле; или высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на сорбентах с обращенной фазой. Ряд растворителей по полярности см. здесь.

o Количество элюента. Элюент наливается в емкость до образования слоя 4-6 мм. Важно! Пластину погружают в элюент так, чтобы пятна веществ не соприкасались непосредственно с элюентом, иначе произойдет вымывание веществ в элюирующую смесь.

3. Сорбент. Выбирается исходя из свойств разделяемой смеси.

o Требования к сорбенту.

1. Разделяемые вещества не должны разрушаться в присутствии сорбента. Пример: разделение и очистка ацеталей на силикагеле (у него кислая реакция) практически невозможна из-за их разрушения. В то время как на нейтральном Al₂O₃ их удается эффективно разделить. См. также как с помощью ТСХ определить разлагается ли вещество на данном сорбенте.

2. Если под действием растворителей различной полярности (полярных (метанол, возможно с добавлением уксусной кислоты или триэтиламина) и неполярных (гексан, пентан)) вещество не сдвигается со старта или двигается с фронтом, следует перейти к другому сорбенту (от полярного сорбента к неполярному и наоборот). Пример 1: R_f = 0, так ведут себя высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на силикагеле; или неполярные вещества на сорбентах с обращенной фазой. Пример 2: R_f = 1, так ведут себя неполярные вещества на силикагеле; или высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на сорбентах с обращенной фазой.

4. Пластина.

o Ширина пластины определяется: по 5 мм от краев пластины, и 4-6 мм расстояние между пятнами. Длина пластины: от 5 см (для хорошо разделяющихся веществ) до 10 см или более (для сложных смесей).

o Линия "старта" проводится карандашом на расстоянии 5-7 мм от нижнего края пластины, с этого же края отрезаются уголки (~2 мм) для того, чтобы фронт элюента шел по пластине ровным слоем.

o Вещество наносится на пластину в виде раствора с достаточно небольшой концентрацией (иначе возможна "перегрузка пластины", т.е. вещества будут выходить длинной растянутой линией, не разделяясь) при помощи капилляра. Диаметр пятен 3-5 мм. При мелких пятнах <2 мм вещество на пластине сильно концентрировано, в результате - плохое разделение. При больших пятная >6 мм - вещество сильно размывается при элюировании затрудняя дифференциацию пятен.

o При анализе фракций колоночной хроматографии. Пятна нумеруют. Если все фракции не помещаются на одну пластину, то последняя фракция с предыдущей пластины также наносится на текущую пластину - для сравнения. Пример: на 1 пластине наносят фракции с 1 по 10, на второй с 10 по 19, на третьей с 19 по 28 и т.д.

Линия "финиша" проводится карандашом после окончания элюирования на расстоянии 3-5 мм от верхнего края пластины. Важно! Для воспроизводимых результатов фронт элюента не должен достигать края пластины. Типичную ТСХ пластину после проведения анализа и проявления пятен можно посмотреть ниже:

5. Обнаружение пятен.

Большинство органических соединений не окрашены, т.о. не удается визуально определить положение пятен на пластине. Поэтому, после проведения ТСХ анализа требуется проявить пятна в ультрафиолетовом свете (УФ), йоде (I₂) или под действием специальных реагентов. Подробнее читайте в разделе Обнаружение веществ при тонкослойной (ТСХ) и колоночной (КХ) хроматографии.

• Библиографический список
• 1. Берлин А. Я. «Техника лабораторной работы в органической химии» - М. : ГХИ, 1952

2. Горелик Д.О., Конопелько Л.А., Панков Э.Д. Экологический мониторинг. В 2 т. СПб.: Крисмас, 2002. - 457с.

3. Кибардин С. А., К.А.Макаров «Тонкослойная хроматография в органической химии» - М. : Химия, 1978

4. Морозов А.А. Хроматография в неорганическом анализе. М.: Высш. шк., 1972. - 233 с.

5. Назаркина С.Г. Определение полиароматических углеводородов в объектах окружающей среды методами жидкостной и тонкослойной хроматографии.

6. Органикум; Практикум по органической химии : пер. с нем. / Г. Беккер, В. Бергер, Г. Домшке и др. -- М. : Мир, 1979

7. Скуг Д., Уэст Д. Основы аналитической химии / Пер. с англ. В 2 т. М.: Мир, 1979. - 324с.

8. Хроматографический анализ окружающей среды. / Под ред. Р.Гроба. М.: Мир, 1979. - 606 с.

9. Шарп Дж., И. Госни, А. Роули «Практикум по органической химии» - М. :Мир, 1993

Размещено на Allbest.ru